多核苷酸连接的生物缀合物及其制备和使用方法与流程

多核苷酸连接的生物缀合物及其制备和使用方法


背景技术：

1.当前用于将分子与蛋白(如抗体)缀合的化学物质在化学上是苛刻的，并且涉及改变抗体和/或与抗体缀合的分子的生物活性的固有风险。另外，对于荧光染料缀合的抗体，使用的化学物质在每个抗体上产生荧光染料分子的分布。举例来说，使用nhs-酯缀合化学物质和最先进的聚合物染料导致2-10个染料分子的分布，所述染料分子最终以泊松分布与每个抗体缀合。这增加了测量的潜在可变性(并且因此增加了噪声)，并且还削弱了使用这类染料缀合抗体对生物分子进行定量的能力。这些缀合化学物质也为效率低的，需要过量的染料，这影响成本以及增加在最终产物中包含游离、未结合染料的风险。表1示出几种当前用于将分子附接到抗体的技术。
2.表1.
[0003][0004]
另外，由于所涉及的潜在苛刻化学物质和当前可用的染料的固有的“粘性”，缀合后的染料纯化是当前生物分子缀合物制造的必需步骤。


技术实现要素：

[0005]
本文提供多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物，其包含经由核酸接头连接到缀合物组分的结合分子。
[0006]
本文还提供多核苷酸修饰的珠粒生物缀合物，其包含经由核酸接头连接到缀合物组分的珠粒。
[0007]
提供一种产生本公开的多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物或本公开的多核苷酸修饰的珠粒生物缀合物的方法，所述方法包含：(i)使包含至少部分单链核酸接头的多核苷酸修饰的底物与包含至少部分单链核酸接头的多核苷酸修饰的缀合物组分接触，其中底
物为结合分子或珠粒，其中底物的单链接头序列的至少一部分与缀合物组分的单链接头序列的一部分互补，并且其中当接触时，使底物的核酸接头和缀合物组分的核酸接头退火，以形成将底物连接到缀合物组分的至少部分双链接头；(ii)使底物与缀合物组分接触，其中底物为结合分子或珠粒，并且将核酸接头附接到底物并且将同一核酸接头附接到缀合物组分，以形成多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物，(iii)使包含核酸接头的多核苷酸修饰的缀合物组分与底物接触，其中底物为结合分子或珠粒，并且将多核苷酸修饰的缀合物组分的核酸接头附接到底物，以形成多核苷酸修饰的结合分子或珠粒生物缀合物，(iv)使包含核酸接头的多核苷酸修饰的底物与缀合物组分接触，其中底物为结合分子或珠粒，并且将多核苷酸修饰的底物的核酸接头附接到缀合物组分，以形成多核苷酸修饰的结合分子或珠粒生物缀合物；或(v)使以下接触：(i)包含至少部分单链核酸接头多核苷酸修饰的底物，其中底物为结合分子或珠粒，(ii)包含至少部分单链核酸接头的多核苷酸修饰的缀合物组分，和(iii)不是(i)或(ii)的核酸接头的另一核酸接头片段，其中底物的单链接头序列的至少一部分与另一核酸接头片段(iii)的单链部分互补，和/或其中缀合物组分的单链接头序列的至少一部分与另一核酸接头片段(iii)的单链部分互补，并且其中当接触时，使底物的核酸接头、缀合物组分的核酸接头，和另一核酸接头片段退火，以形成将底物连接到缀合物组分的至少部分双链接头。
[0008]
本文提供一种用于检测的标记结合分子的高速产生方法，其中相同结合分子的单独的结合分子的分子用不同的缀合物组分标记，所述方法包含：(a)将至少部分单链核酸接头附接到相同结合分子的至少两个单独的结合分子的分子，以产生多个多核苷酸修饰的结合分子的分子；和(b)使多个多核苷酸修饰的结合分子的分子中的至少一个多核苷酸修饰的结合分子的分子与包含至少部分单链核酸接头的第一多核苷酸修饰的缀合物组分接触，并且使多个多核苷酸修饰的结合分子的分子中的至少一个不同的多核苷酸修饰的结合分子的分子与包含至少部分单链核酸接头的第二多核苷酸修饰的缀合物组分接触，其中第一和第二多核苷酸修饰的缀合物组分包含检测标记，并且至少其检测标记不同，其中结合分子的分子的核酸接头的单链序列的至少一部分与第一和/或第二缀合物组分的核酸接头的单链顺序互补，并且其中当接触时，使核酸接头退火，以形成将结合分子的分子连接到缀合物组分的双链接头。
[0009]
本文提供一种用于检测的标记结合分子的高速产生方法，其中不同的结合分子用相同的缀合物组分标记，所述方法包含：(a)将至少部分单链核酸接头附接到至少两种不同的结合分子，以产生至少两种不同的多核苷酸修饰的结合分子；和(b)使至少两种不同的多核苷酸修饰的结合分子与包含检测标记并且包含至少部分单链核酸接头的多核苷酸修饰的缀合物组分接触，其中结合分子的核酸接头的单链序列的至少一部分与缀合物组分的核酸接头的单链序列互补，并且其中当接触时，使核酸接头退火，以形成将结合分子连接到缀合物组分的双链接头。
[0010]
本文提供一种组合物，其包含：(i)(a)包含至少部分单链核酸接头的底物，其中底物为结合分子或珠粒，和(i)(b)包含至少部分单链核酸接头的缀合物组分，其中底物的核酸接头的单链序列的至少足够的部分与缀合物组分的核酸接头的单链序列的一部分互补，以允许接头退火并且形成将底物连接到缀合物组分的至少部分双链接头；(ii)(a)包含核酸接头的底物，其中底物为结合分子或珠粒，和(ii)(b)能够附接到核酸接头以将底物连接
到缀合物组分的缀合物组分；(iii)(a)包含核酸接头的缀合物组分，(iii)(b)能够附接到核酸接头以将缀合物组分连接到底物的底物；(iv)(a)能够附接到核酸接头的底物，其中底物为结合分子或珠粒，和能够附接到核酸接头的缀合物组分，和(iv)(b)核酸接头，其中核酸接头为单链的，包含双链片段，或其中核酸接头为完全双链的；或(v)(a)包含至少部分单链核酸接头的底物，其中底物为结合分子或珠粒，(v)(b)包含至少部分单链核酸接头的缀合物组分；和(v)(c)另一核酸接头片段，其中(v)(a)、(v)(b)和(v)(c)可退火以形成包含(v)(a)、(v)(b)和(v)(c)并且将(v)(a)连接到(v)(b)的至少部分双链核酸接头。
[0011]
本文提供一种标记细胞、组织和/或器官的方法，所述方法包含使细胞、组织和/或器官与本公开的多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物接触，其中生物缀合物的结合分子部分与细胞、组织和/或器官的抗原、表位和/或半抗原结合，并且其中生物缀合物的缀合物组分部分包含可检测标记。
[0012]
本文提供一种定量测量来自标记的细胞、组织和/或器官的信号的方法，所述方法包含：使细胞、组织和/或器官与本公开的多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物接触，其中生物缀合物的结合分子部分与细胞、组织和/或器官的抗原、表位和/或半抗原结合，并且生物缀合物的缀合物组分部分包含可检测标记；和测量多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物的存在，其中结合分子的dol为已知的，由此允许进行定量测量。
[0013]
本文提供一种试剂盒，其包含产生本公开的多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物、产生本公开的多核苷酸修饰的珠粒生物缀合物、产生本公开的组合物，或执行本公开的方法中的任一种所需要的一种或多种组分。
附图说明
[0014]
图1.图1示出本公开的多核苷酸修饰的抗体生物缀合物的组成部分的说明性实例(多核苷酸修饰的抗体、具有互补核酸链的双链多核苷酸接头，和多核苷酸修饰的缀合物组分)。
[0015]
图2.图2示出本公开的多核苷酸修饰的抗体生物缀合物的组成部分的另一个说明性实例(多核苷酸修饰的抗体、具有互补的polya和polyt核酸链的双链多核苷酸接头，和寡核苷酸类荧光标记)。
[0016]
图3.图3说明用于产生本公开的多核苷酸修饰的抗体生物缀合物的方法。
[0017]
图4.图4示出用不同标记来标记的相同抗体、用相同标记来标记的不同抗体，和用不同标记来标记的不同抗体的高速产生方法。
[0018]
图5.图5示出与本公开的方法相比，通过常规缀合方法获得的每个抗体的标记分布的比较。
[0019]
图6.图6示出本公开的多核苷酸修饰的珠粒生物缀合物的组成部分的说明性实例(多核苷酸修饰的珠粒、具有互补的polya和polyt核酸链的双链多核苷酸接头，和多核苷酸修饰的缀合物组分)。
[0020]
图7.图7示出本公开的多核苷酸修饰的珠粒生物缀合物的说明性实例，其包含珠粒和经由多核苷酸接头连接到珠粒的两个寡核苷酸类荧光标记。
[0021]
图8.图8示出可如何通过控制附接到珠粒的标记/染料的数量进行定量测量。
[0022]
图9.图9示出传统的对照珠粒(左)和phiton标记嵌入的和/或外部标记的珠粒。
[0023]
图10.图10说明通过将过量多核苷酸修饰的缀合物组分的单链核酸接头部分退火成结合到珠粒的互补核酸链来去除未连接到多核苷酸修饰的抗体的过量多核苷酸修饰的缀合物组分的纯化方法。
[0024]
图11.图11示出使用本文所描述的方法(聚脱氧胸苷)与抗-cd3抗体缀合的phiton标记(novablue 610)对与独特鉴定“条形码”序列缀合的性能比较(染色外周血单核细胞，pmbc)。
[0025]
图12.图12示出使用本文所描述的方法(聚脱氧胸苷)与抗-cd4抗体缀合的phiton标记(novayellow 610)对与独特鉴定“条形码”序列缀合的性能比较(染色外周血单核细胞，pmbc)。
[0026]
图13.图13示出使用本文所描述的方法(聚脱氧胸苷)已分别与抗-cd3和抗-cd4抗体缀合的phiton标记(novablue 610和novayellow 610)对经由独特鉴定“条形码”序列缀合的相同染料的性能比较(染色外周血单核细胞，pmbc)。
[0027]
图14.图14示出荧光团官能化单链dna(ssdna)自组装成本公开的折叠寡核苷酸类荧光标记结构。
[0028]
图15.图15示出联接到dna链以形成寡核苷酸类荧光标记的谐振器网络的示意图。
[0029]
图16.图16示出用于与底物(如珠粒或抗体或衍生物)缀合的标记的试剂盒的示意图。
[0030]
图17.图17示出在将底物连接到缀合物组分的接头中包括额外的核酸分子(加框)的几个说明性实例，其中额外的核酸分子除了附接到底物的接头之外并且除了附接到缀合物组分的接头之外。
[0031]
图18.图18示出(顶部)通过杂交其接头的各自互补单链部分将底物间接连接到缀合物组分，(中间)通过首先将自由接头杂交到附接到缀合物组分或为缀合物组分的延伸的互补接头以形成至少部分双链接头，并且然后将接头的至少一个链直接附接到底物来将底物连接到缀合物组分，和(底部)将附接到缀合物组分或为缀合物组分的延伸的接头直接附接到底物。
具体实施方式
[0032]
定义.
