一种单萜吲哚生物碱及其提纯方法及抗耐药菌的应用

1.本发明涉及一种单萜吲哚生物碱白坚木辛碱，尤其涉及一种白坚木辛碱及其提纯方法及抗耐药菌的应用。


背景技术：

2.由致病微生物引起的感染性疾病严重威胁着人类的健康。目前，致病菌病原体感染的主要防治手段是使用抗生素和化学合成抗菌药物。人类应用抗生素和合成抗菌药物有效地治愈了各类严重的细菌感染性疾病，卓有成效地降低了各种严重的由病原菌感染引起的死亡率。但是近年来，随着病原菌的进化，多种菌株产生耐药性，抗生素的剂量越用越大，效果却越来越差，甚至逐渐丧失疗效。
3.临床所用有效的抗菌药物都有可能出现耐药菌株，而且不少致病菌还会对多种抗菌药物呈现耐药性，即多重耐药性。致病菌耐药性的发生和蔓延已构成对人类健康的严重威胁。抗生素的广泛使用还引发了许多严重的不良反应，如氨基类抗生素造成儿童听神经受损，成为引发后天性耳聋的主要原因；庆大霉素、多粘菌素长期应用所致肾损害，甚至导致肾功能衰竭。这些不良反应引起的安全问题以及耐药性的发生发展引起了社会的高度关注，人们迫切需要找到更加安全高效的抗菌药物。
4.植物药材作为天然药物的来源，我国具有丰富的天然药物资源，对植物药进行化学成分研究与探索不仅为民间直接利用天然植物资源防病治病提供理论依据，同时也为现代化药物研发和药物合成提供了先导化合物。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种单萜吲哚生物碱白坚木辛碱及其提纯方法及应用，旨在解决所述背景技术中存在的问题。为实现所述目的，本发明采用的技术方案是：
6.一种单萜吲哚生物碱白坚木辛碱，分子式c
18h20
n2，其结构式如下：
[0007][0008]
上述一种单萜吲哚生物碱白坚木辛碱的提取纯化方法，所述方法包括以下步骤：
[0009]
s1：取夹竹桃科狗牙花属伞房狗牙花进行干燥；
[0010]
s2：将干燥的伞房狗牙花木质部粉碎，用90％的甲醇回流提取，浓缩提取液得到总提取物；
[0011]
s3：将所述总提取物用ph＝2-3的盐酸溶解，过滤弃去滤渣，得到滤液；
[0012]
s4：将所述滤液用氨水调解ph＝9-10，用乙酸乙酯萃取，得到生物碱总浸膏；
[0013]
s5：将所述生物碱总浸膏通过硅胶柱，用不同配比(80：1，70：1，50：1，25：1，15：1，5：1)的氯仿
–
甲醇溶液进行梯度洗脱得到7个馏分a
–
g；
[0014]
s6：取七个馏分中的组分e(15：1配比的氯仿
–
甲醇溶液洗脱得到)进一步通过硅胶柱进行梯度洗脱，反相rp-18柱，sephadexlh-20以及制备薄层色谱板(氯仿：甲醇＝10：1，v/v)纯化得到目标化合物。
[0015]
进一步的，所述s6中进行梯度洗脱的配比为氯仿：丙酮＝20：1，10：1，8：1，5：1，3：1，2：1；选取2:1的馏分再通过反相柱rp-18。
[0016]
一种单萜吲哚生物碱白坚木辛碱在抗细菌及耐药菌的应用。
[0017]
本发明的有益效果：本发明发现天然来源的单萜吲哚生物碱白坚木辛碱具有广谱抗菌作用。细菌包括金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，枯草杆菌，阴沟肠杆菌，铜绿假单胞菌，停乳链球菌；耐药菌包括产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌耐药菌和非产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌耐药菌。
附图说明
[0018]
图1为本发明单萜吲哚生物碱白坚木辛碱对不同细菌的最低抑菌浓度。
具体实施方式
[0019]
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
[0020]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0021]
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
[0022]
实施例一：单萜吲哚生物碱白坚木辛碱的提取与纯化制备方法。
[0023]
(1)干燥的伞房狗牙花木质部20kg，粉碎，用65升90％的工业甲醇回流提取3次，合并提取液。
[0024]
(2)浓缩提取液，用ph＝2-3的盐酸溶解，弃去滤渣。
