PD-L1抑制剂和肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞联合在前列腺癌治疗中的应用的制作方法

pd-l1抑制剂和肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞联合在前列腺癌治疗中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体地，本发明涉及pd-l1抑制剂和肿瘤抗原结合肽
‑ꢀ
工程化免疫细胞联合在前列腺癌治疗中的应用。


背景技术：

2.当前肿瘤的治疗方法主要包括手术治疗、放疗、化疗和靶向药物治疗等，其中，手术治 疗为常规的手术切除肿瘤，存在难以将肿瘤细胞切除干净，容易出现术后复发等问题；放疗 和化疗在杀死肿瘤细胞的同时也会杀死正常的细胞，对患者的机体和心理上造成较大的伤害； 靶向药物治疗虽然能够减轻药物的不良反应，但是容易产生肿瘤耐药性，从而导致肿瘤复发。 随着分子生物学和肿瘤生物学的发展，肿瘤免疫疗法(cancer immunotherapy)改变了传统 的肿瘤治疗模式，已经成为肿瘤治疗的新手段，与传统肿瘤治疗手段不同的是，肿瘤免疫疗 法针对的对象主要是免疫细胞，通过抑制免疫负调控因子、增强免疫细胞对肿瘤细胞表面抗 原的识别能力等方式来激活机体免疫系统，从而实现对肿瘤细胞的清除，具有效果好、不良 反应小和防止复发等优点。
3.近年来，随着对肿瘤免疫逃逸机制的进一步了解，各种新型的肿瘤免疫疗法应运而生。 肿瘤免疫疗法分为两类：一类是免疫检查点抑制剂，另一类是细胞免疫疗法，在免疫检查点 抑制剂中，研究最广泛的免疫检查点为ctla-4和pd-l1/pd-1。ctla-4是t细胞表面受 体，作为一种免疫抑制分子，能够参与免疫抑制信号的传递，在2011年，fda批准了首个 针对免疫检查点ctla-4的抗体药物伊匹单抗(ipilimumab)；pd-1也是t细胞表面另一种 常见的免疫抑制分子，其配体pd-l1被证明在多种肿瘤细胞表面表达，表达pd-l1的肿瘤 细胞通过和t细胞表面的pd-1结合从而抑制t细胞的活化，实现肿瘤免疫逃逸。pd-l1/pd-1 抑制剂能封闭这些免疫检查点，增强t细胞杀伤肿瘤细胞的活性。目前，fda批准了 nivolumab(opdivo)、pembrolizumab(keytruda)、cemiplimab(libtayo)等pd-1单抗和 atezolizumab(tecentriq)、avelumab(bavencio)、durvalumab(imfinzi)等pd-l1单抗。
4.在细胞免疫疗法中，嵌合抗原受体修饰t细胞(chimeric antigen receptor modification t cells，car-t)和嵌合抗原受体修饰nk细胞(chimeric antigen receptor modification nk cells，car-nk)免疫疗法是目前研究进展最迅速、应用前景也较好的两种肿瘤免疫疗法。经car 修饰的t细胞或nk细胞，可以特异性地识别肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原，使效应t细 胞或nk细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高。然而，当前的car 细胞疗法依赖于特异性的肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，taa)明确的肿瘤类型， 若所述肿瘤的肿瘤相关抗原不明确或未经鉴定，则无法基于肿瘤相关抗原制备相关特异性识 别的单链抗体序列，进而也就无法构建能够有效地识别肿瘤细胞的特异性car，以及特异 性识别并杀伤肿瘤细胞的car-t或car-nk细胞，此外，单链抗体来源于常规的单抗制备 并测序获得，具有制备周期长、抗体单链化后特异性结合效率普遍较低、无法针对于抗原不 明确肿瘤等缺陷。
5.肿瘤免疫疗法虽在多种肿瘤的治疗中取得了一定的进展，但是仍存在有效率低、部分患 者存在原发性耐药等问题，为了解决上述本领域存在的技术问题，本发明的目的在于提供 pd-l1抑制剂和tabp-eic-wtn(tumor antigen binding peptide-engineering immune cell， 肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞)联合在治疗前列腺癌中的应用，两者联合对前列腺癌具 有较好的治疗效果。此外，所述wtn为本发明经噬菌体-多肽文库筛选得到的能够特异性 地结合肿瘤细胞且结合效率高的多肽。目前，尚未有研究报道将pd-l1抑制剂和 tabp-eic-wtn联合应用于肿瘤的治疗中。


技术实现要素：