[0033]
应注意，术语“一个(a/an)”(或“一种”)实体是指一个或多个实体；例如“一个接头”被理解为代表一个或多个接头。因此，术语“一个(a/an)”(或“一种(a/an)”)、“一个或多个”(“一种或多种”)以及“至少一个”(“至少一种”)在此可以互换使用。
[0034]
此外，“和/或”在本文中使用时被认为是特定特征或组分中的每一个与或不与另一特定特征或组分的具体公开。因此，本文在如“a和/或b”的短语中使用的术语和/或“旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)和“b”(单独)。同样地，在如“a、b和/或c”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施例中的每一个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
[0035]
应理解，无论在何处用语言“包含(comprising或comprises)”描述的方面，还提供另外根据“由
…
组成(consisting of、consists of)”、“基本上由
…
组成(consisting essentially of和/或consists essentially of)”等描述的类似方面。
[0036]
除非另外规定，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本公开所涉及领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。
[0037]
数值范围包括限定范围的数值。即使当没有通过“和其间的任何范围”等明确标识时，其中列举值的列表，例如，1、2、3或4，除非另有说明，否则本公开特别包括值其间的任何范围，包括端点，例如，1至3、1至4、2至3、2至4等。
[0038]
本文提供的标题仅是为了便于参考，并非对本公开的各个方面或方面的限制，其可通过整体参考说明书而获得。
[0039]
如本文所用，“接头”为缀合分子的成分，其目的是将分子的其它成分连接在一起，或当缀合分子的其它成分未连接在一起时，成分的部分出于与另一种成分缀合的目的存在，而且否则将不必存在。举例来说，抗体将不通常或必须具有附接到其的多核苷酸，但是出于本公开的目的，多核苷酸可附接到抗体以形成接头，以将抗体连接到另一个分子，以形成多核苷酸修饰的抗体生物缀合物。
[0040]
如本文所用，术语“非天然存在的”物质、组合物、实体和/或物质、组合物或实体的任何组合，或其任何语法变体为明确排除但仅排除那些被所属领域的普通技术人员充分理解为“天然存在的”，或在或可在由法官或行政或司法机构确定或解释为“天然存在”的任何时间的物质、组合物、实体和/或物质、组合物或实体的任何组合的形式的条件术语。
[0041]
如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸中的任何链或多条链，并且不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白”、“氨基酸链”或用于指两个或更多个氨基酸的一条链或多条链的任何其它术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可代替或与这些术语中的任何一个互换使用。术语“多肽”也旨在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割或非标准氨基酸修饰。多肽可衍生自天然生物来源或通过重组技术产生，但不一定由指定的核酸序列翻译而来。它可以任何方式产生，包括通过化学合成。
[0042]
如本文所用，“蛋白”可指单个多肽，即如上定义的单个氨基酸链，但也可指例如通过二硫键、氢键或疏水相互作用相关联的两个或多个多肽，以产生多聚体蛋白。
[0043]“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指不处于天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。举例来说，分离的多肽可从其原生或天然环境去除。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是分离的，如本文所公开的，已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或基本上纯化的重组多肽也是如此。
[0044]
如本文所用，术语“非天然存在的”多肽或其任何语法变体为明确排除但仅排除那些被所属领域的普通技术人员充分理解为“天然存在的”，或在或可在由法官或行政或司法机构确定或解释为“天然存在”的任何时间的多肽的形式的条件术语。
[0045]
本文公开的其它多肽为上述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，和其任何组合。当提及本文公开的多肽亚基或多聚体蛋白时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”可包括保留完整多肽或蛋白的至少一些活性的任何多肽或蛋白，但这在结构上是不同的。多肽的片段包括例如蛋白水解片段以及缺失片段。变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可自发发生或有意构建。可使用
所属领域已知的诱变技术产生有意构建的变体。变体多肽可包含保守或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。衍生物为已被改变以表现出在天然多肽上未发现的额外特征的多肽。实例包括融合蛋白。衍生物多肽在本文中也可称为“多肽类似物”。如本文所用，“衍生物”可指具有一个或多个通过官能侧基反应化学衍生的氨基酸的主题多肽。还包括作为“衍生物”的是那些含有二十种标准氨基酸的一种或多种标准或合成氨基酸衍生物的肽。举例来说，4-羟基脯氨酸可代替脯氨酸；5-羟基赖氨酸可代替赖氨酸；3-甲基组氨酸可代替组氨酸；高丝氨酸可代替丝氨酸；并且鸟氨酸可代替赖氨酸。
[0046]
如本文所用，术语“结合分子”在其最广义上是指与另一靶分子、部分或抗原特异性结合的分子。结合分子包括可与抗原决定簇，如抗体特异性结合的那些，以及可与受体，如受体配体(例如胃泌素释放肽(grp)和胃泌素释放肽受体(grpr))结合的分子。因此，结合分子的代表性实例包括肽、重组、天然或工程化的受体/配体蛋白、适体、四聚体(具有用于检测t细胞受体的肽的折叠的mhc蛋白)、非抗体蛋白或抗体模拟物，例如人泛素、亲和体、亲和素、α抗体、高亲合性多聚体、菲诺体、kunitz结构域肽、nanoclamps、设计锚蛋白重复蛋白(darpins)、单功能抗体、纳米抗体、抗运载蛋白、亲和抗体和somamers(另外的实例参考在全球生物分析联盟(gbc)和欧洲药品管理局“将关键试剂分类为分析物特异性或结合试剂，特别是抗体；肽；工程蛋白；抗体、蛋白和肽缀合物；试剂药物；适体和抗药物抗体(ada)试剂，包括阳性和阴性对照(king等人2014))。
[0047]
本文公开包含抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的某些结合分子。除非具体指全尺寸抗体，例如天然存在的抗体，否则术语“结合分子”涵盖全尺寸抗体，包括双特异性抗体(例如，包含与第一表位结合的第一结合结构域，和与第二表位结合的第二结合结构域)，以及这类抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或工程化的抗体分子或以类似于抗体分子的方式结合抗原的片段。
[0048]
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构相对较好理解。参见例如harlow等人，《抗体：实验室手册(antibodies:a laboratory manual)》,(冷泉港实验室出版社,第2版。1988)。抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、人类、人源化嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如fab、fab'和f(ab')2、fd、fvs、单链fvs(scfv)、单链抗体、二硫键连接的fvs(sdfv)、包含vl或vh结构域的片段、由fab表达文库产生的片段。scfv分子为所属领域已知的并且描述于例如美国专利5,892,019中。本公开所涵盖的免疫球蛋白或抗体分子可为任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类的免疫球蛋白分子。
[0049]
如本文所用，术语“嵌合抗体”将被认为意指任何抗体，其中免疫反应区或位点从第一物种获得或衍生，而恒定区(可为完整的、部分的或经过修饰的)从第二物种获得。在一些实施例中，靶结合区或位点将来自非人来源(例如小鼠或灵长类动物)并且恒定区为人类的。
[0050]
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指在单个抗体分子内具有针对两种不同抗原的结合位点的抗体。应了解，除了标准抗体结构之外，可构建具有两种结合特异性的其它分子。还应了解，双特异性抗体的抗原结合可为同时的或顺序的。三体杂交瘤(triomas)和杂交杂交瘤为可分泌双特异性抗体的细胞系的两个实例。双特异性抗体也可通过重组方式构
建。(和heiss,《未来肿瘤学(future oncol.)》6:1387-94(2010)；mabry和snavely,《药物研究杂志(idrugs.)》13:543-9(2010))。双特异性抗体也可为双抗体。
[0051]
如本文所用，术语“工程化的抗体”是指其中重链和轻链或两者中的可变域通过至少部分替换来自已知特异性的抗体的一个或多个cdr并且通过部分框架区替换和序列改变而改变的抗体。尽管cdr可衍生自与衍生框架区的抗体相同类别或甚至亚类的抗体，但是可设想cdr将衍生自不同类别的抗体，例如衍生自来自不同的物种的抗体。其中来自已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”cdr被移植到人类重链或轻链框架区中的工程化的抗体在本文中被称为“人源化抗体”。在一些情况下，并非所有cdr都被来自供体可变区的完整cdr替换，以将一个可变域的抗原结合能力转移到另一个可变域；实际上，维持靶结合位点活性的最少氨基酸被转移。给出在例如美国专利第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号和第6,180,370号中阐述的解释，所属领域技术人员完全有能力通过进行常规实验或通过反复试验测试来获得功能性工程化或人源化抗体。
[0052]
术语“多核苷酸”旨在涵盖单数核酸以及复数核酸，其中“核酸”是指例如dna或rna或其类似物，如包含合成碱基。在某些实施例中，多核苷酸或核酸为dna。在其它实施例中，多核苷酸可为rna。核酸或多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，例如在肽核酸(pna)中发现的)。“分离的”核酸或多核苷酸指已经从其天然环境中去除的核酸分子，例如dna或rna，如分离的核酸分子或构建体，例如信使rna(mrna)或质粒dna(pdna)。举例来说，编码包含在载体中的多肽亚基的重组多核苷酸被认为是如本文所公开的分离的。分离的多核苷酸的另外的实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或在溶液中纯化的(部分或基本上)多核苷酸。分离的rna分子包括多核苷酸的体内或体外rna转录物。分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的这类分子。此外，多核苷酸或核酸可为或可包括调节元件，如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
[0053]
如本文所用，术语“非天然存在的”多核苷酸或其任何语法变体为明确排除但仅排除那些被所属领域的普通技术人员充分理解为“天然存在的”，或在或可在由法官或行政或司法机构确定或解释为“天然存在”的任何时间的多核苷酸的形式的条件术语。
[0054]
如本文所用，术语“治疗(treat/treatment)”或
“…
的治疗”(例如，在短语“治疗受试者”中)是指降低疾病病理的可能性，减少疾病症状的发生，例如达到受试者具有更长的存活率或减少的不适的程度。举例来说，治疗可指当向受试者给药时疗法减轻疾病症状、病征或原因的能力。治疗还指减轻或减少至少一种临床症状和/或抑制或延迟病况的进展和/或预防或延迟疾病或病痛的发作。
[0055]“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，尤其是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、家畜、农畜、运动动物和动物园动物，包括例如人类、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、骆驼、熊、等。哺乳动物受试者还包括野生动物，如大象、长颈鹿、鹿、袋鼠、大型猫科动物等。
[0056]
术语“药物组合物”是指呈允许活性成分的生物活性有效，并且不含对将被给药所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的额外组分的形式的制剂。这类组合物可为无菌的。
[0057]
如本文所公开的试剂的“有效量”为足以实现具体规定目的的量。“有效量”可根据经验并以常规方式确定，与所述目的相关。
[0058]
如本文所用，术语“生物缀合物”涉及生物接头(即，核酸接头)的使用并且指经由核酸接头连接到缀合物组分(如本文任何地方公开)的底物分子(例如，如本文其它地方所描述的结合分子或珠粒)，与底物分子和/或缀合物组分的生物或合成源无关。
[0059]
如本文所用，术语“珠粒”是指“聚苯乙烯微球”并且术语通篇可互换使用。在某些实施例中，标记(例如phitons)可通过形成具有掺杂剂的聚合物微球而被内化为珠粒。
[0060]
如本文所用，“phiton”为由北卡罗来纳州达勒姆的phitonex公司(phitonex,inc.,durham,north carolina)生产的寡核苷酸类的纳米粒子。
[0061]
如本文所用，除非另外说明，否则“互补碱基配对”是指a/t、a/u或c/g碱基配对和相应的合成或非标准核苷酸配对，例如异胞嘧啶/异鸟嘌呤(isoc/isog)。就胸苷(t)被指定为核酸中的碱基来说，出于简化本公开的目的，除非另外说明，否则应理解为如果核酸为rna，那么尿嘧啶(u)为预期的。
[0062]
除非在特定上下文中另外说明，否则术语“与
…
缀合”和“连接到”在本文中可互换使用。
[0063]
如本文所用，首字母缩略词“sku”是指“库存单位”。
[0064]
如本文所用，“至少部分单链”核酸等可为完全单链的或可包含单链和双链部分但不为完全双链的。“至少部分双链”、“包含双链片段”等的核酸可为完全双链的或可包含单链和双链部分但不完全为单链的。本领域普通技术人员将认识到，当元件(例如底物或缀合物组分)的核酸接头旨在与另一元件的核酸接头杂交时，单链部分或每个接头的长度和连续性足以允许杂交。
[0065]
概述.
