特异性结合β-银环蛇毒素的单克隆抗体及其应用的制作方法

特异性结合
β-银环蛇毒素的单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程免疫技术领域，具体的涉及β银环蛇神经毒素单克隆抗体的制备，以及编码所述抗体的核酸。还涉及一种以胶体金免疫层析法快速检测β-银环蛇毒素检测试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.银环蛇(bungarus multicinctus)是眼镜蛇科环蛇属的一种动物，是分布于中国、缅甸、老挝、越南北部和泰国等地区最毒的蛇。全身背面是黑白相间的环纹，具30～50个白色或乳黄色窄横纹。银环蛇一次可排毒4.6mg，而1mg的干毒即可致命。银环蛇毒素(bungarotoxin)的主要成分为蛋白质和多肽，包括α-银环蛇毒素(α-bgt)、β-银环蛇毒素(β-bgt)、κ-银环蛇毒素(κ-bgt)、γ-银环蛇毒素(γ-bgt)和磷脂酶a等酶类。其中，主要用于医学药理学和分子免疫学，制备单克隆抗体的是β-银环蛇毒素。β-银环蛇毒素是一种高碱性多肽，其分子量为20～22kd，由a、b两条链构成。a链具有磷脂酶a2的活性，在结构上与哺乳动物胰腺分泌的磷脂酶a2及其它蛇毒液中的磷脂酶a2具有同源性。b链是β-bgt对特定靶向细胞膜的识别亚基，在神经-肌肉接头突触前膜中的一些成分间相互作用上有着重要的功能。
3.β-银环蛇毒素的毒性强，致命性强。因此，亟需建立一种快速便捷、灵敏度高及特异性好的检测β-银环蛇毒素的方法，为β-银环蛇毒素中毒的治疗以及紧急预防奠定基础。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是提供特异性结合β-银环蛇毒素的抗体及其活性片段。
5.具体而言，本发明提供的抗体或活性片段包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，其中：
6.所述重链可变区具有seq id no:3所示的cdr1，seq id no:4所示的cdr2和/或seq id no:5所示的cdr3；或者，所述重链可变区具有seq id no:13所示的cdr1，seq id no:14所示的cdr2和/或seq id no:15所示的cdr3；
7.所述轻链可变区具有seq id no:8所示的cdr1，seq id no:9所示的cdr2和/或seq id no:10所示的cdr3；或者，所述轻链可变区具有seq id no:18所示的cdr1，seq id no:19所示的cdr2和/或seq id no:20所示的cdr3。
8.作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有seq id no:3所示的cdr1，seq id no:4所示的cdr2和/或seq id no:5所示的cdr3；所述轻链可变区具有seq id no:8所示的cdr1，seq id no:9所示的cdr2和/或seq id no:10所示的cdr3。
9.作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有seq id no:1所示的氨基酸序列，或seq id no:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有seq id no:6所示的氨基酸序列，或seq id no:6所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异
体。
10.作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有seq id no:13所示的cdr1，seq id no:14所示的cdr2和/或seq id no:15所示的cdr3；所述轻链可变区具有seq id no:18所示的cdr1，seq id no:19所示的cdr2和/或seq id no:20所示的cdr3。
11.作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有seq id no:11所示的氨基酸序列，或seq id no:11所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有seq id no:16所示的氨基酸序列，或seq id no:16所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
12.作为本发明的一种优选方案，所述抗体或活性片段为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段中的一种。优选地，所述抗体或活性片段包括但不限于单克隆抗体、f(ab')2、fab'、fab、fv、scfv、dsfv和dab。
13.本发明的第二个目的是提供编码所述特异性结合β-银环蛇毒素的抗体或活性片段的核苷酸序列。
14.在本发明中，seq id no:2所示的核苷酸序列编码seq id no:1所示氨基酸序列；seq id no:7所示的核苷酸序列编码seq id no:6所示氨基酸序列；seq id no:12所示的核苷酸序列编码seq id no:11所示氨基酸序列；seq id no:17所示的核苷酸序列编码seq id no:16所示氨基酸序列。
15.本发明的第三个目的是提供检测β-银环蛇毒素的试剂盒，所述试剂盒包括检测试纸，所述试纸上含有本发明所述的抗体或活性片段。
16.优选地，所述试纸为胶体金免疫层析检测试纸。
17.作为本发明优选的方案，所述试纸包含结合垫、检测线(t线)和控制线(c线)；所述结合垫上包被有所述抗体或活性片段与胶体金的偶联物，所述检测线上包被有所述抗体或活性片段，所述控制线上包被有羊抗鼠igg抗体。