6.鉴于此，为了克服本领域目前存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供pd-l1抑制剂 和肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞联合在前列腺癌治疗中的应用，经实验验证证明了所述 pd-l1抑制剂和肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞两者联合对前列腺癌具有较好的治疗效果， 显著增强了抗肿瘤作用，且显著优于单独肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞的治疗效果。
7.本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
8.本发明的第一方面提供了pd-l1抑制剂和肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞联合在制备 癌症靶向治疗药物中的应用；
9.优选地，所述癌症包括宫颈癌、精原细胞瘤、睾丸淋巴瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、 直肠癌、乳腺癌、皮肤鳞状细胞癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、甲状腺癌、膀 胱移行上皮癌、白血病、脑瘤、胃癌、腹膜癌、头颈癌、子宫内膜癌、肾癌、雌性生殖道癌、 原位癌、神经纤维瘤、骨癌、皮肤癌、胃肠道间质瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色 素瘤、胶质瘤；
10.更优选地，所述癌症为前列腺癌。
11.进一步，所述肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞中肿瘤抗原结合肽的构成为wtn多肽 区-铰链区-跨膜结构域-共刺激结构域-初级信号传导结构域或wtn多肽区-铰链区-跨膜结构 域-初级信号传导结构域；
12.优选地，所述肿瘤抗原结合肽的构成为wtn多肽区-铰链区-跨膜结构域-共刺激结构域
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初级信号传导结构域；
13.优选地，所述wtn多肽区包括多个wtn多肽的重复和多个wtn多肽的重复之间的 linker；
14.更优选地，所述wtn多肽为一种与psma特异性结合的多肽；
15.最优选地，所述wtn多肽选自以下组中的任意一种：
16.(1)如seq id no:1所示的多肽；
17.(2)在如seq id no:1所示的多肽的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6 位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位和第12位中的一个或多个位置发生取代、 缺失或添加后形成的产物；
18.(3)在如seq id no:1所示的多肽主链或侧链末端的氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑 基、胍基、吲哚基、甲硫基中的一个或多个位点进行化学修饰后形成的产物；
19.最优选地，所述wtn多肽为如seq id no:1所示的多肽；
20.最优选地，所述wtn多肽的核苷酸序列如seq id no:2所示。
21.进一步，所述肿瘤抗原结合肽的铰链区为cd8α铰链区；
22.优选地，所述cd8α铰链区的氨基酸序列如seq id no:3所示；
23.更优选地，所述cd8α铰链区的核苷酸序列如seq id no:4所示；
24.优选地，所述跨膜结构域为2b4跨膜结构域；
25.更优选地，所述2b4跨膜结构域的氨基酸序列如seq id no:5所示；
26.最优选地，所述2b4跨膜结构域的核苷酸序列如seq id no:6所示；
27.优选地，所述共刺激结构域为2b4共刺激结构域；
28.更优选地，所述2b4共刺激结构域的氨基酸序列如seq id no:7所示；
29.最优选地，所述2b4共刺激结构域的核苷酸序列如seq id no:8所示；
30.优选地，所述初级信号传导结构域为nkg2d初级信号传导结构域；
31.更优选地，所述nkg2d初级信号传导结构域的氨基酸序列如seq id no:9所示；
32.最优选地，所述nkg2d初级信号传导结构域的核苷酸序列如seq id no:10所示；
33.最优选地，所述肿瘤抗原结合肽的组成为wtn多肽区-cd8α铰链区-2b4跨膜结构域
ꢀ‑
2b4共刺激结构域-nkg2d初级信号传导结构域；
34.最优选地，所述肿瘤抗原结合肽的氨基酸序列如seq id no:11所示；
35.最优选地，所述肿瘤抗原结合肽的核苷酸序列如seq id no:12所示。
36.进一步，所述肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞包括肿瘤抗原结合肽-工程化nk细胞、 肿瘤抗原结合肽-工程化t细胞、肿瘤抗原结合肽-工程化b细胞、肿瘤抗原结合肽-工程化 巨噬细胞；
37.优选地，所述肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞为肿瘤抗原结合肽-工程化nk细胞。