[0066]
本文提供一种用于创建如本文任何地方所述的生物缀合物的方法，所述生物缀合物稳定、化学上不苛刻并且足够有效以在某些实施例中排除纯化。在某些实施例中，方法不涉及任何生物不相容的试剂、在生理条件外的ph变化、高温或高盐浓度。另外(如在下文实例2中所示)，在某些实施例中，由于接头的高热力学稳定性，在溶液中没有物种交换。方法对于制造来说也是快速且可扩展的，并且可用于将各种分子彼此配对和连接在一起。
[0067]
本公开的一个重要方面涉及通过消除每个缀合物-抗体对对许多独特接头的需要来减少与产品线相关的后勤开销。这可对制造规模具有显著影响(例如，具有多核苷酸的每个染料仅具有1sku)并快速将这些染料与抗体缀合(具有互补多核苷酸的每个抗体1sku)。举例来说，在创建phiton抗体生物缀合物文库时，每个phiton可用相同的多核苷酸修饰，并且每个抗体可用相同的互补多核苷酸修饰，而不是每个phiton抗体生物缀合物需要独特的互补多核苷酸的集合。
[0068]
本文还提供用于使例如寡核苷酸类荧光标记(例如phiton)与抗体(或其它分子)缀合的试剂盒。
[0069]
某些实施例涉及多核苷酸修饰的底物生物缀合物(也被称为多核苷酸修饰的生物缀合物)，其包含经由核酸接头连接到缀合物组分的底物，其中核酸接头在下文详细描述。在某些实施例中，底物为结合分子。在某些实施例中，底物为珠粒(也称为聚苯乙烯微球)。
[0070]“多核苷酸修饰的结合分子”意指核酸/多核苷酸所附接的结合分子。尽管不是限制性的，但是所属领域的普通技术人员将熟悉多种缀合化学，如nhs-酯、马来酰亚胺和“点击”，其可用于将核酸附接到其它分子，如蛋白质/抗体，即，制备本公开的多核苷酸修饰的
结合分子。因此，“多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物”为连接到缀合物组分的多核苷酸修饰的结合分子。
[0071]“多核苷酸修饰的珠粒”意指核酸/多核苷酸所附接的珠粒。尽管不是限制性的，但是所属领域普通技术人员将熟悉使珠的表面功能化以添加多核苷酸，例如使用针对抗体-多核苷酸缀合描述的相同化学。因此，“多核苷酸修饰的珠粒生物缀合物”为连接到缀合物组分的多核苷酸修饰的珠粒。在某些实施例中，核酸为单链的并且在其5'-末端处附接到珠粒。在某些实施例中，核酸为单链的并且在其3'-末端处附接到珠粒。
[0072]
所属领域的普通技术人员将理解，核酸分子可为单链、双链或包含单链和双链片段。另外，核酸分子还可包含三链和较少组织的形式。在某些实施例中，核酸接头包含单链片段或由单链片段组成。在某些实施例中，核酸接头包含双链片段或由双链片段组成。在某些实施例中，核酸接头具有单链和双链片段。在某些实施例中，接头不含所属领域的普通技术人员已知的用于rna破坏、rna测序或“条形码”的核酸序列(“条形码”序列是一种独特的多核苷酸序列，用于所属领域的技术人员已知的用途，例如用于使用来自特定的一种或多种基因的dna的短区段的物种鉴定)。
[0073]
虽然可使来自底物的核酸接头链和来自缀合物组分的核酸接头链的互补碱基/片段退火以将底物连接到缀合物组分，但是应理解，在某些实施例中，底物的核酸接头链不附接和/或共价键合到缀合物组分。在某些实施例中，缀合物组分的核酸接头链不附接和/或共价键合到底物。在某些实施例中，底物的核酸接头链不附接和/或共价键合到缀合物组分，并且缀合物组分的核酸接头链不附接和/或共价键合到底物。因此，在某些实施例中，底物和缀合物组分不通过任何连接彼此共价键合，而是通过核酸接头的退火部分保持在一起。在某些实施例中，核酸在其5'-末端处附接到底物。在某些实施例中，核酸在其5'-末端处附接到缀合物组分或为5'-末端的延伸。在某些实施例中，核酸在其3'-末端处附接到底物。在某些实施例中，核酸在其3'-末端处附接到缀合物组分或为3'-末端的延伸。
[0074]
核酸接头可为任何长度，但可考虑某些因素。举例来说，极短的接头可使抗体或珠粒与缀合物组分接触得太近，导致空间位阻或其它干扰。另一方面，很长的接头可更难产生或可不将抗体或珠粒保持在染料或标记的足够距离内，使得染料或标记的信号不准确归因于附接的抗体或珠粒。在某些实施例中，核酸接头为至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、65、70或75个核苷酸长。在某些实施例中，核酸接头为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50或60个核苷酸长中的任一种至约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60或75个核苷酸长中的任一种；在某些实施例中，核酸接头为约10、15、20、25、30、35、40或50个核苷酸长中的任一种至约15、20、25、30、35、40、50或75个核苷酸长中的任一种。在某些实施例中，核酸接头为约15、20、25、30或35个核苷酸长中的任一种至约20、25、30、35或40个核苷酸长中的任一种。在某些实施例中，缀合物组分包含核酸或由核酸组成。在某些实施例中，核酸接头可为缀合物组分的核酸分子的延伸。出于本公开的目的，应理解，即使当缀合物组分本身包含一种或多种核酸分子或完全由一种或多种核酸分子制成时，当包含核酸接头序列时，其视为“多核苷酸修饰的缀合物组分”。举例来说，在缀合物组分为寡核苷酸类荧光标记物(例如phiton)的情况下，接头的长度由缀合物组分的“边缘”确定，其中边缘确定为比四个核苷酸长的任何单链片段的末端。在其中缀合物组分包含核酸的某些实施例中，缀合物组分的核酸的长度为至少10、15、20、
25、30、35、40、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、300、400、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、7500或10000个核苷酸，或其间的任何范围，不包括核酸接头。在其中缀合物组分包含核酸的某些实施例中，缀合物组分的核酸的长度为至少10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、300或400个核苷酸，或其间的任何范围，不包括核酸接头。在其中缀合物组分包含核酸的某些实施例中，缀合物组分的核酸的长度为至少20、25、30、35、40、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、110或120个核苷酸，或其间的任何范围，不包括核酸接头。在其中缀合物组分包含核酸的某些实施例中，缀合物组分的核酸具有三级和/或四级结构。如所提到，核酸接头可包括单链和双链片段。在某些实施例中，核酸接头的双链片段为至少约10、15、20、25、30、35、40、50、60、65、70或75个核苷酸长。在某些实施例中，核酸接头的双链片段为约10、15、20、25、30、35、40、50或60个核苷酸长中的任一种至约15、20、25、30、35、40、50、60或75个核苷酸长中的任一种。所属领域普通技术人员将认识到，虽然双链核酸通常被认为由互补碱基对的退火序列构成，但并非双链核酸片段中的所有配对都需要是互补的。对于包含互补碱基的两条核酸链退火以形成并入一些非互补碱基配对的双链核酸存在一定的耐受性。而且，还存在可与多种碱基配对的简并(通用)碱基，如脱氧肌苷。在某些实施例中，核酸接头的双链片段包含至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个互补碱基对，即使双链片段不完全由互补碱基对构成。在某些实施例中，核酸接头的双链片段包含约10、15、20、25、30、35、40、50或60个互补碱基对中的任一种至约15、20、25、30、35、40、50、60或75个互补碱基对中的任一种，即使双链片段不完全由互补碱基对构成。在某些实施例中，核酸接头的至少85％、90％、95％或98％的双链片段为互补碱基配对的。在某些实施例中，核酸接头的双链片段具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个错配碱基对。然而，在某些实施例中，100％的双链片段为互补碱基配对的。在某些实施例中，双链片段包含至少约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60或75个连续互补碱基对，或约7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50或60个连续互补碱基对中的任一种至约8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60或75个连续互补碱基对中的任一种。
[0075]
虽然不限于任何特定的互补序列，但是在某些实施例中，核酸接头可包含互补的聚腺苷(polya)和聚脱氧胸苷(polyt)序列和/或互补的聚胞嘧啶(polyc)和聚胍(polyg)序列。举例来说，已知核酸的c:g含量是双链相互作用的关键热力学决定因素。在某些实施例中，核酸接头的双链片段包含在一条链中的polya序列和在另一条链中的聚胸苷polyt序列。在某些实施例中，核酸接头的双链片段包含在一条链中的polyc序列和在另一条链中的polyg序列。在某些实施例中，核酸接头的双链片段包含在一条链中的polya和polyc序列和在另一条链中的polyt和polyg序列。在某些实施例中，核酸接头的双链片段包含在一条链中的polya和polyg序列和在另一条链中的polyt和polyc序列。在某些实施例中，核酸接头的双链片段包含在一条链中的polya、polyt、polyc和/或polyg序列和在另一条链中的polyt、polya、polyg和/或polyc序列。在某些实施例中，核酸接头的双链片段由在一条链中的聚腺苷序列(polya)和在另一条链中的聚胸苷序列(polyt)组成。在某些实施例中，核酸接头的双链片段由在一条链中的聚胞嘧啶序列(polyc)和在另一条链中的聚胍序列(polyg)组成。阅读本公开的所属领域的普通技术人员将理解，预期本文中任何实施例的任何核酸接头可具有上述组合物。
[0076]
