一种去膜活体鱼卵的批量制备方法

1.本发明属于胚胎卵膜去除技术领域，具体涉及一种去膜活体鱼卵的批量制备方法。


背景技术：

2.原位杂交技术是指在一定的温度和离子浓度下，以具有已知序列的核酸为探针与组织细胞内待测的核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。对于整胚原位杂交技术，去除胚胎外卵膜的同时保持胚体结构的完整性是该技术的重要关键环节。去除卵膜能够增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，进而提高杂交信号；保持完整的胚体结构，如分裂球、眼囊、体节、尾芽、卵黄囊等结构，能够全面分析特定核酸在胚胎中分布的精确位置，进而达到预期实验效果。
3.硬骨鱼类卵膜是鱼卵最外端具有一定厚度的复杂多层蛋白质壳。自鱼卵排出母体受精直至孵化前胚胎成型关键阶段，卵膜和卵周液各自独立或相互结合组成统一屏障保护胚胎正常发育。卵膜可保护鱼卵，防止扭曲和变形；卵分泌物质可聚集在卵子周围增加保护作用，以免细菌、病毒的侵害；卵膜表面壁孔可供鱼卵营养物质吸收和代谢物排出，此外亦提供呼吸作用。当硬骨鱼类发育到特定阶段，胚胎必须从这种膜的包围中解脱出来，才能进一步生长和发育，这种脱出称为孵化。孵化是由囊内生活状态转变为自由生活状态，因此，孵化对鱼类的个体发育具有重要意义。在鱼类和两栖动物中，孵化都是借助于孵化酶来完成的。孵化酶是胚胎中孵化腺细胞所分泌的特异性酶，能水解卵壳内层蛋白的特定肽键，使卵壳破裂降解、胚胎顺利出膜，而蛋白酶也可起到类似的作用。一般发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织。不过酶在用量（浓度）及孵育时间上应慎为掌握，过少达不到或不能达到快速去膜的目的，而过多可能会同时消化部分胚体组织，影响胚胎结构的完整性，因此必须探索蛋白酶合理的用量与孵育时间。
4.在原位杂交实验中，也有用镊子手工逐个剥除卵膜的报道，不过该操作耗时费力，对操作者剥膜技术要求甚高；且尖镊极易损坏胚体、造成样本的浪费；另外，此时的胚胎一般都经过试剂处理，操作者剥膜时会暴露在试剂中影响其身体健康，因此，这种去膜方式亟待改进或替换。而用蛋白酶消化卵膜，只要把握好使用蛋白酶的浓度与作用时间，完全可以避免以上问题，从而达到快速去除卵膜又保持胚体完整的目的。
5.为了便于核酸探针进入胚胎内部与待测核酸相结合，整胚原位杂交技术在应用时需要将鱼卵的外膜去掉；同时，为了精确定位待测核酸的具体位置，胚胎在去膜后仍需保持完整状态，以防止胚胎因变形或破损而影响检测结果。鉴于手工剥膜方法存在的诸多局限性，采用蛋白酶批量消化鱼卵外膜的方法优势明显，然而使用蛋白酶的浓度和消化时间不容易把握，且外膜破损后很容易伤及胚体，尤其是对于发育早期比较“脆弱”的胚胎。因此，需要建立一种快速去膜活体鱼卵的批量制备方法，以便于开展整胚原位杂交或需要完整胚胎特别是活体胚胎的细胞学与发育学相关研究。