[0025]
(3)将滤液用氨水调解ph＝9-10，再用相当于滤液0.3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，合并提取液，得到总生物碱。
[0026]
(4)生物碱总浸膏通过硅胶柱，分别用甲醇：氯仿＝80：1，70：1，50：1，25：1，15：1，5：1梯度洗脱，减压浓缩，得到7个馏分a
–
g。
[0027]
(5)选取15：1馏分(e)进行硅胶柱色谱分离，分别用氯仿：丙酮＝20：1，10：1，8：1，5：1，3：1，2：1洗脱。选取2：1的馏分再通过反相柱rp-18(20-80％甲醇梯度洗脱)和凝胶柱sephadexlh-20进一步纯化，最后再用制备薄层色谱板(氯仿：甲醇＝10：1，v/v)纯化得到目标生物碱即白坚木辛碱。其分子式c
18h20
n2，其结构式如下：
[0028][0029]
通过核磁共振得到：
[0030]1h-nmr，
13
c-nmr以及esi-ms参数如下：
[0031]1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.87(s，1h，n-h)，
[0032]
7.42(d，j＝8.0hz，1h，h-9)，
[0033]
7.28(d，j＝8.0hz，1h，h-12)，
[0034]
7.19(m，1h，h-11)，
[0035]
7.06(td，j＝8.0，1.1hz，1h，h-10)，
[0036]
5.39(s，1h，h-22a)，
[0037]
5.26(s，1h，h-22b)，
[0038]
5.23(m，1h，h-19)，
[0039]
4.50(d，j＝17.7hz，1h，h-6a)，
[0040]
4.26(d，j＝17.7hz，1h，h-6b)，
[0041]
3.91(s，1h，h-15)，
[0042]
3.79(d，j＝14.8hz，1h，h-21a)，
[0043]
3.40(m，1h，h-3a)，
[0044]
3.19(d，j＝14.8hz，1h，h-21b)，
[0045]
3.06(m，1h，h-3b)，
[0046]
2.16(m，1h，h-14a)，
[0047]
1.89(m，1h，h-14b)，
[0048]
1.46(dd，j＝6.8，2.4hz，-3h，h-18)。
[0049]
13
c-nmr(101mhz，cdcl3)δ145.26(s，c-16)，
[0050]
137.96(s，c-13)，
[0051]
135.63(s，c-2)，
[0052]
131.34(s，c-20)，
[0053]
129.00(s，c-8)，
[0054]
122.89(d，c-11)，
[0055]
119.86(d，c-19)，
[0056]
119.27(d，c-10)，
[0057]
118.60(d，c-9)，
[0058]
112.16(t，c-22)，
[0059]
111.26(s，c-7)，
[0060]
110.22(d，c-12)，
[0061]
54.28(t，c-6)，
[0062]
54.28(t，c-21)，
[0063]
45.32(t，c-3)，
[0064]
41.26(d，c-15)，
[0065]
29.66(t，c-14)，
[0066]
12.53(q，c-18)。
[0067]
esi-ms：m/z265.1[m h]

。
[0068]
实施例二：
[0069]
单萜吲哚生物碱白坚木辛碱的抗菌实验
[0070]
1仪器与材料
[0071]
1.1仪器：酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司；高压灭菌锅购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。
[0072]
1.2材料：肉汤液体培养基，肉汤琼脂培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；96孔板购自无锡耐思生物科技有限公司；dmso由天津津东天正精细化学试剂厂生产。
[0073]
1.3菌株：所用菌株包括普通菌株和耐药菌株(esbl 和esbl-)。
[0074]
1.3.1普通菌株：大肠杆菌，枯草杆菌，金色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，阴沟肠杆菌，停乳链球菌。