虽然不限于任何特定的互补序列，但是在某些实施例中，核酸接头包含独特的鉴定序列。出于核酸接头的目的，“独特的鉴定序列”为可用于区分一个或多个物种的寡核苷酸序列，例如互补引物序列可与其结合以用于下游扩增(例如通过pcr)、长读取测序或下一代测序(ngs)，或替代地可使用互补序列进行探测，例如通过荧光原位杂交(fish)。在某些实施例中，核酸接头双链片段包含独特的鉴定序列。在某些实施例中，独特的鉴定序列可用于核酸扩增，如通过pcr。在某些实施例中，独特的鉴定序列可用于下一代测序(ngs)。在某些实施例中，核酸接头包含能够实现其在下游测序应用中被过滤掉的序列。举例来说，其中通过使用独特的序列，例如互补引物序列可结合的序列，在测序中所述序列与其它核苷酸序列为可区分的，能够实现过滤所有带接头标签的物种，以从下游分析排除。在某些实施例中，核酸接头包含用于通过第三生物分子特异性结合和/或用于通过酶切割(例如，crispr、锌指核酸酶、限制酶)进行靶基因编辑的序列。举例来说，其中序列被设计为能够实现通过crispr grna进行靶向，并且此靶向并且被crispr切割，或例如，其中锌指核酸酶的dna结合结构域的靶位点，或替代地，被限制酶例如ecori核酸内切酶(其切割dna序列gaattc)特异性靶向切割。在某些实施例中，核酸接头包含一个或多个能够实现酶或结合活性的独特的序列。在某些实施例中，在双链片段中存在能够实现酶或结合活性的独特的序列。
[0077]
在某些实施例中，核酸接头可包含一个或多个未附接到底物或缀合物组分的核酸分子。举例来说，额外的核酸分子可充当“桥”，使附接到底物的核酸接头和附接到缀合物组分或为缀合物组分的延伸的核酸接头在一起。在某些实施例中，额外的核酸可为缀合物组分或底物的第二附接点。额外的核酸分子还可附接到额外的组分，如额外的底物或新增的缀合物组分，将第一底物和第一缀合物组分与第二底物或另外的底物和/或第二缀合物组分或另外的缀合物组分连接在一起(图17)。在某些实施例中，核酸接头包含(i)附接到底物的部分，(ii)附接到缀合物组分或为缀合物组分的延伸的部分，和(iii)至少一个不是(i)或(ii)的额外的部分。在某些实施例中，(iii)为附接到缀合物组分或为缀合物组分的延伸或附接到额外的缀合物组分或为额外的缀合物组分的延伸的第二部分。在某些实施例中，(iii)为附接到底物或附接到额外的底物的第二部分。
[0078]
如本公开中所使用，除非在特定上下文中另外具体说明，否则术语“缀合物组分”是指经由如本文中所公开的核酸接头连接到底物(例如结合分子或珠粒)以形成生物缀合物的任何成分。缀合物组分的代表性实例包括抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物、核酸、适体、蛋白、染料或标记、小分子、治疗性肽、受体配体、药物活性剂或寡核苷酸类荧光标记在某些实施例中，例如其中缀合物组分为连接到另一种抗体的抗体，哪种抗体为缀合物组分之间的区别不限制两者通过核酸接头连接的情况。在某些实施例中，缀合物组分为寡核苷酸类荧光标记。举例来说，在某些实施例中，缀合物组分为如本文其它地方定义的phiton。如在某些实施例中，缀合物组分包含或为核酸，并且接头为核酸，在某些实施例中，接头为缀合物组分的核酸链的延伸，而不是“附接到”缀合物组分，如例如，核酸接头将附接到抗体或珠粒。
[0079]
在某些实施例中，结合分子或珠粒的标记度(dol)(在所属领域中也称为染料比蛋白(d:p)或荧光团比蛋白(f:p))化学计量地控制。举例来说，这可经由待附接的核酸的可用性来实现。在某些实施例中，结合分子的dol在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任一个和2、3、4、5、6、7、8、9、10或11中的任一个之间。在某些实施例中，结合分子或珠粒的dol为1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在多核苷酸修饰的结合分子上的核酸的dol可与缀合物组分的dol无关，并且在某些实施例中为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，或其间的任何范围，包括终点。在某些实施例中，珠粒的dol在约100、1,000、10,000或100,000中的任一个和约1,000、10,000、100,000或1,000,000中的任一个之间。在某些实施例中，在多核苷酸修饰的珠粒上的核酸的标记度(dol)与缀合物组分的dol无关。
[0080]
本公开的多核苷酸修饰的生物缀合物预期用于多种应用。举例来说，在某些实施例中，生物缀合物可用于特异性地标记细胞、组织和/或器官，以用于流式细胞术、抗体筛选、elisa或其它夹心测定、免疫监测、生物标志物测定、横向流动、床旁检测/快速诊断、成像、显微镜、分子诊断、下一代测序、长读取测序、原位测序、聚合酶链反应、微阵列、核酸测序、氨基酸测序、数字病理学、dna印迹法、rna印迹法、蛋白质印迹法，作为参考样品，如对照或用于校准器械、测定或系统，或预防性和/或治疗性目的中的一种或多种。
[0081]
本文提供用于产生多核苷酸修饰的生物缀合物如本公开的多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物和多核苷酸修饰的珠粒生物缀合物的方法。在某些实施例中，方法包含使包含至少部分或完全单链的核酸接头的多核苷酸修饰底物与具有至少部分或完全单链核酸接头的多核苷酸修饰的缀合物组分接触(图18，顶部)。在某些实施例中，底物为结合分子。在某些实施例中，底物为珠粒。在某些实施例中，为了形成双链核酸接头，底物的单链接头序列的至少一部分与缀合物组分的单链接头序列的一部分互补。当接触时，可使底物的核酸接头和缀合物组分的核酸接头退火以形成将底物连接到缀合物组分的至少部分双链接头。许多可能的底物，如结合分子(例如，抗体)或珠粒，可能需要化学附接核酸接头。因此，在某些实施例中，在使多核苷酸修饰的底物和多核苷酸修饰的缀合物组分接触之前，方法包含将核酸接头附接到底物以形成多核苷酸修饰的底物的步骤。在某些实施例中，在使多核苷酸修饰的底物和多核苷酸修饰的缀合物组分接触之前，方法包含将核酸接头附接到缀合物组分以形成多核苷酸修饰的缀合物组分的步骤。
[0082]
在用于产生多核苷酸修饰的生物缀合物的某些实施例中，方法包含使底物与缀合物组分接触，其中底物为结合分子或珠粒，并且将核酸接头附接到底物并且将同一核酸接头附接到缀合物组分，以形成多核苷酸修饰的生物缀合物。在某些实施例中，核酸接头为单链的，包含双链片段，或核酸接头为完全双链的。在某些实施例中，核酸接头包含双链片段，或核酸接头为完全双链的，并且方法包含在附接到底物和缀合物组分之前使核酸链杂交以形成至少部分双链核酸接头。
[0083]
在用于产生多核苷酸修饰的生物缀合物的某些实施例中，方法包含使包含核酸接头的多核苷酸修饰的缀合物组分与底物接触，其中底物为结合分子或珠粒，并且将多核苷酸修饰的缀合物组分的核酸接头附接到底物，以形成多核苷酸修饰的生物缀合物。在某些实施例中，核酸接头为单链的，包含双链片段，或核酸接头为完全双链的。在某些实施例中，核酸接头为单链(图18，底部)，在某些实施例中，核酸接头包含双链片段或核酸接头为完全双链的，并且在将多核苷酸修饰的缀合物组分的核酸接头附接到底物以形成多核苷酸修饰的生物缀合物(图18，中间)之前，方法包含使核酸链杂交，以在多核苷酸修饰的缀合物组分上形成至少部分双链核酸接头。
[0084]
在用于产生多核苷酸修饰的生物缀合物的某些实施例中，方法包含使包含核酸接头的多核苷酸修饰的底物与缀合物组分接触，其中底物为结合分子或珠粒，并且将多核苷
酸修饰的底物的核酸接头附接到缀合物组分，以形成多核苷酸修饰的生物缀合物。在某些实施例中，核酸接头为单链的，包含双链片段，或核酸接头为完全双链的。在某些实施例中，核酸接头为单链的。在某些实施例中，核酸接头包含双链片段，或核酸接头为完全双链的，并且在将多核苷酸修饰的底物的核酸接头附接到缀合物组分以形成多核苷酸修饰的生物缀合物之前，方法包含使核酸链杂交，以在多核苷酸修饰的底物上形成至少部分双链核酸接头。
[0085]
在用于产生多核苷酸修饰的生物缀合物的某些实施例中，方法包含使(i)包含至少部分或完全单链核酸接头的多核苷酸修饰的底物，其中底物为结合分子或珠粒，(ii)包含至少部分或完全单链核酸接头的多核苷酸修饰的缀合物组分，和(iii)不是(i)或(ii)的核酸接头的另一至少部分单链核酸接头片段接触。底物的单链接头序列的至少一部分与另一核酸接头片段(iii)的单链部分互补和/或缀合物组分的单链接头序列的至少一部分与另一核酸接头片段(iii)的单链部分互补，并且因此当接触时，使底物的核酸接头、缀合物组分的核酸接头，和另一核酸接头片段退火，以形成将底物连接到缀合物组分的至少部分双链接头。在某些实施例中，在使(i)、(ii)和(iii)接触之前，方法包含将至少部分或完全单链核酸接头附接到底物以形成多核苷酸修饰的底物的步骤。在某些实施例中，在使(i)、(ii)和(iii)接触之前，方法包含将至少部分或完全单链核酸接头附接到缀合物组分以形成多核苷酸修饰的缀合物组分的步骤。
[0086]
对于以上任何一种，将多核苷酸附接到分子(如蛋白质或抗体)的方法为已知的，并且包括但不限于缀合化学如nhs-酯、马来酰亚胺和“点击”。将多核苷酸附接到珠粒的方法为已知的，并且包括使珠粒的表面功能化以添加多核苷酸，例如使用针对蛋白-多核苷酸缀合所述的相同化学。如本文其它地方所述，可化学计量地控制结合分子或珠粒的dol以控制附接的多核苷酸的数量。还如本文其它地方详细描述，多核苷酸修饰的底物的核酸接头序列可包含polya、polyt、polyc和/或polyg序列或由其组成，并且经过修饰的缀合物组分的核酸接头序列可包含polya、polyt、polyc和/或polyg序列或由其组成。还如本文其它地方所述，核酸接头可包含独特的鉴定序列。
[0087]
本文还提供产生用于检测的标记底物的方法。出于说明性目的，底物在下文被称为结合分子，但不限于结合分子。在某些实施例中，方法为高速方法。在某些实施例中，相同结合分子的单独的结合分子的分子用不同的缀合物组分标记。出于描述这类方法(和下文方法)的目的，“结合分子”是指一种类型的结合分子，例如抗cd4抗体或抗β淀粉样蛋白抗体，并且“结合分子的分子”为所述类型的结合分子的单个分子。例如，在图4中，“ab
1”、“ab
2”和“ab
n”为不同类型的结合分子，“ab
1-n
1”、“ab
1-n
2”和“ab
1-n
m”为ab1结合分子的不同结合分子的分子(具有不同的标记“n
1”、“n
2”和“n