18.其中，与胶体金偶联的包被于所述结合垫上的抗体或活性片段中，重链可变区具有seq id no:3所示的cdr1，seq id no:4所示的cdr2和/或seq id no:5所示的cdr3，且轻链可变区具有seq id no:8所示的cdr1，seq id no:9所示的cdr2和/或seq id no:10所示的cdr3。优选地，与胶体金偶联的包被于所述结合垫上的抗体或活性片段中，重链可变区具有seq id no:1所示的氨基酸序列，或seq id no:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体，且轻链可变区具有seq id no:6所示的氨基酸序列，或seq id no:6所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
19.其中，包被于所述检测线上的抗体或活性片段中，重链可变区具有seq id no:13所示的cdr1，seq id no:14所示的cdr2和/或seq id no:15所示的cdr3，且轻链可变区具有seq id no:18所示的cdr1，seq id no:19所示的cdr2和/或seq id no:20所示的cdr3。优选地，包被于所述检测线上的抗体或活性片段中，重链可变区具有seq id no:11所示的氨基酸序列，或seq id no:11所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体，且轻链可变区具有seq id no:16所示的氨基酸序列，或seq id no:
16所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
20.作为本发明的优选方案，所述胶体金免疫层析检测试纸采用包括如下步骤的方法制备而成：
21.将本发明提供的抗体或活性片段与胶体金偶联后所得的溶液，喷于结合垫上；将本发明提供的抗体用包被缓冲液溶解后，包被于硝酸纤维素膜的检测线上；将抗小鼠的igg抗体用包被缓冲液溶解后，包被于硝酸纤维素膜的控制线上；将所述结合垫以及硝酸纤维素膜组装于背板上，制成大版，裁成裸条，即试纸。
22.本发明的第四个目的是提供本发明所述的抗体或活性片段，或者所述的试纸或试剂盒在样品中检测β-银环蛇毒素的应用。
23.本发明的第五个目的是提供本发明所述的抗体或活性片段在制备用于检测β-银环蛇毒素的试剂中的应用。
24.本发明的第六个目的是提供利用本发明所述的抗体或活性片段，或者所述的试纸或试剂盒检测样品中β-银环蛇毒素的方法。
25.作为本发明的优选方案，所述方法包括以下步骤：将待检样品的溶液滴加到胶体金免疫层析检测试纸上，或滴加到内部装配有所述试纸的试剂盒的加样孔中，静置，观察试纸上的t线和c线的显色情况。
26.作为本发明的优选方案，如果t线与c线均显色，则样品中含有浓度大于或等于20ng/ml的β-银环蛇毒素；如果c线显色，t线不显色，则样品中含有浓度小于20ng/ml的β-银环蛇毒素或不含有β-银环蛇毒素；如果c线不显色，检测试剂失效。
27.本发明针对β-bgt制备抗β-bgt的单克隆抗体，通过对制备的单抗进行配对筛选，建立了β-bgt胶体金检测方法。该方法简便、快速，无需特殊仪器设备即可检测，实用经济，极适用于快速定性检测样本中的β-bgt。这在蛇毒抗原的检测、蛇咬伤中毒的预防及救治等方面具有重要意义。
附图说明
28.图1示出胶体金免疫侧向层析检测卡照片。
具体实施方式
29.下面通过实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，本发明实施例仅是用于说明本发明，而不是本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
30.实施例1.β-bgt的柱层析分离
31.取300mg银环蛇毒粉(购于江西五步蛇生物科技有限公司)溶于4ml 250mm的醋酸铵缓冲液(ph5.0)中，用0.45μm的滤器过滤后，加入到用250mm醋酸铵缓冲液(ph5.0)平衡好的cm-sehadex c-50柱子中，用平衡缓冲液洗涤后，设置以0.3ml/min的流速，同时设置醋酸铵缓冲液(ph5.0)的浓度从250mm到490mm进行线性梯度洗脱，以每管5ml的洗脱液进行收集。将收集到的蛋白样品跑聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白的纯度。取条带单一的峰
ⅷ
进行免疫。
32.实施例2.β-bgt单克隆抗体的制备
33.1.小鼠的免疫
34.将β-bgt与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，经背部皮下多点注射免疫balb/c小鼠。2周后用等量的抗原与弗氏不完全佐剂同上法混匀后免疫。间隔2周后，免疫第3次，方法同第二次免疫。7d后对小鼠进行眼眶采血，获取小鼠血清，采用间接elisa法测定小鼠血清效价，评估免疫效果。
35.2.杂交瘤细胞的制备
36.无菌获取小鼠血清效价大于10000的小鼠脾细胞，制备脾细胞悬液。将保存在液氮中的骨髓瘤细胞sp2/0复苏、增殖、传代，取对数生长期的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按照1：5的比例混合，将50％peg(分子量为4000)缓慢滴入离心管中，1min内加完，边滴边摇，进行融合。融合后24h加入hat选择培养液。由于脾细胞在体外培养条件下只能存活几天，骨髓瘤细胞在hat培养液中无法存活，只有杂交瘤细胞生长不受影响。当hat选择培养液维持培养2周后，改用ht培养液，再维持1周，换用普通培养液。在杂交瘤细胞布满孔底面积1/10时，即可检测特异性抗β-bgt的抗体，筛选出所需的高分泌的杂交瘤细胞系3b10b7和2b10e7。再将孔中细胞进行克隆化。
37.3.抗β-bgt单克隆抗体的制备