38.进一步，所述pd-l1抑制剂包括atezolizumab、avelumab、durvalumab；
39.优选地，所述pd-l1抑制剂为atezolizumab。
40.在本发明的具体实施方案中，所述wtn多肽为本发明经噬菌体-多肽文库筛选得到的 能够特异性地结合肿瘤细胞(前列腺癌细胞)且结合效率高的一种新型多肽。
41.在本发明的具体实施方案中，所述pd-l1抑制剂为atezolizumab，但是本发明所述的 pd-l1抑制剂并不局限于atezolizumab，目前经fda批准的avelumab、durvalumab和正在 研究中的pd-l1抑制剂、或在将来经fda批准的pd-l1抑制剂和将来会进行相关研究的 pd-l1抑制剂均在本发明的保护范围内。
42.本发明的第二方面提供了一种用于治疗癌症的药物组合物；
43.优选地，所述癌症为前列腺癌。
44.进一步，所述药物组合物包含pd-l1抑制剂和肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞。
45.进一步，所述肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞肿瘤抗原结合肽的构成为wtn多肽区
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铰链区-跨膜结构域-共刺激结构域-初级信号传导结构域；
46.优选地，所述wtn多肽区包括多个wtn多肽的重复和多个wtn多肽的重复之间的 linker；
47.更优选地，所述wtn多肽为一种与psma特异性结合的多肽；
48.最优选地，所述wtn多肽为如seq id no:1所示的多肽；
49.最优选地，所述wtn多肽的核苷酸序列如seq id no:2所示；
50.优选地，所述铰链区为cd8α铰链区；
51.更优选地，所述cd8α铰链区的氨基酸序列如seq id no:3所示；
52.最优选地，所述cd8α铰链区的核苷酸序列如seq id no:4所示；
53.优选地，所述跨膜结构域为2b4跨膜结构域；
54.更优选地，所述2b4跨膜结构域的氨基酸序列如seq id no:5所示；
55.最优选地，所述2b4跨膜结构域的核苷酸序列如seq id no:6所示；
56.优选地，所述共刺激结构域为2b4共刺激结构域；
57.更优选地，所述2b4共刺激结构域的氨基酸序列如seq id no:7所示；
58.最优选地，所述2b4共刺激结构域的核苷酸序列如seq id no:8所示；
59.优选地，所述初级信号传导结构域为nkg2d初级信号传导结构域；
60.更优选地，所述nkg2d初级信号传导结构域的氨基酸序列如seq id no:9所示；
61.最优选地，所述nkg2d初级信号传导结构域的核苷酸序列如seq id no:10所示；
62.最优选地，所述肿瘤抗原结合肽的组成为wtn多肽区-cd8α铰链区-2b4跨膜结构域
ꢀ‑
2b4共刺激结构域-nkg2d初级信号传导结构域；
63.最优选地，所述肿瘤抗原结合肽的氨基酸序列如seq id no:11所示；
64.最优选地，所述肿瘤抗原结合肽的核苷酸序列如seq id no:12所示；
65.最优选地，所述肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞为肿瘤抗原结合肽-工程化nk细胞。
66.进一步，所述pd-l1抑制剂包括atezolizumab、avelumab、durvalumab；
67.优选地，所述pd-l1抑制剂为atezolizumab。
68.本发明的第三方面提供了一种筛选用于治疗癌症的潜在物质的方法；
69.优选地，所述癌症为前列腺癌。
70.进一步，所述方法包括如下步骤：
71.(1)提供候选物质和阳性对照物质，所述阳性对照物质为pd-l1抑制剂和肿瘤抗原结合 肽-工程化免疫细胞联合；
72.(2)在测试组中，检测所述候选物质对癌症细胞增殖、迁移、和/或侵袭的影响，并与阳 性对照组以及阴性对照组的实验结果进行比较；
73.(3)若所述候选物质对癌症细胞增殖、迁移、和/或侵袭的抑制程度显著高于阴性对照组， 且为阳性对照组的75％以上，则提示所述候选物质是治疗癌症细胞的潜在物质；
74.优选地，所述癌症为前列腺癌。
75.本发明的第四方面提供了pd-l1抑制剂和肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞联合在筛选 治疗癌症的潜在物质中的应用；
76.优选地，所述癌症为前列腺癌。
77.此外，本发明还提供了一种治疗前列腺癌患者的方法，所述方法包括给有需要的受试者 施用有效量的pd-l1抑制剂和tabp-eic-wtn、和/或本发明第二方面所述的药物组合物。
78.本发明的优点和有益效果：
79.本发明首次将pd-l1抑制剂和tabp-eic-wtn两者联合应用于前列腺癌的治疗中，