m”)。同样地，“ab
2-n
1”、“ab
2-n
2”和“ab
2-n
m”为具有不同标记等的ab2结合分子的不同结合分子的分子等。在某些实施例中，方法包含：(a)将至少部分或完全单链核酸接头附接到相同结合分子的至少两个单独的结合分子的分子以产生多个多核苷酸修饰的结合分子的分子，并且然后(b)使多个多核苷酸修饰的结合分子的分子中的至少一个多核苷酸修饰的结合分子的分子与包含至少部分或完全单链核酸接头的第一多核苷酸修饰的缀合物组分接触，并且使多个多核苷酸修饰的结合分子的分子中的至少一个不同多核苷酸修饰的结合分子的分子与包含至少部分或完全单链核酸接头的第二多核苷酸修饰的缀合物组分接触，其中第一和第二多核苷酸修饰的缀合物组分包含检测
标记，并且至少其检测标记不同。所属领域普通技术人员将理解，进行步骤(a)的一方可与进行步骤(b)的一方分离。因此，在某些实施例中，方法包含使多个多核苷酸修饰的结合分子的分子中的至少一个多核苷酸修饰的结合分子的分子与包含至少部分或完全单链核酸接头的第一多核苷酸修饰的缀合物组分接触，并且使多个多核苷酸修饰的结合分子的分子中的至少一个不同多核苷酸修饰的结合分子的分子与包含至少部分或完全单链核酸接头的第二多核苷酸修饰的缀合物组分接触，其中第一和第二多核苷酸修饰的缀合物组分包含检测标记，并且至少其检测标记不同，其中已制备多个多核苷酸修饰的结合分子的分子。与本公开的方面一致，结合分子的分子的单链核酸接头序列的至少一部分与第一和/或第二缀合物组分的单链核酸接头序列的一部分互补，并且当接触时，使结合分子的分子的单链核酸接头序列和缀合物组分的单链核酸接头序列退火，以形成将结合分子的分子连接到缀合物组分的双链接头。在某些实施例中，使多个多核苷酸修饰的结合分子的分子中的额外的多核苷酸修饰的结合分子的分子与一种或多种具有不同检测标记(例如，“ab
1-n
1”、“ab
1-n
2”和“ab
1-n
m”(图4)接触。在某些实施例中，多个多核苷酸修饰的结合分子的分子中的至少三、四、五、六、七、八、九或十个多核苷酸修饰的结合分子的分子各自与具有与其它不同的检测标记的多核苷酸修饰的缀合物组分接触。在某些实施例中，结合分子为抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。
[0088]
所属领域的普通技术人员将理解，除了上文示例性高速方法之外，其中底物和缀合物组分通过其各自的接头杂交“间接”接合，类似的高速标记可通过并入产生本文所描述的多核苷酸修饰的生物缀合物的各种其它方法中的任一种来实现，使得相同结合分子的单独的结合分子的分子用不同的缀合物组分标记。举例来说，在某些实施例中，产生用于检测的标记结合分子的高速方法，其中相同结合分子的单独的结合分子的分子用不同的缀合物组分标记，包含(a)获得相同结合分子的多个结合分子的分子和(b)将第一多核苷酸修饰的缀合物组分的核酸接头附接到多个结合分子的分子的至少一个结合分子的分子，并且将第二多核苷酸修饰的缀合物组分的核酸接头附接到多个结合分子的分子中的至少一个不同结合分子的分子，其中第一和第二多核苷酸修饰的缀合物组分包含检测标记并且至少其检测标记不同，使得相同结合分子的单独的结合分子的分子用不同的缀合物组分标记。核酸接头可为单链的，包含双链片段，或为完全双链的。在某些实施例中，核酸接头包含双链片段或核酸接头为完全双链的，并且在将多核苷酸修饰的缀合物组分的核酸接头附接到结合分子的分子以形成多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物之前，方法包含使核酸链杂交，以形成至少部分双链核酸接头。在某些实施例中，将多个结合分子的分子中的一个或多个额外的结合分子的分子附接到具有不同检测标记的一个或多个额外的多核苷酸修饰的缀合物组分。在某些实施例中，多个结合分子的分子中的至少三、四、五、六、七、八、九或十个结合分子的分子各自与具有与其它不同的检测标记的多核苷酸修饰的缀合物组分接触。并且，在某些实施例中，结合分子为抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。
[0089]
为了实现单独标记，某些实施例包含将多个结合分子的分子中的结合分子的分子或多个多核苷酸修饰的结合分子的分子中的多核苷酸修饰的结合分子的分子分配、等分等到单独的隔室中，以在每个隔室中与独特标记的多核苷酸修饰的缀合物组分接触，由此产生相同结合分子的不同标记的结合分子。所属领域的普通技术人员将理解，分配/等分可手动完成，如将试剂移液到单独的管中，或通过如自动流体处理器的系统来完成，所述系统可
以高速率将试剂等分到大量的瓶，或组织培养型板的单独孔，或其它容器。
[0090]
这类方法的一个显著优点是它可减少对多个接头分子的设计、生产、组织、存储等的要求。在某些实施例中，多个结合分子的分子中的至少部分或完全单链核酸接头对于所有多核苷酸修饰的结合分子的分子为相同的，并且因此缀合物组分的至少部分或完全单链核酸接头对于所有多核苷酸修饰的缀合物组分也可为相同的。
[0091]
类似地，本文提供产生用于检测的标记结合分子的方法，然而，其中不同的结合分子用相同的缀合物组分(但不是相同的缀合物组分分子)标记。这在图4中说明，例如，“ab
1-n
1”、“ab
2-n
1”和“ab
n-n
1”为用相同标记(“n
1”)标记的不同结合分子(“ab
1”、“ab
2”和“ab
n”)。在某些实施例中，方法为高速方法。在某些实施例中，方法包含：(a)将至少部分或完全单链核酸接头附接到至少两种不同的结合分子，以产生至少两种不同多核苷酸修饰的结合分子，和(b)使至少两种不同的多核苷酸修饰的结合分子与包含检测标记并且包含至少部分或完全单链核酸接头多核苷酸修饰的缀合物组分接触。如上所述，所属领域普通技术人员将理解，进行步骤(a)的一方可与进行步骤(b)的一方分离。因此，在某些实施例中，方法包含使至少两种不同多核苷酸修饰的结合分子与包含检测标记并且包含至少部分或完全单链核酸接头的多核苷酸修饰的缀合物组分接触。与本公开的方面一致，结合分子的单链核酸接头序列的至少一部分与缀合物组分的单链核酸接头序列的一部分互补，并且当接触时，使接头退火，以形成将结合分子连接到缀合物组分的双链接头。在某些实施例中，使一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多种额外的多核苷酸修饰的结合分子与多核苷酸修饰的缀合物组分接触。在某些实施例中，一种或多种结合分子为抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。
[0092]
所属领域的普通技术人员将理解，除了上文示例性高速方法之外，其中底物和缀合物组分通过其各自的接头杂交“间接”接合，类似的高速标记可通过并入产生本文所描述的多核苷酸修饰的生物缀合物的各种其它方法中的任一种来实现，使得不同结合分子用相同的缀合物组分标记。举例来说，用于检测的标记结合分子的高速产生方法，其中不同的结合分子用相同的缀合物组分标记，包含(a)获得至少两种不同的结合分子和(b)将至少两种不同的结合分子附接到包含检测标记的多核苷酸修饰的缀合物组分的核酸接头，使得不同的结合分子用相同的缀合物组分标记。核酸接头可为单链的，包含双链片段，或为完全双链的。在某些实施例中，核酸接头包含双链片段或核酸接头为完全双链的，并且在将多核苷酸修饰的缀合物组分的核酸接头附接到结合分子以形成多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物之前，方法包含使核酸链杂交，以形成至少部分双链核酸接头。在某些实施例中，将一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多种额外的结合分子附接到多核苷酸修饰的缀合物组分。并且，在某些实施例中，一种或多种结合分子为抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。
[0093]
某些实施例包含将不同的结合分子的分子或多核苷酸修饰的结合分子分配、等分等(如本文其它地方所描述)到单独的隔室中，以在每个隔室中使每种类型的结合分子与多核苷酸修饰的缀合物组分接触，由此产生用相同缀合物组分标记来标记的不同的结合分子。
[0094]
在某些实施例中，不同结合分子的至少部分或完全单链核酸接头对于所有多核苷酸修饰的结合分子为相同的，并且单个至少部分或完全单链核酸序列可用作多核苷酸修饰的缀合物组分的核酸接头。
[0095]
另外，上述方法可以多种不同组合在产生用于检测的标记的一种或多种结合分子的方法中组合。在某些实施例中，创建不同组合的方法使用一个或仅几个核酸接头序列。在某些实施例中，方法为高速方法。举例来说，在某些实施例中，不同的缀合物组分标记可以高速方式“印刷”到结合分子或本文公开的其它底物)上以用于产生。
[0096]
在某些实施例中，制备本公开的多核苷酸修饰的生物缀合物的过程涉及将组分接触在一起，如本文其它地方所述，使得可使单链组分接头的互补部分退火以形成将组分连接到生物缀合物中的至少部分双链接头。组分可在组合物中彼此接触。举例来说，在某些实施例中，组合物可为溶液。在某些实施例中，组合物包含底物，所述底物包含(a)至少部分或完全单链核酸接头和(b)包含至少部分或完全单链核酸接头的缀合物组分。在某些实施例中，底物为结合分子或珠粒。如前文所述，在某些实施例中，底物的单链核酸接头序列的至少足够部分的序列与缀合物组分的单链核酸接头序列的一部分互补以允许核酸接头退火并形成将底物连接到缀合物组分的双链核酸接头。在某些实施例中，组合物包含(a)包含核酸接头的底物，其中底物为结合分子或珠粒，和(b)能够附接到核酸接头以将底物连接到缀合物组分的缀合物组分。在某些实施例中，核酸接头为单链的，包含双链片段，或核酸接头为完全双链的。在某些实施例中，组合物包含(a)包含核酸接头的缀合物组分，和(b)能够附接到核酸接头以将缀合物组分连接到底物的底物。在某些实施例中，核酸接头为单链的，包含双链片段，或核酸接头为完全双链的。在某些实施例中，组合物包含(a)能够附接到核酸接头的底物，其中底物为结合分子或珠粒，和能够附接到核酸接头的缀合物组分，和(b)核酸接头。在某些实施例中，核酸接头为单链的，包含双链片段，或核酸接头为完全双链的。在某些实施例中，组合物包含(a)包含至少部分或完全单链核酸接头的底物，其中底物为结合分子或珠粒，(b)包含至少部分或完全单链核酸接头的缀合物组分；和(c)另一核酸接头片段，其中可使(v)(a)、(v)(b)和(v)(c)退火，以形成包含(v)(a)、(v)(b)和(v)(c)并且将(v)(a)连接到(v)(b)的至少部分双链核酸接头。