技术实现要素：

6.针对常规手工剥膜方法在鱼类胚胎去膜中存在的不足以及蛋白酶消化去膜方法存在的待解决问题，本发明提供了一种去膜活体鱼卵的批量制备方法，该方法能够满足整胚原位杂交或细胞学与发育学相关研究需要。
7.本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种去膜活体鱼卵的批量制备方法，其特征在于具体过程为：步骤s1，蛋白酶k消化：将不同发育阶段鱼卵置于蛋白酶k溶液中进行室温消化；步骤s2，置换消化液：用蒸馏水置换蛋白酶k溶液并于室温静置待用；步骤s3，3d摆床摇洗去膜：用3d摆床振荡摇洗步骤s2中的鱼卵直至鱼卵卵膜完全破碎脱落；步骤s4，胚胎收集：吸去卵膜碎片，用蒸馏水清洗鱼卵后得到洁净、完整且仍保持活力的去膜鱼卵。
8.进一步限定，步骤s1中所述蛋白酶k溶液浓度为10mg/ml，室温消化时间为3-7min。
9.进一步限定，步骤s2中室温静置时间为1-2min。
10.进一步限定，步骤s3中所述3d摆床振荡摇洗时间为3-15min。
11.本发明所述的去膜活体鱼卵的批量制备方法，其特征在于具体步骤为：步骤s1，蛋白酶k消化：将不同发育阶段鱼卵吸入离心管中，去掉孵化水后用蒸馏水清洗干净，吸去蒸馏水，加入浓度为10mg/ml的蛋白酶k溶液完全浸没胚胎并于室温消化3-7min；步骤s2，置换消化液：吸去蛋白酶k溶液，将鱼卵置于蒸馏水中，室温静置1-2min；步骤s3，3d摆床摇洗去膜：将盛有鱼卵的离心管置于3d摆床上，振荡摇洗3-15min直至鱼卵卵膜完全破碎脱落；步骤s4，胚胎收集：吸去卵膜碎片，用蒸馏水清洗胚胎，吸去洗液和残渣，得到洁净、完整且仍保持活力的去膜鱼卵。
12.进一步限定，步骤s1中发育阶段1细胞期至肌肉效应期胚胎消化5-7min，发育阶段心跳期至出膜前期胚胎消化3-5min，消化程度为大部分胚胎外膜出现明显凹陷、似将破损。
13.进一步限定，步骤s3中发育阶段1细胞期至尾芽期胚胎振荡摇洗10-15min，发育阶段肌肉效应期胚胎振荡摇洗3-5min，发育阶段心跳期至出膜前期胚胎振荡摇洗5-10min。
14.与常用的胚胎去膜操作方法相比，本发明的优点如下：1.本发明的去膜方法可以进行任意发育阶段鱼卵的批量去膜，省却繁琐耗时的手动剥膜步骤，简单省时；2.本发明的去膜方法得到的胚胎胚体完整、洁净，成活率高，便于开展整胚原位杂交或细胞学与发育学相关研究；3.本发明的去膜方法应用范围广泛，采用该方法对胚胎出膜之前的1细胞期、多细胞期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、胚孔封闭期、眼囊期、尾芽期、肌肉效应期、心跳期和出膜前期等不同发育阶段的胚胎均可进行去膜操作；4.本发明的去膜方法对操作者专业技能要求不高，所用试剂易得、价格合理且对人体健康影响较小，便于推广应用。
附图说明
15.图1为不同处理状态囊胚期胚胎图，其中a为正常囊胚期胚胎，b为蛋白酶k消化后的囊胚期胚胎，c为3d摆床摇洗后的去膜活体囊胚期胚胎；图2为不同处理状态肌肉效应期胚胎图，其中a为正常肌肉效应期胚胎，b为经消化和摇洗后得到的去膜活体肌肉效应期胚胎；图3为不同处理状态出膜前期胚胎图，其中a为正常出膜前期胚胎，b为3d摆床摇洗3 min后的出膜前期胚胎，c为3d摆床摇洗5 min后的去膜活体出膜前期胚胎。
具体实施方式
16.以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
17.一种去膜活体鱼卵的批量制备方法，具体步骤为：步骤s1，蛋白酶k消化：将鱼卵吸入离心管中，用蒸馏水清洗干净后加入10mg/ml的蛋白酶k溶液，完全浸没胚胎，室温消化3-7min。在蛋白酶k溶液浓度固定的情况下，消化时间的长短与卵膜的厚度有关，卵膜越厚、结构越复杂，溶解卵膜所需要的消化时间越长；反之，需要的消化时间越短。一般胚胎发育早期卵膜稍薄，中期增厚，后期由于自身孵化酶的分泌又开始变薄，因此，依据胚胎发育的不同时期，1细胞期至肌肉效应期胚胎消化5-7min，心跳期至出膜前期胚胎消化3-5min；其中为了防止酶液损伤胚体，卵膜应消化至变软变凹、但不破裂的程度。