经 实验验证证明了所述pd-l1抑制剂和肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细胞两者联合对前列腺癌 具有较好的治疗效果，且显著优于单独pd-l1抑制剂或单独肿瘤抗原结合肽-工程化免疫细 胞的治疗效果。
附图说明
80.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
81.图1为多肽wtn与psma表达量较高的lncap细胞系的免疫荧光结果图；
82.图2为多肽wtn与psma表达量低的pc3细胞系的免疫荧光结果图；
83.图3为c4-2 gfp细胞与tabp-eic-wtn细胞共培养2、6、12、24小时的流式检测结果图；
84.图4为elisa测量ifn-γ分泌水平的结果图；
85.图5为不同浓度ifn-γ下c4-2细胞上pd-l1的表达量检测结果图；
86.图6为与tabp-eic-wtn细胞共培养24小时的c4-2细胞上pd-l1的表达量检测结果图；
87.图7为与c4-2细胞共培养的tabp-eic-wtn细胞的pd-l1的表达量检测结果图；
88.图8为与c4-2细胞共培养的tabp-eic-wtn细胞的pd-1的表达量检测结果图；
89.图9为不同浓度ifn-γ刺激下tabp-eic-wtn细胞的pd-l1的表达量检测结果图；
90.图10为流式细胞术图和汇总数据的结果图，其中，图中显示pd-l1在tabp-eic-wtn细 胞上的表达量，tabp-eic-wtn细胞使用普通培养基培养，及从tabp-eic-wtn c4-2细 胞共同培养12小时后获得的上清，在两种培养基培养的tabp-eic-wtn细胞中，pd-l1 表达百分比没有显著差异；
91.图11为细胞共孵育装置的示意图，其中，c4-2细胞被接种在底部，tabp-eic-wtn细胞接 种在上部区域，内部和外部空间由过滤膜分离，它允许细胞因子通过，但阻止 tabp-eic-wtn细胞与c4-2细胞直接接触；
92.图12为流式细胞术图和汇总数据的结果图；
93.图13为共培养/单独培养的tabp-eic-wtn/c4-2细胞的转录差异分析结果图，a图：共培 养的tabp-eic-wtn和单独培养的tabp-eic-wtn细胞之间失调基因的火山图，b图：共 培养的c4-2和单独培养的c4-2细胞之间失调基因的火山图；
94.图14为kegg通路富集分析结果图，a图：共培养的tabp-eic-wtn中的上调基因，b 图：共培养的tabp-eic-wtn中的下调基因，c图：共培养的c4-2细胞中的上调基因；
95.图15为流式检测结果图，a图：tabp-eic-wtn细胞上nkg2d的表达量，b图：c4-2细 胞上mica/b的表达量；
96.图16为参与pd-l1表达的信号通路上的蛋白的western blot结果图，a图：不加nkg2d 阻断剂时的检测结果图，b图：加nkg2d阻断剂时的检测结果图；
97.图17为参与pd-l1表达的信号通路上的蛋白的表达量统计结果图，a图：pd-l1，b图： p-pi3k，c图：p-akt，d图：p-mtor，e图：p-jak1，f图：p-jak2，g图：p-stat1；
98.图18为与tabp-eic-wtn共培养的c4-2 gfp细胞的生物发光强度(bli)检测结果图，a 图：检测结果图，b图：统计结果图；
99.图19为增加atezolizumab或nivolumab时tabp-eic-wtn对肿瘤细胞的抑制率结果
图，a 图：e：t＝1：1，b图：e：t＝5：1；
100.图20为加入atezolizumab或nivolumab时tabp-eic-wtn细胞的ifn-γ分泌的检测结果图；
101.图21为流式细胞术图和汇总数据结果图，a图：流式细胞术图，b图：统计结果图，其中， 图中显示由c4-2细胞诱导产生的cd107a在tabp-eic-wtn细胞上的表达情况(在加入 atezolizumab或nivolumab时)，tabp-eic-wtn细胞与c4-2细胞以1：1比例在37℃培养 条件下共孵育20小时，然后用atezolizumab(20μg/ml)或nivolumab(20μg/ml)收集和 处理tabp-eic-wtn细胞，然后进行检测；
102.图22为第7、14、21天各组小鼠肿瘤大小的检测结果图；
103.图23为加或不加共培养的cik时的肿瘤抑制情况结果图，a图：不加共培养的cik时的肿 瘤抑制情况，b图：加共培养的cik时的肿瘤抑制情况；
104.图24为肿瘤细胞免疫组化染色图，a图：染色结果图，b图：统计结果图；
105.图25为对有无共培养的cik处理的小鼠的肿瘤大小分别进行统计的统计结果图，a图：有 共培养的cik，b图：无共培养的cik；
106.图26为切除的肿瘤的实物图及肿瘤重量的统计结果图，a图：实物图，b图：统计结果；
107.图27为共培养cik中的cd3、cd8和cd56的表达量检测，a图：对照，b图：cd3，c 图：cd8，d图：cd56，e图：cd3 cd56，f图：统计结果图；
108.图28为对照组、cik治疗组和共培养cik治疗组小鼠的肿瘤生长情况结果图，a图：小鼠 肿瘤生长情况，b图：bli测量值的统计分析；