[0097]
在上述任一项的某些实施例中，组合物能够产生本文任何地方公开的多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物或多核苷酸修饰的珠粒生物缀合物。
[0098]
本公开的另一个方面为标记细胞、组织和/或器官的方法。在某些实施例中，细胞、组织和/或器官为正常的或健康的。在某些实施例中，细胞、组织和/或器官例如为异常的、患病的或受损的。举例来说，在某些实施例中，细胞和/或组织为癌细胞或肿瘤。在某些实施例中，方法包含使细胞、组织和/或器官与本文公开的多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物接触，其中生物缀合物的结合分子部分与细胞、组织和/或器官的抗原、表位和/或半抗原结合，并且其中缀合物组分部分包含可检测标记，如染料。在某些实施例中，生物缀合物的结合分子部分特异性地识别细胞、组织和/或器官的抗原、表位和/或半抗原并且与其特异性地结合。在某些实施例中，方法包含使细胞、组织和/或器官与本文公开的多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物接触，其中生物缀合物的结合分子部分与细胞、组织和/或器官上或中的受体结合并且其中缀合物组分部分包含可检测标记，如染料。在某些实施例中，生物缀合物的结合分子部分特异性地识别细胞、组织和/或器官上或中的受体并且与其特异性地结合。在某些实施例中，标记为用于视觉检测的标记。在某些实施例中，标记为寡核苷酸类荧光标记，如phiton。这类标记可用于多种应用。代表性实例包括其中标记细胞可用于流式细胞术、抗体筛选、elisa或其它夹心测定、免疫监测、生物标志物测定、横向流动、床旁检测/
快速诊断、成像、显微镜、分子诊断、下一代测序、长读取测序、原位测序、聚合酶链反应、微阵列、核酸测序、氨基酸测序、数字病理学、dna印迹法、rna印迹法、蛋白质印迹法，或预防性和/或治疗性目的中的一种或多种。举例来说，在某些实施例中，标记的细胞用于流式细胞术。另外，在某些实施例中，标记为用于细胞膜的标记，例如其中亲脂性部分附接到标记，使其能够实现染色细胞膜，或替代地，将肉豆蔻酰化/棕榈酰化序列并入或附接到标记，或替代地，通过与凝集素(例如麦胚凝集素(wga)结合以检测细胞膜上的糖缀合物。在某些实施例中，标记为用于细胞活力的标记，例如，通过与双链dna特异性探针缀合(dna结合，因为dna在死细胞中是可获得的)，或替代地，通过将标记附接到胺反应性部分(其将与死细胞的许多细胞内蛋白反应，并能够实现其鉴定和/或从分析中排除)。在某些实施例中，标记附接到酶活化部分，这能够实现细胞内标记的染色和传代至子细胞。在某些实施例中，标记为靶向基因组材料的特异性标记，例如，结合或替代地含有能够实现其与独特的序列rna或dna结合的序列(例如通过fish或其它成像或荧光测量模态)。
[0099]
还提供用于定量测量来自标记细胞、组织和/或器官的信号的方法和试剂。在某些实施例中，方法包含使细胞、组织和/或器官与本文公开的多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物接触-其中生物缀合物的结合分子部分与细胞、组织和/或器官的抗原、表位、膜、基因组材料和/或半抗原结合，缀合物组分部分包含可检测标记-和测量多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物的存在，其中dol为已知的，由此允许进行定量测量。在某些实施例中，方法包含使细胞、组织和/或器官与本文公开的多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物接触-其中生物缀合物的结合分子部分与细胞、组织和/或器官上或中的受体结合，并且缀合物组分部分包含可检测标记-和测量多核苷酸修饰的结合分子生物缀合物的存在，其中dol为已知的，由此允许进行定量测量。在某些实施例中，标记为用于视觉检测的标记。在某些实施例中，标记为寡核苷酸类荧光标记，如phiton。在某些实施例中，结合分子的标记度(dol)经由核酸的可用性化学计量控制。在某些实施例中，结合分子的dol为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，或其间的任何范围，包括终点。在某些实施例中，在多核苷酸修饰的结合分子上的核酸的标记度(dol)为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，或其间的任何范围，包括终点与缀合物组分的dol无关。并且在某些实施例中，可利用包含多核苷酸修饰的珠粒生物缀合物的对照，例如具有已知dol的，来辅助量化。
[0100]
本文还提供用于生产和/或使用本公开的多核苷酸修饰的生物缀合物的试剂盒。在某些实施例中，试剂盒包含产生本公开的多核苷酸修饰的生物缀合物所需要的一种或多种组分。在某些实施例中，试剂盒包含产生本公开的组合物所需要的一种或多种组分。在某些实施例中，试剂盒包含以本公开的高速方法标记底物、标记细胞、组织和/或器官，和/或执行如本文所提供的定量分析所需要的一种或多种组分。举例来说，在某些实施例中，试剂盒包含一种或多种底物，如结合分子(例如抗体和衍生物)或珠粒、缀合物组分、单链、部分单链/部分双链或完全双链核酸接头、多核苷酸修饰的底物、多核苷酸修饰的缀合物组分和/或多核苷酸修饰的生物缀合物。在某些实施例中，试剂盒还包含印刷和/或在电子存储介质上的用于执行本文公开的任何方法的说明书、缓冲剂和/或额外的试剂，和/或包装材料。
[0101]
珠粒.
[0102]
所属领域普通技术人员将熟悉多种类型的聚苯乙烯微球。聚苯乙烯微球在大小和
荧光强度方面都高度均匀。它们被设计成近似复制生物样品的大小、发射波长和强度。在某些情况下，因为染料可含在微球基质内而不是表面上，所以珠粒具有出色的光化学和物理稳定性，为对齐、聚焦和校准流式细胞仪(例如alignflow、赛默飞世尔(thermofisher))提供可靠的参考信号。这类荧光染料被选择用于流式细胞术中常用的激光源进行最佳激发，如在2.5μm直径和6.0μm直径范围内。在另一个实例中(bd细胞仪设置和跟踪(cs&t)珠粒)，三种聚苯乙烯珠粒的相同浓度在相对强度上不同：暗淡、中等和明亮。所有三种珠粒都具有较低的本征cv，并且含有跨越多种激发和发射波长范围的染料，用于许多流式细胞术应用。”珠粒的一些其它实例为抗体捕获珠粒：这些珠粒捕获抗体并可用作荧光补偿的对照(例如，onecomp和ultracomp ebeads：聚苯乙烯微球；abc总抗体和arc胺反应性补偿珠粒：聚苯乙烯微球)。珠粒的其它实例包括：计数珠粒；无菌技术珠粒(例如，“glogerm珠粒”)；polyscience yellow-green(yg)珠粒，其为一种高度荧光且均匀的粒子，以0.5μm至10μ获得；和量化珠粒。另一个实例包括quantum mesf珠粒(pe标记的抗体)，其为特性良好的珠粒。由于空间限制，pe的f/p比通常为1:1。
[0103]
定量.
[0104]
目前，流式细胞术测量和其它荧光类测量和诊断模态是相对的。也就是说，测量是相对于对照进行的，而不是在每个细胞的基础上获得分子(例如蛋白)的真实数量，如在流式细胞术中。已努力创建流式细胞术的定量标准，但由于本文所述抗体的标记可变性而仅限于单一染料(藻红蛋白)。
[0105]
在结合分子(如抗体)上的染料的负载度(dol)(即，每个抗体的染料的数量)改变标记的亮度。由于典型缀合策略的差异，dol具有所有结合分子的分布，亮度也是如此。缓解dol的这种变化的唯一方法是降低染料浓度以达到1:1标记。然而，在此低的浓度下进行反应受产率低，并且产生许多无染料和几个具有一个染料的抗体的困扰。这使创建亮度也足够有用的定量标记抗体变得不切实际。另外，传统的缀合策略需要大量的反应后纯化以去除副产物、灭活染料和未标记的抗体。
[0106]
本公开的核酸接头系统能够实现通过利用1:1dol对标记的生物缀合物进行定量分析。图5说明传统的缀合策略和本文所描述的核酸/多核苷酸接头之间的差异。图5示出标记的抗体的数量对每个抗体的标记。曲线代表传统缀合方法通常遇到的分布，中间的
‘
δ’函数代表多核苷酸接头可产生的。
[0107]
dol的控制使得可通过将观察到的荧光与通过分析一系列装载有“m”多核苷酸(例如，polya)的专门微球/珠粒生成的工作曲线进行比较来直接测量细胞表面上的蛋白的数量。图6说明具有通过退火到珠粒的polya接头片段捕获的polyt接头片段的phiton(寡核苷酸类荧光标记)的概念。然后可通过离心洗涤和纯化珠粒，以在珠粒直径的可变性范围内产生具有恒定dol的珠粒群。
[0108]
图7说明珠粒上的接头的数量(“m”)可如何变化并且以1:1方式捕获相同数量的phitons。
[0109]
图8说明在其表面(“m”)上具有不同数量多核苷酸(例如，polyt)的珠粒和附接的phiton(“n”)的亮度如何线性改变其荧光。举例来说，图8示出代表两个phitons，n＝1集群和n＝2集群的两条线。它们的斜率是不同的，因为对于每个珠粒(“m”)的接头计数的每个边际增加，荧光增加的量更大，因为n＝2集群phiton比n＝1集群phiton发出2x的荧光。
[0110]
利用足够数量的(m,n)值，可使用线性回归来基于荧光信号确定连接到表面(例如珠粒、细胞等)的染料分子的数量。另外，用这类染料标记的珠粒进行定量可提供对系统检测限的重要洞察，即它可检测到多小的信号。这也可用于确定依赖于polya尾的任何3'类的rna检测模态的灵敏度。
[0111]
因此，本文提供的缀合过程降低与其它技术相关联的可变性，并且能够实现精细调谐控制染料分子(例如，寡核苷酸类染料)或与结合分子缀合的任何其它分子的数量。用已知量的染料和来自这些染料中的每种的已知的、充分表征的荧光，公开真正的定量系统。至关重要的是，在此控制良好的系统中建立标准曲线(参见图8)，可定量确定生物缀合物的数量，例如，流式细胞术中细胞表面上的数量。这可以在单个细胞上同时完成，不仅能够实现可在流式细胞术中进行第一次真正的定量，并且还可实现在单个细胞的基础上同时跨多种生物缀合物进行定量的能力。
[0112]
补偿.
