氧-甲基转移酶PgmB在催化大黄素产生大黄素甲醚中的应用

氧-甲基转移酶pgmb在催化大黄素产生大黄素甲醚中的应用
技术领域
1.本发明属于酶基因工程及酶工程领域，具体涉及一种来源于土曲霉(aspergillus terreus)的氧-甲基转移酶pgmb在催化大黄素产生大黄素甲醚中的应用。


背景技术：

2.大黄素甲醚是一种以蒽醌为碳骨架的芳香聚酮化合物。研究表明，大黄素甲醚对白粉病、灰霉病、稻瘟病、丝核菌等10余种重要病原菌有杀菌活性，因此常被用作农用杀菌剂，其作用机制是通过抑制病原菌的糖及糖代谢中间产物的氧化、脱氢，抑制蛋白质和核酸的合成，从而抑制病原菌孢子萌发、菌丝的生长、吸器的形成，使得作物免受病原菌的侵害达到防病的效果。作为一种高效低毒新型绿色环保植物源农药，大黄素甲醚具有降解快、低残留、不易产生抗药性、有效促进作物新梢新芽生长、基本无施药采收间隔期等优势，特别适合作为有机蔬菜生产的绿色生物制剂。
3.目前生产大黄素甲醚的方法主要是植物提取法和内源真菌发酵法。大黄素甲醚从植物中提取和纯化过程复杂、化学合成产量低，而真菌生产菌株大部分又难以培养、致病性或产率低，从根本上限制了通过原始生产菌株发酵生产化合物的规模。随着基因组测序技术的发展，在模式微生物中开发的许多合成生物学策略，已经成为聚酮化合物的发现、表征、生产和酶功能鉴定的有用工具。在模式微生物中异源合成植物源天然产物的新思路将大幅降低大黄素甲醚等生物农药的生产成本，进一步促进其推广应用。迄今为止，已有研究人员在酿酒酵母中重构大黄素的生物合成路径，但大黄素甲醚的路径仍未建立。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供氧-甲基转移酶pgmb在催化大黄素产生大黄素甲醚中的应用。
5.本发明的技术方案概述如下：
6.氧-甲基转移酶pgmb在催化大黄素产生大黄素甲醚中的应用，其特征是所述氧-甲基转移酶pgmb的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明的优点：
8.实验证明，氧-甲基转移酶pgmb可以以大黄素为底物生成大黄素甲醚，降低大黄素甲醚生产成本，为实现大黄素甲醚的异源生物合成奠定基础。
附图说明
9.图1为含有pgmb基因的大肠杆菌bl21转化子菌落pcr验证的dna琼脂糖凝胶图谱(目的条带大小为1283bp)；m：标准dna分子尺；泳道1：pgmb；
10.图2为大黄素甲醚的标准曲线；
11.图3为生物转化后样品溶液的hplc图谱，其中：
12.a为pgmb细胞生物转化后的样品溶液的hplc图谱；
13.b为hplc检测的大黄素甲醚峰面积，(a：pet-28a空质粒对照；b：pgmb；c：化合物1为10μg/ml的大黄素标品，化合物2为25μg/ml大黄素甲醚标品。)
具体实施方式
14.氧-甲基转移酶pgmb(accession:arb51364.1)。
15.下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
16.实施例1.pgmb大肠杆菌bl21表达菌株的构建
17.一.将来源于土曲霉(aspergillus terreus nih2624)的氧-甲基转移酶pgmb(氨基酸序列seq id no.1)针对大肠杆菌进行密码子优化，基因合成，构建pet28a-pgmb重组质粒。
18.二.制备大肠杆菌bl21感受态，操作步骤如下：
19.(1)从-80℃冰箱取出大肠杆菌bl21甘油菌，置于冰上缓慢融化，吸取适量菌液接种到lb固体平板上三区划线，置于37℃培养箱12h至长出单菌落。
20.(2)挑取新鲜的单菌落于10ml lb液体培养基进行培养，置于37℃摇床，220rpm培养约12h至对数生长期。