18.步骤s2，置换消化液：吸去蛋白酶k溶液，将鱼卵置于蒸馏水中，室温静置1-2min。换蒸馏水可防止蛋白酶k溶液消化过度损伤胚体；静置能让残留在卵膜上的微量蛋白酶k溶液继续作用，达到充分消化的目的。
19.步骤s3，3d摆床摇洗去膜：将盛有鱼卵的离心管置于3d摆床上，振荡摇洗3-15min直至卵膜刚好完全破碎脱落。振荡摇洗是借助机械力量物理破膜，用于蛋白酶消化的化学溶膜方式之后，既能够防止蛋白酶透过卵膜进一步损伤胚体，又能够达到最终去除卵膜的目的。振荡摇洗的时间与前期卵膜消化程度有关，消化越充分，卵膜越容易破碎，摇洗时间越短；反之，摇洗时间则越长。在上述步骤s1前期蛋白酶k溶液消化的基础上，1细胞期至尾芽期胚胎振荡摇洗10-15min，肌肉效应期胚胎振荡摇洗3-5min，心跳期至出膜前期胚胎振荡摇洗5-10min。
20.步骤s4，胚胎收集：吸去卵膜碎片，用蒸馏水清洗胚胎，吸去洗液和残渣，得到洁净、完整且仍保持活力的去膜胚胎，将得到的去膜胚胎置4%（w/v）多聚甲醛溶液中固定或孵化液中继续孵化，用于后续的整胚原位杂交或细胞学与发育学相关研究。
21.下面结合附图和实施例详述本发明。
22.实施例1黄河鲤受精后的囊胚期胚胎，用浓度为10mg/ml蛋白酶k溶液室温消化5min，换蒸馏水后用3d摆床物理振荡摇洗10min去膜，具体过程如下：步骤s1，蛋白酶k消化：将囊胚期胚胎（如图1a）吸入离心管中，蒸馏水清洗后加入10mg/ml的蛋白酶k溶液，室温消化5min。消化后的胚胎外膜变软，出现凹陷痕迹（如图1b）。
23.步骤s2，置换消化液：吸去蛋白酶k溶液，将胚胎置于蒸馏水中，室温静置2min。
24.步骤s3，3d摆床摇洗去膜：将盛有胚胎的离心管置于3d摆床上，振荡摇洗10min，至卵膜完全破碎脱落。
25.步骤s4，胚胎收集：吸去卵膜碎片，用蒸馏水清洗胚胎，吸去洗液和残渣，得到洁净、完整且仍保持活力的去膜活体囊胚期胚胎（如图1c）。由图1a、1b和1c可见：蛋白酶k溶液消化后的胚胎卵膜变软有凹陷印痕但尚未破裂，蛋白酶k的浓度与作用时间控制较好；振荡摇洗物理去膜后得到的胚胎完好无损。
26.实施例2黄河鲤受精后的肌肉效应期胚胎，用浓度为10mg/ml蛋白酶k溶液室温消化7min，换蒸馏水后用3d摆床物理振荡摇洗5min去膜，具体过程如下：步骤s1，蛋白酶k消化：将肌肉效应期胚胎（如图2a）吸入离心管中，生理盐水清洗后加入10mg/ml的蛋白酶k溶液，室温消化7min。
27.步骤s2，置换消化液：吸去蛋白酶k溶液，将胚胎置于蒸馏水中，室温静置2min。
28.步骤s3，3d摆床摇洗去膜：将盛有胚胎的离心管置于3d摆床上，振荡摇洗5min，至卵膜完全破碎脱落。
29.步骤s4，胚胎收集：吸去卵膜碎片，用蒸馏水清洗胚胎，吸去洗液和残渣，得到洁净、完整且仍保持活力的去膜肌肉效应期胚胎（如图2b）。由图2a和2b可见：本方法处理后能得到与实施例1发育阶段不同的完整的去膜活体胚胎。
30.实施例3黄河鲤受精后的出膜前期胚胎，用浓度为10mg/ml蛋白酶k溶液室温消化5min，换蒸馏水后用3d摆床物理振荡摇洗5min去膜，具体过程如下：步骤s1，蛋白酶k消化：将出膜前期胚胎（如图3a）吸入离心管中，生理盐水清洗后加入10mg/ml的蛋白酶k溶液，室温消化5min。
31.步骤s2，置换消化液：吸去蛋白酶k溶液，将胚胎置于蒸馏水中，室温静置2min。
32.步骤s3，3d摆床摇洗去膜：将盛有胚胎的离心管置于3d摆床上，振荡摇洗3min时，部分鱼卵卵膜脱落（如图3b）；振荡摇洗5min时，卵膜完全破碎脱落。
33.步骤s4，胚胎收集：吸去卵膜碎片，用蒸馏水清洗胚胎，吸去洗液和残渣，得到洁净、完整且仍保持活力的去膜出膜前期胚胎（如图3c）。由图3a、3b和3c可见：本方法处理后能得到与实施例1和实施例2发育阶段均不相同的完整的去膜活体胚胎。
34.以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。