[0075]
1.3.2产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌耐药菌(esbl )：
[0076]
usvast-143；
[0077]
usvast-347。
[0078]
1.3.3非产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌耐药菌(esbl-)：
[0079]
usvast-140；
[0080]
usvast-30。
[0081]
1.3.4耐药菌信息如下：
[0082][0083]
表1：耐药菌耐药信息表
[0084]
注：0表示敏感，1表示耐药，fq:第三代氟喹诺酮类(fluoroquinolones,fq s)抗菌
药物。
[0085]
1.4阳性对照药：小檗碱纯品购自上海麦克林生化科技有限公司；注射用头孢噻肟钠粉针剂购自北京悦康药业基团股份有限公司。
[0086]
2最低抑菌浓度(mic)测定
[0087]
除移液枪外，所有用物用报纸包好，在高压灭菌锅中灭菌(120℃，30min)。
[0088]
细菌的接种与传代，具体方法为：
[0089]
菌株接种于肉汤固体培养基上，37℃培养箱中倒置培养。待菌落长出后，重复上述操作，传三代后，用接种环挑取单菌落转接到mh液体培养基中，37℃培养箱震荡培养至对数生长期，然后离心(4200r/min，10min)，除去上清液，用少量无菌生理盐水洗3遍，将其用生理盐水稀释为吸光度在600nm下od值(光密度值)为0.10的菌液，再稀释1000倍备用。
[0090]
使用经典的二倍稀释法确定最小抑菌浓度，具体方法为：
[0091]
取96孔板，h排以及第1列和12列做空白对照(10％dmso培养基 无菌生理盐水)，g排做阴性对照(10％dmso培养基 菌液)，f排做阳性对照(10％dmso培养基 菌液 阳性药)。
[0092]
a-e排为样品，所要测试的样品和阳性药用10％dmso培养基配成200μg/ml，在96孔板的a-f排的第2孔加入200μl样品溶液或阳性药溶液，其他孔加入100μl肉汤培养基，从第2孔取100μl加入到第3孔中，混合均匀后再取100μl到第4孔中，以此类推，直到第11孔，取出100μl弃去。
[0093]
最后在除空白对照的每个孔中加入100μl稀释好的菌液，空白组加入100μl无菌生理盐水。此时第2孔到第11孔的样品浓度分别为：
[0094]
100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml，3.125μg/ml，1.56μg/ml，0.79μg/ml，0.39μg/ml，0.19μg/ml。
[0095]
然后将用于实验的96孔板加盖在37℃培养16h。
[0096]
每个实验平行3次，测试od值，与阴性对照相比没有明显细菌生长的为最低抑菌浓度。结果如表所示。
[0097]
[0098][0099]
表2：单萜吲哚生物碱的最低抑菌浓度mic(μg/ml)
[0100]
由表1可见，单萜吲哚生物碱白坚木辛碱对金色葡萄球菌，枯草杆菌，停乳链球菌具有抗菌活性，最低抑菌浓度为3.125-6.25μg/ml，与植物抗菌药小檗碱相当或优于小檗碱；对大肠杆菌，阴沟肠杆菌也有较好的抗菌活性，最低抑菌浓度为25-50μg/ml；对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度为50μg/ml；对非产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌耐药菌的最低抑菌浓度为12.5μg/ml；对产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌耐药菌的最低抑菌浓度为25μg/ml。
[0101]
单萜吲哚生物碱白坚木辛碱的抗菌活性优于植物抗菌药小檗碱，具有广谱抗菌作用，并且对产超广谱β-内酰胺酶和非产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌耐药菌有效，可作为开发抗耐药菌药物的潜在活性成分。
[0102]
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。