特异性结合蓖麻毒素的单克隆抗体及其应用的制作方法

1.本发明涉及免疫领域，具体涉及特异性结合蓖麻毒素的抗体以及检测蓖麻毒素的检测试纸及试剂盒。


背景技术：

2.蓖麻毒素(ricin toxin，rt)来源于大戟科植物蓖麻(ricinus communis)的种子，是一种致命的、毒性极强的生物毒素，可引起意外中毒，也可用于犯罪企图。一分子rt进入细胞内，就足以使整个细胞蛋白质合成停止而死亡，其毒性是氰化物的6000倍。蓖麻种子的毒性在19世纪末在斯特拉斯堡的schmiedeberg实验室开始进行研究，随后在多尔帕特医学院(现在的塔尔图)，从蓖麻籽或滤饼中纯化出一种剧毒的蛋白质，并命名为rt。rt分子量约为60kda，是一种ii型核糖体灭活蛋白(rip)，由a链(rta)和b链(rtb)通过二硫键连接而成。提取高纯度的rt，是验证其生物特性和制备rt单克隆抗体的基础。
3.rt来源很广，提取简便，性质稳定，毒性极高，很容易被用作化学武器，所以极易被不法分子甚至是恐怖组织利用，具有极大的危险性、威胁性。针对rt中毒，国内外还没有解毒药和特异性抗毒素等，临床上主要根据不同中毒途径引起的主要中毒症状，进行对症治疗。
4.因此建立一种快速便捷、灵敏度高及特异性好的检测rt方法显得十分迫切。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是提供特异性结合蓖麻毒素的抗体及其活性片段。
6.具体而言，本发明提供的抗体或活性片段包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，其中：
7.所述重链可变区具有seq id no:3所示的cdr1，seq id no:4所示的cdr2和/或seq id no:5所示的cdr3；或者，所述重链可变区具有seq id no:13所示的cdr1，seq id no:14所示的cdr2和/或seq id no:15所示的cdr3；
8.所述轻链可变区具有seq id no:8所示的cdr1，seq id no:9所示的cdr2和/或seq id no:10所示的cdr3；或者，所述轻链可变区具有seq id no:18所示的cdr1，seq id no:19所示的cdr2和/或seq id no:20所示的cdr3。
9.作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有seq id no:3所示的cdr1，seq id no:4所示的cdr2和/或seq id no:5所示的cdr3；所述轻链可变区具有seq id no:8所示的cdr1，seq id no:9所示的cdr2和/或seq id no:10所示的cdr3。
10.作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有seq id no:1所示的氨基酸序列，或seq id no:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有seq id no:6所示的氨基酸序列，或seq id no:6所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
11.作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有seq id no:13所示的cdr1，seq id no:14所示的cdr2和/或seq id no:15所示的cdr3；所述轻链可变区具有seq id no:18所示的cdr1，seq id no:19所示的cdr2和/或seq id no:20所示的cdr3。
12.作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有seq id no:11所示的氨基酸序列，或seq id no:11所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有seq id no:16所示的氨基酸序列，或seq id no:16所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
13.作为本发明的一种优选方案，所述抗体或活性片段为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段中的一种。优选地，所述抗体或活性片段包括但不限于单克隆抗体、f(ab')2、fab'、fab、fv、scfv、dsfv和dab。
14.本发明的第二个目的是提供编码所述特异性结合蓖麻毒素的抗体或活性片段的核苷酸序列。
15.在本发明中，seq id no:2所示的核苷酸序列编码seq id no:1所示氨基酸序列；seq id no:7所示的核苷酸序列编码seq id no:6所示氨基酸序列；seq id no:12所示的核苷酸序列编码seq id no:11所示氨基酸序列；seq id no:17所示的核苷酸序列编码seq id no:16所示氨基酸序列。
16.本发明的第三个目的是提供检测蓖麻毒素的试剂盒，所述试剂盒包括检测试纸，所述试纸上含有本发明所述的抗体或活性片段。
17.优选地，所述试纸为胶体金免疫层析检测试纸。
18.作为本发明优选的方案，所述试纸包含结合垫、检测线(t线)和控制线(c线)；所述结合垫上包被有所述抗体或活性片段与胶体金的偶联物，所述检测线上包被有所述抗体或活性片段，所述控制线上包被有羊抗鼠igg抗体。