109.图29为第5、10、20天的对照组、cik治疗组和共培养cik治疗组小鼠肿瘤体积的统计结 果图；
110.图30为一位前列腺癌患者接受adt后的血清睾酮和psa水平变化曲线图，a图：血清睾 酮，b图：psa；
111.图31为前列腺癌患者肿瘤组织he染色图(100倍与200倍)，a图：100倍，b图：200 倍；
112.图32为流式细胞术图和汇总数据柱状图，a图：流式细胞术图，b图：统计结果图，c图： 统计结果图，其中，图中显示与tabp-eic-wtn细胞孵育24小时的原发性前列腺癌细胞上pd-l1的表达情况，(右)cck-8检测结果，显示atezolizumab(20μg/ml)而不是nivolumab (20μg/ml)显著增强了对tabp-eic-wtn的抑制效果，e：t＝1：1。
具体实施方式
113.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明 的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对 这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施 检测。
114.实施例1肽库筛选
115.1、实验目的
glycine-hcl(ph 2.2)，1mg/ml bsa来分离已结合的分子：温和摇动》10min，洗脱液吸入另 一干净微量离心管中，然后再用150μl(微量孔则用15μl)1m tris-hcl(ph 9.1)中和上述 洗脱液；
133.(11)按上述常规m13方法中的程序测定少量(～1μl)洗脱物的滴度，如需要，可对第 一或第二轮洗脱物滴度测定所得的噬菌斑进行测序，方法见下述：必要时可将剩余洗脱物4℃ 贮存过夜，第二天扩增，这时，可将er2738在lb-tet培养基中过夜培养，第二天将培养物 1:100稀释于20ml lb中(用250ml三角瓶盛装)，加入未扩增洗脱物，37℃剧烈摇动培养4.5 h，继续第13步；
134.(12)扩增剩余洗脱物：将洗脱物加入到20ml er2738培养物中(菌体处于对数前期)， 37℃剧烈摇动培养4.5h；
135.(13)将培养物转入一离心管中，然后，4℃10,000rpm离心10min。上清液转入另一离 心管中，再离心；
136.(14)将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的peg/nacl，让噬菌体4℃沉淀至 少60min，过夜；
137.第三天
138.(15)4℃10,000rpm离心peg沉淀15min，倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液；
139.(16)沉淀物重悬于1ml tbs中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5min使残余细胞沉 淀；
140.(17)上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的peg/nacl再沉淀，冰上孵育15-60min， 4℃离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清；
141.(18)沉淀物重悬于200μl tbs，0.02％nan3中，离心1min，沉淀任何残余的不溶物， 上清转入新鲜管中，此即为扩增后的洗脱物；
142.(19)根据上述常规m13方法用lb/iptg/xgal平板滴定扩增后的洗脱物，4℃贮存；
143.(20)再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用；
144.第四和第五天
145.(21)计数板上蓝斑数确定滴度，用这个值来计算相应于1-2
×
10
11
pfu的加入量；若滴度 太低，接下来的几轮淘选可用低至109pfu的噬菌体加入量进行试验；
146.(22)进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中1-2
×
10
11
pfu的噬菌体量重复步骤 4-18，在清洗步骤中将tween的浓度增至0.5％(v/v)；
147.(23)在lb/iptg/xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度；
148.(24)再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用；
149.第六天
150.(25)进行第三轮淘选：用第二轮淘选扩增的洗脱物中2
×
10
11
pfu的噬菌体量重复步骤4-11，清洗步骤中同样用0.5％(v/v)的tween；
151.(26)在lb/iptg/xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度，第三轮洗脱 物不必再扩增，除非还要进行第四轮淘选，滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用：只要注意 平板培养时间不要超过18h，培养时间过长容易出现缺失，其余洗脱物4℃贮存；