21.(3)按1％的接种量，转接至50ml lb液体培养基中。37℃，220rpm摇2.5-3h，每一小时测一次od，当od
600
＝0.4-0.6时停止培养。
22.(4)将菌液置冰上5min后分装于灭菌预冷的50ml离心管中，冰浴30min，4℃下5000rpm离心5min，弃上清。
23.(5)向每管菌体加5ml预冷的体积浓度为10％的甘油水溶液，于冰上缓慢重悬菌体，4℃，5000rpm离心5min，弃上清，重复本步骤3次，弃上清。
24.(6)每管菌体加入200μl体积浓度10％的甘油水溶液，将菌体混匀，使细胞悬于甘油水溶液中，分装到1.5ml ep管中，每管100μl，-80℃存放，得到大肠杆菌bl21感受态。
25.三.通过电转化法将pet28a-pgmb重组质粒转化至大肠杆菌bl21感受态，操作步骤如下：
26.(1)从-80℃冰箱取出制备好的大肠杆菌bl21感受态，置于冰上融化，同时将无菌的电击杯置于冰上预冷。
27.(2)打开电转仪，调至manual模式，调节电压设为2.5kv，预热5min。
28.(3)吸取5μl pet28a-pgmb重组质粒于100μl大肠杆菌bl21感受态中，轻轻混合均匀得混合液，冰上放置10min，转入预冷的电击杯中，缓慢吹吸，使混合液进入电转杯电极之间，加盖。
29.(4)将电击杯推入电转化仪，按pulse，电击参数约为3.5ms。
30.(5)向电击杯迅速加入1ml lb液体培养基，轻轻吸打，并转移至1.5ml离心管中，置于37℃、180rpm复苏培养45min。
31.(6)5000rpm，离心2min，弃上清，留100μl重悬菌液，用涂布棒将菌液涂布于含25μg/ml卡那霉素抗性的lb固体培养基上。37℃培养箱倒置过夜培养。
32.四.含有目标转化子单菌落的筛选
33.从本实施例步骤三(6)得到的固体培养基取出，随机挑选10个单菌落分别混匀于10μlddh2o中。取7μl混于100μl lb液体培养基中，置于37℃，220rpm摇床培养。剩余3μl作为
pcr模板，以seq id no.2和seq id no.3为上下游引物，进行菌落pcr反应，pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选含有目标转化子的单菌落。其中，反应体系为10μl，包括ddh2o 1.0μl，2
×
taq dna master mix(1ml)5.0μl，seq id no.2所示引物(10μm)0.5μl，seq id no.3所示引物(10μm)0.5μl，菌液3.0μl，引物序列如下：
34.引物y-pgmb-f：5'ccgttagtccactggaaggtc 3'(seq id no.2)
35.引物y-pgmb-r：5'gctgagctgaatctccagaatg 3'(seq id no.3)
36.将正确的转化子接至含50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃，220rpm培养12h，于体积浓度30％甘油水溶液中-80℃保存。
37.结果表明：挑选的转化子在1283bp处有单一条带，得到转化子为阳性克隆子，即pgmb大肠杆菌bl21表达菌株。
38.对照菌株：用pet28a替代本实施例中的pet28a-pgmb，其它同本实施例，制备出的表达菌株为对照菌株。
39.实施例2.表达菌株的诱导
40.通过iptg诱导pgmb大肠杆菌bl21表达菌株表达pgmb，具体步骤如下：
41.(1)活化菌株：-80℃冰箱取出实施例1获得的pgmb大肠杆菌bl21表达菌株，置于冰上缓慢融化，吸取适量菌液接种到含25μg/ml卡那霉素的lb固体平板上三区划线，置于37℃培养箱约12h至长出单菌落。挑取新鲜的单菌落接种到卡那霉素终浓度为50μg/ml的lb液体培养基中进行培养，37℃，220rpm过夜培养12h。