[0113]
由于不同荧光团之间的发射光谱之间存在重叠，因此使用补偿(在其它研究领域也称为离析)。补偿的目的是从“错误”通道中去除特定探针的溢出荧光。举例来说，荧光素的荧光主要为绿色，这是在fl1(fitc)通道中测量的。但是，荧光素在荧光中也有明显的黄色组分，它出现在fl2(pe)通道中。”在目前的实践中，细胞用具有实验中使用的相同染料的抗体或抗抗体珠粒染色。进行单染色控制以确定通道外荧光，并创建补偿矩阵来说明这一点。这最近已延伸到光谱补偿，这是一个超定系统(即检测器多于荧光团)，但基本方法是相似的。
[0114]
串联染料(即由2个荧光团制成的那些染料，如pe-cy7或apc-cy7，并且可依赖于fret获得荧光)增加补偿的要求。这些串联染料的使用给研究人员带来了负担，因为这些染料的fret相互作用在与不同抗体结合时改变。这需要在单个染色补偿控制中实验地使用fret对运行精确的抗体，并导致每个面板一个补偿矩阵，其中含有这些串联中一个。举例来说，表2示出四种不同四色面板。
[0115]
表2.
[0116]
cd1-fitccd1-fitccd1-fitccd1-fitccd2-pecd2-pecd2-pecd2-pecd3-percpcd3-percpcd3-percpcd3-percpcd4-pe-cy7cd5-pe-cy7cd6-pe-cy7cd7-pe-cy7
[0117]
表2中使用的抗体命名法是简写，例如，cd3-pe为与藻红蛋白缀合的抗cd3抗体的缩写。
[0118]
cd4-pe-cy7、cd5-pe-cy7、cd6-pe-cy7和cd7-pe-cy7之间的荧光特性不同，因此在本实验中需要四种不同的补偿矩阵(每个面板一个)和7种不同的补偿运行(表3)：
[0119]
表3.
[0120]
cd1-fitccd2-pecd3-percpcd4-pe-cy7cd5-pe-cy7
cd6-pe-cy7cd7-pe-cy7
[0121]
然而，在本公开的某些实施例中，更温和的缀合协议和缀合使单一物种和多物种(fret)染料稳定的dna类平台的特征、染料缀合的抗体(例如，phiton缀合的抗体)的光学特性)不变。这能够实现以一个补偿矩阵和四个补偿控制来运行相同的实验。举例来说，使用phiton缀合抗体，实验将为：
[0122]
表4.
[0123]
cd1-fitccd1-fitccd1-fitccd1-fitccd2-pecd2-pecd2-pecd2-pecd3-percpcd3-percpcd3-percpcd3-percpcd4-ny610cd5-ny610cd6-ny610cd7-ny610
[0124]
所有四个面板将(并且可有效地)共享一个补偿矩阵，并且仅需要运行四个补偿控制，由此大大简化了实验设计。
[0125]
使用这类系统，所属领域的普通技术人员可使用经由核酸接头与多核苷酸修饰的染料缀合的多核苷酸修饰的珠粒，所述多核苷酸修饰的染料具有带有相应(互补)序列的核酸接头，而不需要抗体(图9)。这些补偿控制为运行单个染色控制的一致方法。此外，由于它们不受抗体上染料分子分布的影响(即，它们只是珠粒上的纯染料，两者都可以进行定量)，因此将单个染色控制本身的固有测量噪声降至最低。
[0126]
因此，如上文所讨论，本公开的缀合方法能够实现将染料直接放置在珠粒上，避免与使用染料缀合的抗体进行补偿控制相关的成本。此类方法还避免补偿矩阵的发生和倍增的可变性(因为每个串联缀合抗体的行为不同，这需要其自己的补偿控制)。某些实施例能够实现用户运行一组一致的多色对照(例如，直接与珠粒缀合的寡核苷酸类染料)。
[0127]
纯化.
[0128]
虽然出于本文其它地方讨论的原因，纯化可能不是必需的，但是本公开的产生生物缀合物的方法允许游离染料或其它缀合物组分的纯化，例如在需要高纯度生物缀合物的情况下(参见，例如图3和图10)。举例来说，如果缀合用于创建药物-抗体生物缀合物，那么方法将还能够实现在gmp制造过程中未结合的抗体和药物的纯化。
[0129]
在某些实施例中，多核苷酸修饰的底物，如结合分子和/或缀合物组分，如多核苷酸类标记，可从包含多核苷酸修饰的生物缀合物的组合物捕获，所述多核苷酸修饰的生物缀合物包含通过使多核苷酸修饰的底物的单链接头区和/或多核苷酸修饰的缀合物组分退火到具有至少部分互补序列的核酸链的退火双链接头。在某些实施例中，具有互补序列的核酸链附接到珠粒或表面以进行纯化。在某些实施例中，在多核苷酸修饰的底物和/或多核苷酸修饰的缀合物组分的单链接头区连接到珠粒之后，珠粒与多核苷酸修饰的生物缀合物分离，如通过离心去除。在某些实施例中，通过使组分通过具有互补序列的固定核酸来分离多核苷酸修饰的生物缀合物。在某些实施例中，珠粒既可充当珠粒又可充当固定表面，如位于色谱柱中的珠粒。
[0130]
在某些实施例中，方法产生可通过置换与缀合物的连接再循环的废产物(例如，未结合的、去除的缀合物)。
[0131]
寡核苷酸类荧光标记.
[0132]
wo/2018/231805中已经详细描述寡核苷酸类荧光标记，所述专利以全文引用的方式并入本文中。可用作标记的寡核苷酸类荧光标记可经由各种技术创建。在一些实例中，dna自组装可用于确保标记内谐振器的相对位置对应于根据所需时间衰减曲线指定的位置。举例来说，网络的每个谐振器可联接到各自指定的dna链(图14)。每条dna链可包括一个或多个部分，所述部分与一个或多个其它dna链的部分互补，使得dna链自组装成纳米结构，所述纳米结构将谐振器维持在指定的相对位置。
[0133]
dna自组装和其它新兴的纳米级制造技术允许以纳米级精度制造特定结构的许多实例。举例来说，如wo/2018/231805中所描述，phiton是通过对化学方法生产的定制合成dna进行退火制成。多条链在混合和退火之前与荧光团、肽、小分子等预缀合。序列被设计成使得具有最低能量的单个有限组件，并且在溶液、干燥或冷冻中稳定，并保留任何缀合材料的相对位置。这种精度可允许荧光团、量子点、染料分子、等离子体纳米棒或其它光学谐振器相对于彼此定位在精确的位置和/或方向，以创建各种光学谐振器网络。可指定这类谐振器网络以便于各种不同的应用。在一些实例中，谐振器网络可被设计为使得它们在光激发(例如，通过照射脉冲)和再发射之间呈现预先指定的时间关系；这可能够实现可使用单个激发波长和单个检测波长检测的时间复用标记和标记物。另外地或替代地，可利用这些谐振器网络相对于激发的光重发射定时的概率性质来生成随机变量的样品。这些谐振器网络可包括一个或多个呈现暗态的“输入谐振器”；包括这类输入谐振器的谐振器网络可被配置为实施逻辑门或其它结构以控制激子或其它能量通过谐振器网络的流动。然后可使用这类结构，例如允许通过单个谐振器网络检测各种不同的分析物，控制使用谐振器网络生成的随机变量的分布，进一步多路复用一组用于成像的标记生物样品，或促进一些其它应用。
[0134]
这些谐振器网络包括荧光团、量子点、染料、拉曼染料、导电纳米棒、发色团或其它光学谐振器结构的网络。网络还可包括抗体、适体、脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)链，或被配置成允许选择性与感兴趣的分析物(例如，表面蛋白质、分子表位、特征核苷酸序列或感兴趣的分析物的其它特征)结合。标记可用于观察样品、鉴定样品的内容物(例如鉴定样品中的细胞、蛋白或其它粒子或物质)，基于它们的鉴定对这类内容物进行分类(例如，根据鉴定的细胞类型或其它特性在流式细胞仪内对细胞进行分类)，或促进一些其它应用。在本文公开的某些实施例中，标记经由多核苷酸接头连接到底物，如抗体或珠粒。
[0135]
在实例应用中，可应用这类谐振器网络(例如，通过将谐振器网络联接到抗体、适体或其它分析物特异性受体)来检测在生物或材料样品或其它感兴趣的环境中大量不同的标记的存在，它们之间的区分，或以其它方式观察。这类标记可允许检测样品中(例如，在流式细胞术设备的通道中)一种或多种感兴趣的分析物的存在、数量或位置。访问大量可区分标记的文库可允许同时检测大量不同的分析物。另外或替代地，通过使用多个标记与相同的分析物(例如，分析物的不同表位、表面蛋白或其它特征)结合，对可区分标记的大文库的访问可允许更准确地检测特定分析物(例如，感兴趣的细胞类型或亚型)。又另外，访问这类大的标记文库可允许根据相应感兴趣分析物的可能密度或数量来选择标记，例如以确保对应于样品中具有不同浓度的分析物的不同标记的有效亮度，在光学询问此类样品时大致相同。
[0136]
这类标记可通过在激发光谱、发射光谱、荧光寿命、荧光强度、对光漂白的敏感性、对与分析物或一些其它环境因素的结合的荧光依赖性、再发射的光的偏振，或一些其它光
学特性方面的不同而区分。然而，由于可用荧光团或其它光学可区分物质的限制以及常见感兴趣的样品材料的波长透明度/相容性的限制，当依赖发射或激发光谱的差异时，难以产生大的可区分标记的文库。
[0137]
wo/2018/231805描述用于指定、制造、检测和鉴定在时间衰减曲线和/或激发和发射光谱方面不同的光学标记的方法。另外或替代地，所提供的标记可具有相对于现有标记(例如，荧光团类标记)的增强的亮度并且可具有可配置的亮度以促进面板设计或允许不同标记的相对亮度以促进一些其它考虑。这类标记在激发标记(例如，通过超快激光脉冲)之后由标记再发射光的时间相关概率可不同。另外或替代地，这类标记可包括谐振器网络以增加标记的激发波长和标记的发射波长之间的差(例如，通过在输入谐振器和输出谐振器之间插入多个中介谐振器以允许激子在输入谐振器和输出谐振器之间传输，在其之间直接能量转移为不利的)。又另外，这类标记可包括逻辑门或其它光学可控结构以在检测和鉴定标记时允许进一步多路复用。
[0138]
如wo/2018/231805中描述的谐振器网络(例如，作为标记的一部分包括的谐振器网络)可以多种方式制造，使得一个或多个输入和/'o读出谐振器、输出谐振器、暗态呈现“逻辑输入”谐振器和/或中介谐振器根据特定的谐振器网络进行布置，并且进一步使得网络的时间衰减曲线、网络的亮度、激发光谱、发射光谱、斯托克斯位移，或网络的一些其它光学性质，或网络的感兴趣的一些其它可检测特性(例如，与感兴趣的分析物结合的状态)对应于其规格(例如，指定的时间衰减曲线，响应于照射的发射概率)。这类布置可包括确保谐振器之间(例如，谐振器对之间)的相对位置、距离、取向或其它关系对应于谐振器之间的指定位置、距离、取向或其它关系。
[0139]
这可包括使用dna自组装来制造一个或多个谐振器网络的多个实例。举例来说，许多不同的dna链可联接(例如，经由胸苷上的伯氨基修饰基团将n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯修饰的染料分子附接到谐振器网络的各个谐振器(例如，输入谐振器、输出谐振器和/或介体谐振器)。dna链对可具有至少部分互补的部分，使得当dna链混合并暴露于指定条件(例如，指定ph或指定温度曲线)时，dna链的互补部分对齐并结合在一起形成半刚性纳米结构，所述结构维持谐振器网络的谐振器的相对位置和/或方向。
[0140]
图15示出这类谐振器网络的示意图。输入谐振器、输出谐振器和两个介体谐振器联接到各自的dna链。然后联接的dna链与额外的dna链一起自组装成所说明的纳米结构，使得输入谐振器、介体谐振器和输出谐振器形成谐振器线。在一些实例中，可经由这类方法或其它技术形成多个单独的相同或不同的网络，作为谐振器网络的单个实例的一部分(例如，以增加谐振器网络的亮度)。
[0141]
可指定这类谐振器网络的谐振器之间的距离，使得谐振器网络呈现一种或多种期望的行为(例如，被特定激发波长的光激发，并根据指定的时间衰减曲线响应性地再发射发射波长的光)。这可包括指定相邻谐振器之间的距离，使得它们能够在彼此之间(例如，双向或单向)传输能量，并且进一步使得谐振器不彼此猝灭或以其它方式干扰彼此的光学特性。在其中谐振器经由接头结合到主链(例如，经由酰胺键(例如由n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯分子创建)或其它连接结构与dna主链结合)，接头可联接到考虑到这些因素以及接头的长度指定的背景位置。例如，联接位置可相隔大于接头长度两倍的距离(例如，以防止谐振器彼此接触，并且因此彼此猝灭或以其它方式干扰彼此的光学特性)。另外或替代地，联接位
置可分开的距离小于谐振器可在彼此之间传输能量的最大距离。举例来说，当经由福斯特共振能量转移传输能量时，谐振器可为荧光团或以福斯特半径为特征的一些其它光学谐振器，并且联接位置可分开小于福斯特半径的距离。
[0142]
用于的系统和方法的实例鉴定样品中的标记.