152.(27)挑一er2738单克隆于lb-tet培养基中培养过夜。
153.4、实验结果
154.实验结果显示，筛选得到的与psma特异性结合的多肽wtn，其氨基酸序列为 wtnhhqhskvre(seq id no:1)。
155.实施例2 wtn多肽特异性的验证
156.1、实验方法
157.将wtn多肽分别与psma表达量较高的lncap细胞系及psma表达量低的pc3细胞 系进行免疫荧光检测，所用荧光标记物为fitc(即fitc标记的wtn多肽)。
158.2、实验结果
159.wtn多肽与lncap细胞系的荧光检测如图1所示，wtn多肽与pc3细胞系的荧光检 测如图2所示；图1中圆点中心是细胞核，圆点周围的浅色是wtn与细胞表面抗原psma 结合而展现的荧光；图2中仅有细胞核的染色，可见wtn所标记的细胞表面荧光只在图1 中出现，证明了wtn与细胞表面抗原psma的结合具有很高的特异性。
160.实施例3本发明所涉及的细胞系、及其培养方法、构建方法
161.1、tabp-eic-wtn的构建方法
162.(1)制备tabp-eic-wtn细胞
163.本专利涉及实验使用到的nk细胞均为来源于外周血单核细胞(pbmc)扩增获得。
164.(2)肿瘤抗原结合肽表达载体的构建
165.肿瘤抗原结合肽结构(完整结构为：wtn多肽区-cd8α铰链区-2b4跨膜结构域-2b4 共刺激结构域-nkg2d初级信号传导结构域，核酸序列如seq id no:12所示)序列均为基 因合成获得(通用生物)，表达载体为plenti-ef1a-backbone(nn)(addgene#27961)。 肿瘤抗原结合肽结构插入酶切位点为bsiwi及ecori(即将seq id no:12所示序列替换酶 切位点bsiwi-ecori之间的序列)。插入肿瘤抗原结合肽结构后该载体称为tabp-eic-wtn 骨架载体，该载体即可表达氨基酸序列为seq id no:11的肿瘤抗原结合肽。
166.(3)慢病毒包装
167.将tabp-eic-wtn骨架载体及辅助载体pmd2.g(addgen#12259)、pmdlg/prre (addgene#12251)、prsv-rev(addgene#12253)按10:7:5:3比例混合，20μg质粒每10ml 转染体系，转染293t细胞。转染后48小时、72小时收集上清，纯化浓缩后获得慢病毒。
168.(4)慢病毒转导
169.将浓缩后的慢病毒与nk细胞按每100万细胞200μl纯化后慢病毒混合，之后置于37℃ 培养箱5％co2条件培养，24小时后完全换液。
170.(5)tabp-eic-wtn细胞的扩增：将慢病毒感染后获得的tabp-eic细胞正常培养扩增。
171.(6)tabp-eic-wtn细胞肿瘤抗原结合肽表达效率的检测：(为单克隆100％阳性)。
172.2、其他细胞系的培养方法
173.(1)c4-2细胞：表达psma的人crpc细胞系(前列腺癌细胞系)，c4-2细胞在含有 10％胎牛血清fbs(biological industries)和1％青霉素/链霉素(hyclone)的rpmi-1640培 养基(servicebio)中培养；
174.为方便观察肿瘤抑制情况，通过单细胞克隆方法建立了稳定表达gfp的c4-2细胞系以 下简称为c4-2 gfp。
175.(2)nk92细胞：人恶性非霍奇金淋巴瘤自然杀伤细胞系，nk92和tabp-eic-wtn细 胞在补充有20％fbs、0.2mm肌醇(sigma)、0.1mmβ-巯基乙醇(pan-biotech)、0.02mm 叶酸(sigma)、200u/ml的重组人il-2(sl pharm)和1％青霉素-链霉素alpha mem培 养基(gibco)中培养。
176.(3)293t细胞：人胚胎肾细胞系，来自美国典型培养物保藏中心atcc，293t细胞在 dmem培养基(hyclone)或opti-mem(gibco)中培养；
177.(4)pca细胞(前列腺癌细胞)：来自一名接受根治性前列腺切除术的crpc患者的前 列腺组织。
178.本发明所述的细胞培养均在37℃、5％co2的潮湿环境中培养。
179.实施例4与tabp-eic-wtn细胞共培养的c4-2细胞上pd-l1的表达上调依赖于ifn-γ
180.将c4-2 gfp细胞与tabp-eic-wtn细胞共同培养，在第2、6、12、24小时进行流式 检测，结果如图3所示：并且对c4-2细胞表达的pd-l1进行检测，结果如图3所示：c4-2 细胞的pd-l1的平均荧光强度(mfi)和表达pd-l1的c4-2细胞所占百分比随时间增长显 著上调。
181.对tabp-eic-wtn细胞进行培养，在有无c4-2 gfp共培养的情况下，通过elisa测 量培养基上清液中第2、6、12、24小时时间点的ifn-γ分泌水平，结果如图4所示。