38.将提前准备好的液体石蜡注射到小鼠腹腔内，1～2周后，将筛选的高分泌抗β-bgt抗体的杂交瘤细胞3b10b7和2b10e7按照相同的方法接种到小鼠腹腔内。接种细胞7～14天后可产生腹水，用16号注射器针头采集腹水，经1500rpm离心30min后，参照protein g-sepharose说明书进行抗体的亲和层析纯化。
39.实施例3.β-bgt单克隆抗体可变区序列比对分析
40.1.细胞总rna的提取
41.将杂交瘤细胞株3b10b7和2b10e7培养至最佳状态，用移液器吹打细胞数次，将细胞转移到离心管中，8000g 4℃离心2min，弃上清。加入pbs清洗一次。参照takara minibest universal rna extraction kit(takara 9767)说明书提取细胞总rna。
42.2.cdna的合成
43.将1μl的oligo dt引物(50μm)，1μl的dntp混合物(各10mm)和约3μg的总rna混合后，65℃保温5min，迅速置冰上冷却。后再加入4μl的5
×
primescriptⅱ缓冲液，0.5μl(20u)的rnase抑制剂，1μl(200u)的primescriptⅱrtase(200u/μl)，缓慢混匀，42℃温育55min进行反转录，95℃温育5min终止反应，放置在-20℃长期保存。
44.3.可变区序列扩增
45.根据genebank公布的balb/c鼠源性单克隆抗体可变区序列，设计多对框架区序列兼并引物。以提取的rna反转录的cdna为模板，用合成的多框架区序列兼并引物扩增单克隆抗体轻链、重链的可变区核苷酸序列。将扩增的核酸片段用t4连接酶连接到pmdtm19-t载体后，再转化至top10感受态细胞中。经pcr做菌液鉴定后，选取阳性菌落进行扩大培养，后按照天根质粒小提试剂盒说明书提取连有单克隆抗体可变区序列的pmd19-t质粒，送至测序公司进行测序。
[0046]vl
、vh可变区基因扩增引物如下：
[0047]vl-f：5
’‑
acgtttkatttccagcttgg-3’(seq id no:21)
[0048]vl-r：5
’‑
gayattgtgytracacagtc-3’(seq id no:22)
[0049]vh-f：5
’‑
cgcagagacagtgaccagagt-3’(seq id no:23)
[0050]vh-r：5
’‑
caggtgcagctgaagsartc-3’(seq id no:24)
[0051]
4.可变区序列的比对分析
[0052]
将扩增的杂交瘤细胞株3b10b7和2b10e7的单克隆抗体可变区的核苷酸序列测序结果，与genebank数据库中的基因序列进行blast比对分析，结果显示所扩增的序列与genebank中balb/c小鼠的免疫球蛋白可变区基因同源性最高，说明扩增的基因序列为小鼠单克隆抗体可变区序列。利用igblast或abysis软件分析得到抗体轻链和重链可变区氨基酸序列的互补决定区(complementarity determining region，cdr)，分析结果如下：
[0053]
(1)β-bgt单克隆抗体株3b10b7可变区重链测序结果
[0054]
氨基酸序列：
[0055]
ltmnfglswvflvltlkgvkcvvqllesgrglvkpggslklscaasgfafstydtswvrqtpekrlewvtytsrgagntyypdtvkgrftisrdnakntlyvqmsslksedtamyycarqsawslpidywgqgtlvtvsaakttppsvyplapvcgg(seq id no:1)
[0056]
核苷酸序列(共471bp)：
[0057]
ctcaccatgaacttcgggttgagctgggttttccttgtccttactttaaaaggtgtgaagtgtgtagtgcagctgctggagtctgggcgaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcgctttcagtacatatgacacgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcacatacactagtcgtggtgctggtaacacctactatccagacactgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtatgtgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgccagacagagtgcgtggtcactgccgattgattactggggccaagggactctggtaactgtctctgcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctgtgtgtggaggt(seq id no:2)
[0058]
β-bgt毒素单克隆抗体株3b10b7重链可变区cdr1-3序列见表1。
[0059]
表1.β-bgt毒素单克隆抗体株3b10b7重链可变区序列
[0060][0061]
(2)β-bgt单克隆抗体株3b10b7可变区轻链测序结果
[0062]
氨基酸序列：
[0063]
divmtqtpaslavslgqratisyrtskrvttsgysymhwnqqkpgqpprlliylasilesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhiselirseggpswksnglmlhqlyp(seq id no:6)
[0064]
核苷酸序列(共357bp)：
[0065]
gacattgtgatgacccagactcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacaggaccagcaaacgtgtcactacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaacccggacagccacccagactcctcatctatcttgcatccatcctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacataagcgagctcatacgttcggaggggggaccaagctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcca(seq id no:7)
[0066]
β-bgt毒素单克隆抗体株3b10b7轻链可变区cdr1-3序列见表2。
[0067]
表2.β-bgt毒素单克隆抗体株3b10b7轻链可变区序列
[0068][0069]
(3)β-bgt单克隆抗体株2b10e7可变区重链测序结果
[0070]
氨基酸序列：
[0071]
ltmdfglswvflvltlkgvkcevqlvesggglvkpggslklscaasgfafstsdiswvrqtpekrlewvtyisngagntynpdtdkgtftisrdnakntlyvqmsslksedtamyycarhnasslqfaywgqgtlvtvsavkttppsvyplapvcgd(seq id no:11)
[0072]
核苷酸序列(共471bp)：
[0073]
ctcaccatggacttcgggttgagctgggttttccttgtccttactttaaaaggtgtgaagtgtgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcgctttcagtacctctgatatctcctgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcacatacattagtaatggtgctggtaacacctacaatccagacactgacaagggcacattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtatgtgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgccagacacaatgcgtcgtcactgcagtttgcttactggggccaagggactctggtaactgtctctgcagtcaaaacgacacccccatctgtctatccactggctcctgtgtgtggagat(seq id no:12)
[0074]
β-bgt毒素单克隆抗体株2b10e7重链可变区cdr1-3序列见表3。
[0075]
表3.β-bgt毒素单克隆抗体株2b10e7重链可变区序列
[0076][0077]
(4)β-bgt单克隆抗体株2b10e7可变区轻链测序结果
[0078]
氨基酸序列：
[0079]
divltqspaslavslgqratisyrdsksvsrsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsylesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhtreltrseggpswklnglmlhqlyp(seq id no:16)
[0080]
核苷酸序列(共357bp)：
[0081]
gatattgtgctcacccagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggacagcaaaagtgtcagtagatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatcctacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacactagggagcttacacgttcggaggggggaccaagctggaaattaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcca(seq id no:17)
[0082]
β-bgt毒素单克隆抗体株2b10e7轻链可变区cdr1-3序列见表4。
[0083]
表4.β-bgt毒素单克隆抗体株2b10e7轻链可变区序列
[0084][0085]
实施例4.β-bgt胶体金免疫侧向层析检测试剂盒
[0086]
胶体金免疫层析试验(immunochromatographie assay)是以微孔膜为固相载体，借助毛细管虹吸引力(层析作用)使液体样品在条状膜上泳动。本发明将从杂交瘤细胞株3b10b7对应腹水中纯化出的抗体，与粒径40nm的胶体金偶联，溶于复溶液中，使用金标三维划膜喷点仪喷于预处理好的结合垫上；将杂交瘤细胞株2b10e7对应腹水中纯化出的抗体，
用包被缓冲液溶解后，使用金标三维划膜喷点仪包被于预处理好的硝酸纤维素(nc)膜的test线(t线)上；将外购的羊抗鼠igg抗体，用包被缓冲液溶解后，使用金标三维划膜喷点仪包被于预处理好的硝酸纤维素膜的control线(c线)上；将喷金处理的结合垫、包被处理的nc膜、预处理的结合垫组装于背板上，制成大版。使用切条机将上一步制作的大版裁成宽度为4mm的裸条，组装于配套的卡壳中，制备成可用于检测β-bgt毒素的胶体金检测试剂。
[0087]
配制不同浓度的β-bgt毒素样品液(溶剂为ph7.4，0.01m的磷酸盐缓冲液)，用移液器分别移取不同浓度的β-bgt样品液80μl，平行滴加于胶体金检测试剂的加样孔，观察10min时，t线和c线的显色情况，如果t线与c线均显色，为阳性；c线显色，t线不显色为阴性；c线不显色，检测试剂失效。如图1所示，其中，1.阴性；2.浓度为20ng/mlβ-bgt毒素样品液；3.浓度为1μg/mlβ-bgt毒素样品液。
[0088]
经测定，该β-bgt胶体金检测试剂检测限为20ng/ml。
[0089]
本发明列举的实施例仅是本发明优选的技术方案，本发明的保护范围不仅限于上述实施例，如是在本发明的原理条件下进行任何改造及变形，理应属于本发明的保护范围。