一种利用果蝇模型筛选不孕不育相关基因的方法及其应用

1.本发明涉及果蝇模型技术领域，尤其涉及一种利用果蝇模型筛选不孕不育相关基因的方法及其应用。


背景技术：

2.不孕不育的定义是在正常、无保护的性行为至少12个月而没有成功妊娠。不孕不育是一个全球性的健康问题，大约有12-15％的育龄夫妇受到影响。不孕夫妇中，女方因素约占40-50％，男方因素占25-40％，双方共同因素占20-30％，不明原因的占约10％，具体包括输卵管因素、排卵障碍、精子生成障碍、精子运输受损、精子异常等因素。所有的这些因素都受到遗传因素的调控。
3.减数分裂是生殖细胞所特有的生物学事件，是生物有性生殖的基础。在此过程中，同源染色体的非姐妹染色单体间发生配对、联会和重组交换等，从而使配子呈现遗传多样化，增加了后代的适应性。比如精子发生的这一过程涉及多达2300个基因的协同作用，这些基因的任何变化都可能影响体内激素水平、精子发生的有丝分裂、减数分裂等过程，进而影响到精子的质变量变等。随着大规模测序策略(特别是高通量测序、全外显子组检测技术)的出现，数千个基因被报道与不孕不育有关，包括常染色体显性、隐性、x连锁、y连锁基因。据报道，大约15％的生育功能障碍者中可能存在遗传异常，包括染色体畸变和单基因突变。
4.黑腹果蝇是经典遗传学领域的无脊椎动物模型。据估计75％的已知人类疾病基因与果蝇的基因组有可识别的匹配。果蝇具有生命周期短、繁殖能力强、有许多人类致病基因的同源基因、基因重复功能比较少、细胞和组织的实验操作相对简单等特点。近年来随着高通量测序技术的发展和普及，多个不孕不育相关基因被发现，然而受限于目前缺乏研究不孕不育良性疾病的模式生物，此类研究多半停留于对疾病发生的相关分子通路机制的细胞学描述而无法进行功能、表型验证。少数研究使用了转基因小鼠对不孕不育进行研究，然而使用转基因小鼠模型具有耗时长、费用昂贵、无法进行大规模筛选等缺点。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用果蝇模型筛选不孕不育相关基因的方法及其应用。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种利用果蝇模型筛选不孕不育相关基因的方法，所述方法包括以下步骤：
7.s1.将uas-x-rnai转基因系果蝇和tub-gal4/cyo果蝇交配，利用gal4/uas系统启动对x基因的rnai降调节，挑选f1代新羽化的uas-x-rnai/tub-gal4雄性果蝇作为实验组，uas-x-rnai雄性果蝇作为对照组；
8.s2.将步骤s1得到的f1代新羽化的uas-x-rnai/tub-gal4雄性果蝇、uas-x-rnai雄性果蝇分别与野生型雌性处女蝇交配；
9.s3.观察并统计步骤s2中的实验组、对照组的子代卵、成虫数目及孵化率；
10.所述x基因为待筛选基因。
11.本发明使用的转基因rna干扰(rna interference，rnai)果蝇潜在靶向基因x的黑腹果蝇品系，本发明可通过果蝇的不孕不育的表型来进行不孕不育靶基因的筛选，具有耗时短、费用低廉、可进行大规模筛选等优点。
12.作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤s1所述挑选为通过果蝇腹部条纹、卷翅和性梳等特征进行挑选。
13.作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤s2所述野生型果蝇为野生型canton-s处女蝇/雄性果蝇。
14.作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤s2具体为：
15.(1)将步骤s1得到的f1代新羽化的uas-x-rnai/tub-gal4果蝇、uas-x-rnai果蝇以及待与之交配的野生型新羽化果蝇分开在新的培养基中饲养2～4天左右。
16.(2)然后将uas-x-rnai雄性果蝇与野生型果蝇自由交配，uas-x-rnai/tub-gal4果蝇与野生型果蝇自由交配，其中1个试管里的雌性处女蝇、雄性果蝇分别为1只、2-4只，当1只雌果蝇和1只雄果蝇交配后就将所有雄性果蝇丢弃。