42.(2)转接：按照体积分数1％的接种量，将过夜培养的菌液接种到卡那霉素终浓度为25μg/ml的lb液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养至od
600
＝0.4-0.6。
43.(3)iptg诱导：加入终浓度为0.5mm的iptg诱导剂，并在16℃诱导表达20h(表达出氧-甲基转移酶pgmb，其氨基酸序列如seq id no.1所示)，得到诱导的pgmb大肠杆菌bl21表达菌株。
44.实施例1获得的对照菌株的诱导同本实施例的各步骤，得到诱导的对照菌株。
45.实施例3.生物转化
46.(1)收集菌体：诱导的pgmb大肠杆菌bl21表达菌株菌液在4℃、4000rpm下离心10min，去上清；
47.(2)将收集到的菌体用预冷的等体积的不含有抗生素的lb培养基洗涤，重复洗两次，4℃、4000rpm下离心10min，去上清。重悬于20ml lb液体培养基中，预先在培养基中加入终浓度25μg/ml卡那霉素，取1ml菌液做体内酶活反应，加入终浓度为1mm大黄素为反应底物(大肠内源性sam(s-腺苷-l-蛋氨酸)提供甲基供体)25℃，200rpm条件下摇床培养12h。
48.用诱导的对照菌株替代本实施例的诱导的pgmb大肠杆菌bl21表达菌株，其它同本实施例，进行生物转化。
49.实施例4.高效液相色谱法检测产物
50.1.制备样品溶液
51.向实施例3获得的两种发酵液分别加入等体积甲醇萃取，超声处理30min，8000rpm离心10min，取上清，过0.22μm有机微孔滤膜转至液相小瓶待液相检测。反应产物采用hplc分析鉴定。
52.2标准品溶液的制备：
53.2.1精密称取大黄素甲醚标准品，加入甲醇，分别配制成浓度为1、2.5、10、20、25μg/ml的大黄素甲醚标准品溶液，过0.22μm有机微孔滤膜至液相小瓶；大黄素甲醚微溶于甲醇，可先加入少量三氯甲烷溶解后再用甲醇定容。
54.2.2精密称取大黄素和大黄素甲醚标准品，加入甲醇，配制成含终浓度10μg/ml大黄素标品和25μg/ml大黄素甲醚标品的混合标准品溶液。
55.3.通过高效液相色谱法检测产物
56.用高效液相色谱法检测样品溶液、大黄素甲醚标准品溶液和混合标准品溶液
57.高效液相色谱法检测条件：
58.色谱柱：hypurity c18(250mm
×
4.6mm，5μm)；进样量：10μl；流动相：甲醇-0.1％磷酸水溶液(75:25)；流速：1.0ml/min，检测波长：254nm。
59.4.数据处理：
60.4.1建立大黄素甲醚标准曲线
61.用步骤2.1获得的5个不同浓度的大黄素甲醚标准品溶液，各进样3次，每次进样10μl。记录大黄素甲醚峰面积值，取3次峰面积的平均值。以对照品浓度(μg/ml)为横坐标(x)，相应的峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，绘制标准曲线，标准曲线用y＝ax b表示，见图2。用样品溶液的峰面积值代入标准曲线得到大黄素甲醚的产量。
62.4.2混合标准品溶液检测结果表明，大黄素和大黄素甲醚出峰时间分别为15.8min和33.2min，样品溶液的结果显示，与对照组相比，pgmb大肠杆菌bl21表达菌株生物转化反应在保留时间33.0min检测到大黄素甲醚，表明pgmb对大黄素有催化作用，三次发酵液检测，取平均值，细胞液生物转化样品溶液的大黄素甲醚峰面积为27214，浓度为18.87μg/ml。
63.以上所述仅为本发明的优选实施方式，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的若干改进或变形，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，也应视为在本发明的保护范围内。