182.向c4-2细胞中加入ifn-γ，并在不同浓度ifn-γ下c4-2细胞上pd-l1的表达量，结果 如图5所示：pd-l1的平均荧光强度(mfi)和表达pd-l1的c4-2细胞所占百分比都以浓 度依赖性的方式增加。
183.而在使用ifnγ阻滞剂(ifnγ单抗)的情况下，与tabp-eic-wtn细胞共培养24小时 的c4-2细胞上pd-l1的表达量检测结果如图6所示：ifnγ阻滞剂完全逆转了与 tabp-eic-wtn细胞共培养的c4-2的pd-l1的上调。
184.以上实验结果表明了与tabp-eic-wtn细胞共培养的c4-2细胞上pd-l1的表达上调 依赖于ifn-γ。
185.实施例5与c4-2细胞共培养的tabp-eic-wtn细胞上pd-l1表达的上调依赖于直接细 胞接触
186.共培养tabp-eic-wtn细胞与c4-2细胞，在第2、6、12、24小时测量tabp-eic-wtn 的pd-l1和pd-1的表达量，结果分别如图7、图8所示。结果显示：pd-l1或pd-1阳性 的tabp-eic-wtn的百分比随时间延长显著上调。
187.使用不同浓度ifn-γ刺激tabp-eic-wtn细胞，tabp-eic-wtn细胞上pd-l1的表达 量的流式检测图如图9所示。ifn-γ刺激后，tabp-eic-wtn细胞的pd-l1的表达量没有 显著变化。
188.实施例6 tabp-eic-wtn/c4-2细胞的共培养/单独培养的转录差异分析
189.使用trizol(invitrogen)从样品中提取总rna。在通过dnasei提取rna后进行dna 消化。rna质量通过使用nanodroptm onec分光光度计(thermo fisher scientific inc)检 查a260/a280来确定。rna完整性通过1.5％琼脂糖凝胶电泳确认。最终通过qubit3.0和 qubittm rna broad range assay kit(life technologies)对合格的rna进行定量。
190.使用kc-digital tm stranded mrna library prep kit for(seqhealth technologyco.，ltd.)将2μg总rna用于rna测序文库制备。对应于200-500bps的文库产物
合。然后将dc-cik混合物加入到接种含有1
×
107个c4-2贴壁细胞的t75培养瓶中，并在 5％co2的湿润环境中在37℃下共培养。
214.共培养24小时后，收获悬浮的dc-cik混合物并将其命名为“共培养cik(图上标记 为cocultured cik)”。
215.2、模型小鼠的构建及培养
216.5周龄雄性nod/scid小鼠购自北京维塔尔河实验动物技术公司，饲养于国家癌症中心 分子肿瘤学国家重点实验室无特定病原体动物设施。所有实验程序均经我院伦理委员会批准， 并按照实验动物护理原则(nih出版物第25卷，1996年修订第28期)进行。在小鼠上腹 部皮下接种悬浮在200μl pbs中的2
×
106c4-2细胞。在第7天肿瘤体积达到100-200mm3时开始治疗，将接种c4-2的小鼠随机分为七组：
217.(i)对照(control)组，
218.(ii)tabp-eic-wtn组，
219.(iii)tabp-eic-wtn nivolumab组，
220.(iv)tabp-eic-wtn atezolizumab组，
221.(v)tabp-eic-wtn 共培养的cik(cocultured cik)组，
222.(vi)tabp-eic-wtn nivolumab 共培养的cik组，
223.(vii)tabp-eic-wtn atezolizumab 共培养的cik组。
224.在肿瘤接种后第7、9、11、13、15天施用pd-l1抗体atezolizumab(glpbio，gc32704) (20mg/kg)或pd-1抗体nivolumab(glpbio，gc34218)(10mg/kg)或对照pbs尾静脉 注射共5剂，而tabp-eic-wtn治疗是在pd-l1/pd-1抗体治疗后第8、10、12、14、16 天注射5
×
106tabp-eic-wtn，用于共静脉注射5剂。
225.第17天在tabp-eic-wtn治疗的基础上静脉注射共培养cik，加或不加pd-l1/pd-1 抗体。
226.肿瘤体积计算公式：l
×
w2/2，其中l和w代表最长和最短在第7、10、14、16、18、 20天通过卡尺测量的直径。还通过使用光谱ct检测生物发光强度(bli)评估治疗 前后的肿瘤大小，如在肿瘤细胞植入后第7、14、21天所述，测量bli并表示为辐射度 (p/sec/cm2/sr)。
227.在第21天处死所有小鼠，收集肿瘤、拍照、称重并收集用于组织学检查。
228.3、实验结果
229.在第7、14、21天测量以上各组植入c4-2 gfp细胞小鼠的肿瘤大小(n＝3-4)，结果图 如图22所示。对有无共培养的cik处理的小鼠的肿瘤大小分别进行统计，在无共培养的 cik治疗的各小组的肿瘤体积统计如图25a，有共培养的cik治疗的各小组的肿瘤体积统 计如图25b。