19.其中，与胶体金偶联的包被于所述结合垫上的抗体或活性片段中，重链可变区具有seq id no:3所示的cdr1，seq id no:4所示的cdr2和/或seq id no:5所示的cdr3，且轻链可变区具有seq id no:8所示的cdr1，seq id no:9所示的cdr2和/或seq id no:10所示的cdr3。优选地，与胶体金偶联的包被于所述结合垫上的抗体或活性片段中，重链可变区具有seq id no:1所示的氨基酸序列，或seq id no:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体，且轻链可变区具有seq id no:6所示的氨基酸序列，或seq id no:6所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
20.其中，包被于所述检测线上的抗体或活性片段中，重链可变区具有seq id no:13所示的cdr1，seq id no:14所示的cdr2和/或seq id no:15所示的cdr3，且轻链可变区具有seq id no:18所示的cdr1，seq id no:19所示的cdr2和/或seq id no:20所示的cdr3。优选地，包被于所述检测线上的抗体或活性片段中，重链可变区具有seq id no:11所示的氨基酸序列，或seq id no:11所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体，且轻链可变区具有seq id no:16所示的氨基酸序列，或seq id no:16所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
21.作为本发明的优选方案，所述胶体金免疫层析检测试纸采用包括如下步骤的方法制备而成：
22.将本发明提供的抗体或活性片段与胶体金偶联后所得的溶液，喷于结合垫上；将本发明提供的抗体用包被缓冲液溶解后，包被于硝酸纤维素膜的检测线上；将抗小鼠的igg抗体用包被缓冲液溶解后，包被于硝酸纤维素膜的控制线上；将所述结合垫以及硝酸纤维素膜组装于背板上，制成大版，裁成裸条，即试纸。
23.本发明的第四个目的是提供本发明所述的抗体或活性片段，或者所述的试纸或试剂盒在样品中检测蓖麻毒素的应用。
24.本发明的第五个目的是提供本发明所述的抗体或活性片段在制备用于检测蓖麻毒素的试剂中的应用。
25.本发明的第六个目的是提供利用本发明所述的抗体或活性片段，或者所述的试纸或试剂盒检测样品中蓖麻毒素的方法。
26.作为本发明的优选方案，所述方法包括以下步骤：将待检样品的溶液滴加到胶体金免疫层析检测试纸上，或滴加到内部装配有所述试纸的试剂盒的加样孔中，静置，观察试纸上的t线和c线的显色情况。
27.作为本发明的优选方案，如果t线与c线均显色，则样品中含有浓度大于或等于10ng/ml的蓖麻毒素；如果c线显色，t线不显色，则样品中含有浓度小于10ng/ml的蓖麻毒素或不含有蓖麻毒素；如果c线不显色，检测试剂失效。
28.本发明的第七个目的是提供蓖麻毒素的提纯方法，所述方法包括以下步骤：蓖麻籽粉碎后用磷酸盐缓冲液浸提，离心，取上清液加入饱和硫酸铵溶液，静置，离心，取沉淀溶于磷酸盐缓冲液，透析，离心，所得上清液即为蓖麻粗毒；采用sepharose 4b柱吸附蓖麻粗毒，用半乳糖洗脱，经过sephacryl s-100分子筛层析，制备得到纯度大于90％的蓖麻毒素。
29.本发明从蓖麻籽提取蓖麻粗毒后，利用rt对半乳糖的特殊亲和力，采用sepharose 4b柱吸附rt和蓖麻凝集素，用150mm半乳糖洗脱，经过sephacryl s-100分子筛层析，将rt和蓖麻凝集素分开，制备出纯度大于90％的rt，并免疫小鼠制备单克隆抗体。随后对制备的单克隆抗体进行随机配对，将配对成功的两株单克隆抗体(细胞株编号分别为401和901)，分别用于胶体金标记和包被，建立可特异性检测rt的胶体金免疫侧向层析试纸条检测方法。该方法操作简便快捷、重现性好、极其方便现场使用，该方法的建立不仅丰富了现有的rt检测方法，同时也为rt中毒的治疗以及紧急预防奠定基础。
附图说明
30.图1示出胶体金免疫侧向层析检测卡照片。
具体实施方式
31.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
32.实施例1.rt粗毒的提取
33.取蓖麻籽50g去壳，置粉碎机中，加入液氮粉碎后取出。再加入100ml 10mm磷酸盐缓冲液(ph 7.2)，置4℃浸提24h，17000g，4℃离心40min，去除沉淀及上层脂肪，收集上清并用三层滤纸抽滤。然后加入饱和硫酸铵溶液，置4℃过夜，17000g，4℃离心40min，收集沉淀。
将所得沉淀溶于10mm磷酸盐缓冲液(ph 7.2)中，并用10mm磷酸盐缓冲液(ph 7.2)透析过夜，17000g，4℃离心15min，所得上清液即为蓖麻粗毒。
34.实施例2.rt粗毒的纯化
35.(1)亲和层析
36.在平衡好的sepharose 4b介质中加入适量蓖麻粗毒，混匀吸附1.5h后，将介质装入重力柱中，连接恒流泵并控制流速70r/min，使用hd-a层析图谱采集分析仪记录层析图谱。用10mm磷酸盐缓冲液(ph 7.2)洗杂蛋白，待uv曲线洗平后，加入150mm的半乳糖-pbs(ph 7.2)洗脱蛋白，并收集洗脱峰。