17.作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤s3所述交配后的雌性果蝇有10天时间产卵，每24小时将其更换到新鲜的玉米粉培养基中，雌性果蝇在从交配开始计算的第10天后被丢弃。
18.作为本发明所述方法的优选实施方式，所述方法还包括步骤s4：若与对照组相比，与实验组交配后的雌性果蝇在一段时间内的产卵量、子代成虫数或孵化率下降，则所述x基因为不孕不育相关基因。
19.作为本发明所述方法的优选实施方式，所述果蝇的培养温度为24～26℃。
20.本发明同时提供所述方法在筛选不孕不育相关基因中的应用。
21.本发明的有益效果：
22.本发明利用果蝇针对潜在导致不孕不育的基因进行表型验证，具备以下优点：
23.(1)果蝇生命周期短、繁殖能力强，是研究遗传学的一种经典模式生物；
24.(2)对维持生育、繁殖力的重要基因，多为高度保守基因，与人类对应的基因同源性高，且约75％的已知人类疾病基因与果蝇基因组有可识别的匹配；
25.(3)利用gal4/uas系统构建特定基因型果蝇的方法已成熟可行。
附图说明
26.图1为敲降x基因的果蝇构建。
27.图2a-c为敲降潜在靶向基因的果蝇的10天总子代产卵数目、成虫数目以及孵化率；x1-x3分别为潜在相关靶向基因，从图中可以看出x1基因表达降低后，其10天总子代成虫数目显著下降，提示x1基因可能为不孕不育相关基因。
具体实施方式
28.为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
29.本发明使用的转基因rna干扰(rna interference，rnai)果蝇潜在靶向基因poe的
黑腹果蝇品系。所有果蝇饲养在添加酵母的标准玉米粉培养基中(25℃
±
1℃，12：12h光暗循环)，保持良好的湿度。下面以探索其是否为不育相关基因表型为例说明具体实施方案。
30.实施例1
31.将uas-poe-rnai转基因系果蝇和tub-gal4/cyo果蝇交配，利用gal4/uas系统启动对poe基因的rnai降调节，得到雌雄各两种基因型的f1代：uas-poe-rnai/tub-gal4、uas-poe-rnai/cyo，通过果蝇腹部的条纹、卷翅和性梳等特征将新羽化的uas-poe-rnai/tub-gal4的雄性果蝇挑选出来作为实验组，uas-poe-rnai雄性果蝇作为对照组，使用q-pcr验证poe基因表达是否下降(图2b)，结果表明uas-poe-rnai/tub-gal4的雄性果蝇的poe基因的表达明显下降。
32.使用野生型canton-s雌性果蝇为与两组雄性交配的果蝇。将上述f1代新羽化的uas-poe-rnai/tub-gal4雄性果蝇、uas-poe-rnai雄性果蝇、野生型canton-s雌性处女蝇分开在新的培养基中饲养3天左右。随后将3只对照组uas-poe-rnai雄性果蝇与1只野生型处女蝇放在同一只果蝇管中，3只敲降组uas-poe-rnai/tub-gal4雄性果蝇与1只野生型处女蝇放在同一只果蝇管中，让他们自由交配，当一只雌果蝇和一只雄果蝇交配后就将该果蝇管里的所有雄性果蝇丢弃。每组实验重复3次。
33.交配后的雌性果蝇有10天时间来进行产卵，每24小时将其更换到带有新鲜的玉米粉培养基的新果蝇塑料试管中。雌性在从交配开始计算的第10天后被丢弃。对每组果蝇的10天总的产卵量、子代成虫数、孵化率进行统计，其中成虫与卵的百分比即孵化率。每组重复3次。比较分别与实验组或对照组交配后的雌性果蝇在产卵量、子代成虫数、孵化率方面的差异，p＜0.05认为有统计学意义。结果如表1、图2c所示，表明poe基因与雄性果蝇的繁殖能力相关，可能为不育相关基因。
34.表1
[0035] 实验组对照组总产卵量(个)133/125/12364/59/57子代成虫数(只)100/93/9840/35/33孵化率(％)75.19/74.40/79.6762.50/59.32/57.89
[0036]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。