230.切除的肿瘤的实物图如图26a所示，肿瘤重量的统计分析如图26b所示，图上数值表 示为平均值
±
sd，*代表p《0.05；ns代表无显著差异。
231.为分析共培养的cik对肿瘤的抑制作用，分别测量加或不加共培养的cik时的肿瘤抑 制情况，在第7、14、21天，对对照组、tabp-eic-wtn治疗组、tabp-eic-wtn nivolumab 治疗组、tabp-eic-wtn atezolizumab治疗组进行定量bli检测，结果如图23a。对对照 组、tabp-eic-wtn治疗组、tabp-eic-wtn 共培养cik治疗组、 tabp-eic-wtn nivolumab 共培
养cik治疗组、tabp-eic-wtn atezolizumab 共培养cik 治疗组进行定量bli检测，结果如图23b。
232.对肿瘤细胞进行免疫组化染色，坏死的组织用10％中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋， 切成4μm厚切片，苏木精伊红(he)染色进行光镜检查。坏死区在光学显微镜下被染成红 色，没有完整的细胞结构。ndp.view2查看软件(hamamatsu photonics，shizuoka，japan) 用于量化红色坏死区域相对于整个区域的百分比，大血管被排除在上述图像分析之外。结果 如图24a所示，在tabp-eic-wtn治疗组中观察到明显的肿瘤坏死，atezolizumab的加入 显著增加了tabp-eic-wtn治疗组肿瘤坏死的严重程度，统计结果如图24b所示。
233.以上实验结果表明了tabp-eic-wtn和/或atezolizumab和/或共培养的cik联合能够 有效治疗肿瘤，即tabp-eic-wtn与atezolizumab两者联合能够有效治疗肿瘤； tabp-eic-wtn与共培养的cik两者联合能够有效治疗肿瘤；tabp-eic-wtn、atezolizumab 与共培养的cik三者联合能够有效治疗肿瘤。
234.实施例10共培养cik的构成和功能鉴定
235.使用流式细胞术检测共培养cik中的cd3、cd8和cd56表达，检测中细胞用以下抗 体染色：来自bd bioscience的cd3-apc、cd8-fitc、cd56-percp；对检测结果进行统计 分析的结果如图27所示。
236.第5天和第10天对对照组、cik治疗组和共培养cik治疗组小鼠进行荧光成像检测， c4-2 gfp植入肿瘤活性的bli测量值和统计分析(n＝3)如图28所示。在第5、10、20天 进行测量并计算肿瘤体积，结果如图29所示。
237.以上实验结果表明了cik、共培养cik对肿瘤均有一定的治疗效果，本发明制备得到 的共培养cik的治疗效果更好，显著优于对照组和cik组。
238.实施例11 atezolizumab在体外增强了tabp-eic-wtn对来自一名前列腺癌患者的crpc 细胞的细胞毒性
239.随机挑选一位前列腺癌患者，记录其接受adt后的血清睾酮和psa水平，结果分别如 图30a和图30b所示，在adt后睾酮去势水平下，psa水平从2021年5月开始连续上升 超过最低点。
240.2021年5月26日，患者在全身麻醉下成功接受机器人辅助前列腺根治术(rarp)和 双侧盆腔淋巴结清扫术。部分新鲜标本在从体内取出后2小时内送至实验室进行pca细胞 (前列腺癌细胞)的原代培养。程序如下：crpc组织用无菌生理盐水冲洗数次并切成3mm 厚的片。然后这些组织片被在37℃下用0.1％胶原酶i(sigma)在alpha-mem(corning) 中消化2小时在摇动培养箱中。这些组织片用pbs洗涤3次，300g低速离心5分钟，去除 胶原酶i。用fbs(gibco)预涂10cm细胞培养皿。
241.将组织接种在不含fbs的培养皿上，在37℃下在5％co2的加湿培养箱中培养24小时， 然后加入10mlα-mem并添加10％fbs至培养皿中进行进一步的细胞培养。
242.对肿瘤切片进行he染色(
×
100)，染色结果如图31a所示，图31b为第14天原发性 前列腺癌细胞的光学显微照片(
×
200)。
243.将pca(前列腺癌细胞)与tabp-eic-wtn细胞孵育24小时，流式检测pca上pd-l1 的表达，结果如图32a和图32b所示，证明了atezolizumab增强了tabp-eic-wtn对crpc 细胞的细胞毒性。
244.cck-8测定分析加入atezolizumab/nivolumab时tabp-eic-wtn细胞对肿瘤的抑制效果 (e：t＝1：1)，统计如图32c所示，结果表明atezolizumab(20μg/ml)显著增强了 tabp-eic-wtn的抑制率(e:t＝1:1)，进一步表明了pd-l1抑制剂和tabp-eic-wtn联 合可有效治疗前列腺癌。
245.上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰， 这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。