37.(2)分子筛层析
38.将亲和后的收集液以0.5ml/min的流速上sephacryl s-100hr预装柱，用10mm磷酸盐缓冲液(ph7.2)缓冲液洗脱并收集洗脱峰。
39.实施例3.rt鉴定及蛋白浓度测定
40.将收集到的rt蛋白分别用含β巯基乙醇和不含β巯基乙醇的上样缓冲液进行煮样，跑sds-page电泳。用考马斯亮蓝r-250染色，脱色液在摇床上脱色，并分析胶图确定rt、rta、rtb的相对分子量。用bca法测定rt的浓度。
41.实施例4.rt单克隆抗体的制备
42.挑选5只8～10周龄balb/c健康雌性小鼠，将上述纯化好的rt按照100μg/0.2ml
·
只
·
每次进行背部皮下注射免疫，免疫间隔2周；免疫3次后的第7天，对小鼠进行眼眶采血，获取小鼠血清，用elisa法检测小鼠血清中rt单克隆抗体的结合效价，若效价小于10000，则进行加强免疫1～2次，直到抗体效价大于10000。
43.取抗体效价大于10000的小鼠脾细胞与骨髓瘤sp2/0细胞混合(脾细胞:sp2/0细胞5:1)，900r/min离心10min，弃上清，并在1min之内滴加1ml 50％的peg进行融合，后通过hat选择培养基筛选融合细胞，并对融合细胞进行elisa检测，对检测呈阳性的细胞进行克隆化。
44.将高压灭菌的石蜡油以0.5ml/只注射到雌性小鼠腹腔，一周后注入106个杂交瘤细胞，7～10天后，当小鼠腹部明显膨胀时抽取腹水，用protein a/g抗体纯化柱进行纯化，纯化后的抗体elisa效价大于1:128000，纯度大于90％。
45.实施例5.rt单克隆抗体cdr区序列的扩增以及序列测定
46.复苏杂交瘤细胞株401和901后培养，待细胞长至对数生长期时收集约1
×
107个细胞。按照takara minibest universal rna extraction kit说明书提取杂交瘤细胞总rna，先按照表1所示加好反应体系，再按照表2所示的反应体系进行第一链(1st-strand)cdna合成。
47.表1.第一链cdna合成反应混合液
[0048][0049]
表2.反转录反应液
[0050][0051]
用表3所示的引物序，以反转录的cdna为模板，pcr扩增单克隆抗体轻链、重链的可变区核苷酸序列，参照pmd
tm
19-t vector cloning kit说明书，将扩增的核酸片段连接到pmd
tm
19-t载体中，再转化至top10感受态细胞中，经pcr做菌液鉴定后，选取阳性菌落进行扩大培养，后按照天根质粒小提试剂盒说明书提取连有单克隆抗体可变区序列的pmd19-t质粒，测定质粒浓度，送至测序公司进行测序。
[0052]
表3.可变区引物序列
[0053][0054]
实施例6.rt单克隆抗体可变区序列比对分析
[0055]
将401和901单克隆抗体可变区的核酸序列在genbank数据库中进行同源性分析，结果显示所扩增的序列与genebank中balb/c小鼠的免疫球蛋白可变区基因同源性最高，说明测序得到的基因序列为小鼠抗体序列。利用imgt/v-quest与abysis软件分析得到抗体轻
链和重链可变区的氨基酸序列及cdr区的划分。测序结果如下。
[0056]
(1)rt单克隆抗体株401可变区重链测序结果(见表4)
[0057]
氨基酸序列：
[0058]
ltmecswvmlflvatasgvhsqvqlqqpgselvrpgasvklsckasgyaftsywiqwvkqrpgqglerigniypasgrinydemfkpkatltvdtssntaymqlsnltsedsavyyctrfiyygshgyaidywgqgtsvtvssakttppsvyplvpvc(seq id no:1)
[0059]
核苷酸序列(共475bp)：
[0060]
ctcaccatggaatgcagctgggtaatgctcttcttggtagcaacagcctcaggtgtccactcccaggtccaactgcagcaacctgggtctgagctggtgaggcctggagcttcagtgaaactgtcctgcaaggcttctggctacgcattcaccagctattggatccagtgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagcggattggaaatatttatcctgctagtggtcgtattaattacgatgagatgttcaagcccaaggccacactgactgtggacacatcctctaacacagcctacatgcagctcagcaacctgacatctgaggactctgcggtctattactgtacaagattcatctactatggttcccacggatatgctatcgactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggtccctgtgtgtg(seq id no:2)
[0061]
表4.rt单克隆抗体株401重链可变区序列
[0062][0063]
(2)rt单克隆抗体株401可变区轻链测序结果(见表5)
[0064]
氨基酸序列：
[0065]
diqltqspaimsaspgekvtiscsarsglsftywyqqkagsspkpwiyrtsimasgvparfsgsgsgtsysltvssmeaedaatyycqqyhtyaptfgggtklei(seq id no:6)
[0066]