[0143]
询问样品(例如，生物样品或流式细胞仪中的细胞流)或一些其它感兴趣的环境以检测存在、身份、绝对或相对量，这在各种应用中可能是有益的，或可存在于样品或其它感兴趣的环境中的如本文所述的标记的其它特性。这类询问可以促进样品的成像，例如以确定关于存在于样品内并且被配置成与一种或多种标记的变化结合的一种或多种分析物的位置、浓度或其它信息。这种询问可促进细胞、蛋白、rna链或样品的其它内容物的鉴定，以便对这类内容物进行分类或提供一些其它益处。例如，流式细胞术设备可包括细胞(或其它感兴趣的粒子)流过的流动通道。可如本文所述询问这类流动通道，以便鉴定通道中的一个或多个标记和/或鉴定细胞的类型或亚型，确定细胞的特性，或基于所鉴定的标记确定一些其它信息。这类信息然后可用于例如根据细胞类型将细胞分类。
[0144]
用于检测和/或鉴定感兴趣环境中的标记的这类方法可包括向感兴趣环境提供照射(例如，以一个或多个超短照射脉冲的形式)和检测从环境发射的光子的一种或多种特性响应于照射(例如，这类光子的波长或光谱，这类光子的发射定时相对于照射的定时，例如照射的一个或多个脉冲的定时)。这可包括提供单个照射脉冲并检测从环境中一个或多个标签的多个实例响应地发射的光子。另外或替代地，一个或多个标记的一个或多个实例可被多个照射脉冲照射多次，并且可检测响应地发射的光子相对于照射脉冲的定时。然后可使用关于响应发射光子的定时的信息来鉴定环境中存在的一个或多个标记，确定这类标记的结合状态或其它特性，确定(一个或多个)标记在环境中的绝对或相对量，或确定与存在于环境中的如本文所述的一个或多个标记相关的一些其它信息。
[0145]
照射可作为一个或多个照射脉冲提供给环境。所提供的照射可以有指定的波长，例如一个或多个标记的输入谐振器的激发波长。这类激发波长对于存在于感兴趣环境中的一些或所有标记可能是通用的，例如，由于一些或所有标记包括相同的荧光团、量子点、染料或其它光学物质或结构作为它们的(一个或多个)输入谐振器。另外或替代地，可提供多个不同波长的光来激发多个不同的输入谐振器，例如多个不同标记。在一些实例中，可在不同时间点(例如，作为不同照射脉冲的一部分)提供这类不同波长的光以促进多个不同标记和/或多个不同标记组的光谱复用检测。在一些实例中，单个标记可包括多个不同的输入谐振器，并且不同的输入谐振器可被各自不同波长的光激发，例如作为各自不同的照射脉冲的一部分。
[0146]
为了改进环境中标记的鉴定，用于询问环境的照射脉冲可为超短脉冲(例如，具有约阿秒到纳秒的持续时间的脉冲)。这类超短脉冲可作为从锁模振荡器发射的宽带脉冲提供。在其中标记包括具有长寿命状态(例如，镧系元素原子或其它镧系元素化合物或络合物)的谐振器的实例中，照射脉冲可具有更长的持续时间，例如，约微秒。
[0147]
相对于这类照射脉冲，响应于照射脉冲从环境发射光子的定时可以多种方式检测。在一些实例中，可例如使用一个或多个单光子雪崩二极管、光电倍增器或其它单光子探测器来检测单个光子的定时。这类检测器的输出可用作时间相关单光子计数器的一部分，以确定在向环境提供照射脉冲之后确定为时间函数的光子计数。这类检测到的光子的定时
可用于确定响应于样品照射从样品发射光子的定时的概率密度函数。
[0148]
另外或替代地，检测来自环境的光子发射定时可包括检测发射光子的速率或强度的一个或多个峰值的定时，或检测发射光子的定时的一些其它总特性(例如，确定光子发射速率峰值的延迟定时，所述峰值可与已知时间衰减曲线的相应峰值的延迟相匹配)。这类检测可包括将峰值检测器、微分器、匹配滤波器或一些其它模拟或数字信号处理技术应用到单光子雪崩二极管或其它光电检测器元件的输出，所述光电检测器元件被配置成接收从感兴趣的环境发射的光子。
[0149]
一个或多个已知标记可能存在于感兴趣的环境中并且确定这类标记的身份和/或确定关于环境中的标记的一些其它信息可能是有益的。如上文所描述，可根据它们的时间衰减曲线来区分这类标记；也就是说，每个已知标记都可用各自不同的时间衰减曲线来表征。因此，环境中存在的一个或多个标记的身份可通过将检测到的从环境的光子发射时间与时间衰减曲线字典进行比较来确定，其中字典中的每个时间衰减曲线对应于一个可能存在于环境中的各自已知标记。
[0150]
询问环境可包括检测多个不同波长范围内的光子发射定时。这样做可检测来自标记的两个不同输出谐振器的光子发射定时。另外或替代地，可以这样做以检测来自标记的输出谐振器、一个或多个中介谐振器和/或输入谐振器的光子的发射定时。
[0151]
又另外，环境中存在的一个或多个标记可包括暗态呈现谐振器，使得标记的时间衰减曲线取决于暗态呈现谐振器是否处于其各自的暗态。举例来说，标记可包括第一暗态呈现谐振器并且可在第一暗态呈现谐振器处于其暗态时呈现第一时间衰减曲线并且当第一暗态呈现谐振器未处于其暗态时标记可呈现第二时间衰减曲线。在这类实例中，标记的检测和/或鉴定可包括在(一个或多个)暗态呈现谐振器未处于其暗态的时间段期间以及在不同的时间段期间检测光激发和再发射的定时，诱导(一个或多个)暗态呈现谐振器进入暗态(例如，通过以(一个或多个)暗态呈现谐振器的激发波长提供照射)并再次检测标记的光激发的时间和再发射的定时。
[0152]
实例
[0153]
实例1.
[0154]
重要的是，应注意使用多核苷酸序列而不是独特的、高度变化的序列可显著影响下游应用中的缀合产率和/或缀合物的性能。图11和图12使用外周单核血细胞(pbmc)染色数据比较使用高度变化的序列以及多核苷酸序列缀合的phiton标记抗体的性能说明了这一点。这两个数据集的叠加示出两种缀合方法产生几乎相同的染色模式，因此不显著改变缀合产率或染色结果。
[0155]
实例2.
[0156]
使用相同多核苷酸序列的缀合物也可在缀合后混合在一起并且在溶液中保持稳定而不表现出显著的交换，即一种缀合物的变性和副产物与混合物中的其它物种的重新杂交。图13用已经用使用两种高度变化并且独特的序列和对于两种缀合物相同多核苷酸序列的nova-blue610-cd3和novayellow 610-cd4的混合物染色的pbmc说明这一点。图13中的叠加示出无论使用独特的序列还是相同的多核苷酸序列，结果几乎相同。
[0157]
实例3.
[0158]
包含一个或多个(通常多个)附接的单链核酸接头(例如polya)的珠粒可用于在与
多核苷酸修饰的抗体退火之后使用其未结合接头(例如polyt)的亲和力纯化未缀合的多核苷酸修饰的染料，以与珠粒的表面结合。图10说明此过程，其中结合和未结合染料的混合物与polya珠粒反应、洗涤和离心(去除)以产生纯化的上清液。
[0159]
这类纯化会产生废物(例如，去除的、未结合的染料)，其可通过使用更长的10-20个核苷酸的游离polyt链置换染料和polya珠粒之间的连接来回收，其中染料连接不为整个polya链，但少1-10个核苷酸。此过程将染料交换成游离的polyt链，在洗涤和离心后，将在上清液中留下纯化的未结合染料，适合与抗体重新结合。
[0160]
实例4.
[0161]
通过改变化学计量，可增加缀合物的亮度，同时保持光学特性。例如，如果将2核染料的染料:蛋白(d:p)比率变为2，那么这将使给定染料的亮度扩大4倍。作为另一实例，其中d:p比为4并且单染料标记满载时(例如，phiton上有16个单独的染料)，我们可获得4
×
16＝64x的亮度，这将带来一种(仍然是定量的)检测单个细胞上的分子数量非常非常少(目前无法检测)的方式。
[0162]
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[0163]
本公开的广度和范围不应受任何上述示例性实施例的限制，而应仅根据所附权利要求及其等同物来限定。