核苷酸序列(共321bp)：
[0067]
tgacattcagctgacccagtctccagcaatcatgtctgcttctccaggggagaaggtcaccatatcctgcagtgccagatcaggtctaagtttcacgtactggtaccagcagaaggcaggatcctcccccaaaccctggatttatcgcacatccatcatggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacagtcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtatcatacttacgcacccacgttcggaggggggaccaagctggagatctaaca(seq id no:7)
[0068]
表5.rt单克隆抗体株401轻链可变区序列
[0069][0070]
(3)rt单克隆抗体株901可变区重链测序结果(见表6)
[0071]
氨基酸序列：
[0072]
ltmdfglslvflptlphgiqcqvklvesggglvqpggslrlscatsgftfshlnmewvrqppgkrlewlaasrnkandyiieynvsvkgrftvsrdtsqgtlnpqmyalraqdtaiyycardhygtdgprrgawllgprhhshsllsqndtpiclstgpcvwr(seq id no:11)
[0073]
核苷酸序列(共492bp)：
[0074]
tctcaccatggacttcgggctgagcttggtttttcttccaacacttccacatggtatccagtgtcaggtgaagctggtggaatctggaggaggcttggtacagcctgggggttctctgagactctcctgtgcaacttctgggttcaccttcagtcatttgaacatggagtgggtccgccagcctccaggcaagagactggagtggctggctgcaagtagaaacaaagctaatgattatataatagaatacaatgtctctgtgaagggtcggttcaccgtctccagagacacttcccaaggcaccctcaaccctcagatgtatgccctgagagctcaggacactgccatttattattgtgcaagagatcactatggtaccgacggtcctcgacgaggggcttggctactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctgtgtgtggagata(seq id no:12)
[0075]
表6.rt单克隆抗体株901重链可变区序列
[0076][0077]
(4)rt单克隆抗体株901可变区轻链测序结果(见表7)
[0078]
氨基酸序列：
[0079]
divltqspaslavslgqratisyrasnsvstpgytymhwnqqkpgqpprlliylashlasgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqdiseltrseggpswk(seq id no:16)
[0080]
核苷酸序列(共325bp)：
[0081]
tgacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaacagtgtcagtacacctggctatacttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgcatcccacctagcatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcaggacattagcgagcttacacgttcggaggggggaccaagctggaaa(seq id no:17)
[0082]
表7.rt单克隆抗体株901轻链可变区序列
[0083][0084]
实施例7.rt胶体金免疫侧向层析检测试剂盒
[0085]
将从细胞株编号为401对应腹水中纯化出的抗体，与粒径40nm的胶体金偶联，溶于复溶液中，使用金标三维划膜喷点仪喷于预处理好的结合垫上；将从细胞株编号为901对应腹水中纯化出的抗体，用包被缓冲液溶解后，使用金标三维划膜喷点仪包被于预处理好的硝酸纤维素(nc)膜的test线(t线)上；将外购的羊抗鼠igg抗体，用包被缓冲液溶解后，使用金标三维划膜喷点仪包被于预处理好的硝酸纤维素膜的control线(c线)上；将喷金处理的结合垫、包被处理的nc膜、预处理的结合垫组装于背板上，制成大版。使用切条机将上一步制作的大版裁成宽度为4mm的裸条，组装于配套的卡壳中，制备成可用于检测rt的胶体金检测试剂。
[0086]
配制不同浓度的rt样品液(溶剂为ph7.4，0.01m的磷酸盐缓冲液)，用移液器分别移取不同浓度的rt样品液80μl，平行滴加于胶体金检测试剂的加样孔，观察10min时，t线和c线的显色情况，如果t线与c线均显色，为阳性；c线显色，t线不显色为阴性；c线不显色，检测试剂失效。如图1所示，其中，1.阴性；2.浓度为10ng/ml的蓖麻毒素样品液；3.浓度为1μg/ml的蓖麻毒素样品液。
[0087]
经测定，该rt胶体金检测试剂检测限为10ng/ml。
[0088]
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。