用于诊断和治疗与表达CD206的细胞相关的病症的组合物、方法和药盒与流程

用于诊断和治疗与表达cd206的细胞相关的病症的组合物、方法和药盒
1.本技术是申请日为2014年7月22日，申请号为201480051858.9，发 明名称为“用于诊断和治疗与表达cd206的细胞相关的病症的组合物、方 法和药盒”的发明专利申请的分案申请。
2.相关申请的交叉引用
3.该申请要求于2013年7月22日提交的第61/857,232号标题为
ꢀ“
compositions and methods for diagnosing and treatingmacrophage-related disorders”的美国临时专利申请和于2013年 9月18日提交的第61/879,649号标题为“compositions and methodsfor diagnosing and treating macrophage-relateddisorders”的美国临时专利申请的优先权。上述临时专利申请的全部公 开内容通过援引加入本文。
技术领域
4.本发明涉及诊断和治疗病症的方法，更具体地，涉及诊断和治疗与表 达cd206的细胞相关的病症的方法。


背景技术：

5.已研发多种受体结合化合物用于诊断或治疗多种医学病况。通常将这 样的受体结合化合物设计为结合至一种或多种特异性蛋白质上的一个或多 个受体位点。为了治疗原因，可将受体结合化合物用于将治疗剂或诊断剂 递送至特定靶细胞，或者甚至阻滞某些受体。
6.例如，于2002年6月25日授权并将其通过援引加入本文的标题为
ꢀ“
macromolecular carrier for drug and diagnostic agent delivery”的第 6,409,990号美国专利(
“‘
990专利”)公开了受体结合高分子，已表明其可用作 用于递送放射性同位素(其用于对乳腺癌和黑色素瘤分期的前哨淋巴结成像) 的载体分子。
‘
990专利中记载的载体分子表现出通过前哨淋巴结的大量的 且持续的摄取，从而能够递送连接至所述载体分子的放射性同位素。
7.作为更具体的实例，一种根据
‘
990专利制备的目前上市的诊断剂是锝 tc 99m替马诺塞(tilmanocept)，其由dublin,ohio的navideabiopharmaceuticals inc.以注射药盒的名称销售。所述 lymphoseek药盒以包含替马诺塞粉末的小瓶的形式分发。所述替马诺 塞粉末在使用前用锝tc 99m放射性标记，以制备锝tc 99m替马诺塞诊断 剂。当将锝tc 99m过锝酸盐溶液加入至包含所述替马诺塞粉末和还原剂的 小瓶中，使得锝tc 99m螯合至所述替马诺塞分子的二乙烯三胺五乙酸 (“dtpa”)基团时，形成该诊断剂。批准将所得的放射性诊断剂用于使用单 光子发射型计算机断层成像(spect；有或无计算机断层成像，ct)和/或基 于γ发射的闪烁显像和/或使用手提式γ计数器的淋巴绘图，以辅助患有乳 腺癌、黑色素瘤或鳞状细胞癌(scc)的患者中的原发性肿瘤部位引流的淋巴 结(即前哨淋巴结)的定位。
8.替马诺塞(其为诊断剂的非放射性标记前体)具有葡聚 糖主链，多个氨基封端的链索(leash)(-o(ch2)3s(ch2)2nh2)连接至核心葡萄 糖单元。此外，甘露糖基团缀合至多个链索的氨基基团，并且螯合剂二乙 烯三胺五乙酸(dtpa)缀合至不包含甘露糖的其它链索的氨基基团。替马诺 塞通常由葡聚糖3-[(2-氨乙基)硫代]丙基17-羧基-10,13,16-三(羧甲基)-8-氧 代-4-硫杂-7,10,13,16-四氮杂十七烷-1-基3-[[2-[[1-亚胺基-2-(d-甘露吡喃糖 基硫代)乙基]氨基]乙基]硫代]丙醚络合物组成，并且通常具有以下结构：
[0009][0010]
应注意在一些情况中，某些葡萄糖基团可能不具有连接的氨基巯基链 索。
[0011]
替马诺塞的dtpa螯合剂部分用于将放射性同位素tc 99m连接至载体 分子。放射性标记(例如在
‘
990专利中所记载)后，形成锝替马诺塞：锝tc 99m 葡聚糖3-[(2-氨乙基)硫代]丙基17-羧基-10,13,16-三(羧甲基)-8-氧代-4-硫杂
ꢀ‑
7,10,13,16-四氮杂十七烷-1-基3-[[2-[[1-亚胺基-2-(d-甘露吡喃糖基硫代)乙 基]氨基]乙基]硫代]丙醚络合物。锝tc 99m替马诺塞具有以下结构：
[0012][0013]
锝tc 99m替马诺塞的分子式为 [c6h
10
o5]n·
(c
19h28
n4o9s
99m
tc)a·
(c
13h24
n2o5s2)b·
(c5h
11
ns)c，其中n为约35 至约58，并且n≥(a b c)。在市售版本中，其包含3-8个缀合的dtpa(二 乙烯三胺五乙酸)基团(a)；12-20个缀合的甘露糖基团(b)，以及0-17个未缀 合的胺侧链(c)。
[0014]
当用于乳腺癌、黑色素瘤或scc的分期时，锝tc 99m标记的替马诺 塞(即lymphoseek)表现出从注射位点的快速清除，通过前哨淋巴结的快速 且持续的摄取，以及通过远端或第二梯队淋巴结的低摄取。尽管已知替马 诺塞上的甘露糖基团负责受体结合，但是这样的结合的本质和范围是未知 的。
[0015]
尽管可能存在多种用于诊断和/或治疗与巨噬细胞相关的病症的装置和 技术，但是相信没有人在本发明人之前实施或使用了本文中所描述的发明。


技术实现要素：

[0016]
本发明具体涉及如下项目的技术方案：
[0017]
1.诊断与表达cd206的细胞相关的病症的方法，其包括以下步骤：
[0018]
(a)向个体给药药物组合物，所述组合物包含具有与其连接的可检测 基团的载体分子，所述载体分子包含：
[0019]
i.葡聚糖主链；和
[0020]
ii.至少一个受体底物，其直接或间接缀合至所述葡聚糖主链，选择所 述至少一个受体底物使得其特异性结合至cd206；
[0021]
其中所述载体分子是水溶性的；以及
[0022]
(b)在所述给药步骤后，在所述个体中除了前哨淋巴结的部位检测所 述可检测基
团的存在。
[0023]
2.项目1的方法，其中所述受体底物选自甘露糖、岩藻糖、n-乙酰基葡 糖胺、d-半乳糖、n-乙酰基半乳糖胺、唾液酸和神经氨酸的残基。
[0024]
3.项目2的方法，其中所述受体底物包含缀合至所述葡聚糖主链的单 个葡萄糖基团的选自甘露糖、岩藻糖、n-乙酰基葡糖胺、d-半乳糖、n-乙酰 基半乳糖胺、唾液酸和神经氨酸的两个或更多个残基。
[0025]
4.项目1-3中任一项的方法，其中所述载体分子具有至少一个链索，并 且所述受体底物以及所述可检测基团中的至少一个通过所述链索连接至所 述葡聚糖主链。
[0026]
5.项目4的方法，其中所述链索是-o(ch2)3s(ch2)2nh2。
[0027]
6.项目1-5中任一项的方法，其中所述检测步骤包括对与所诊断的所述 与表达cd206的细胞相关的病症的预定部位的组织中的所述可检测基团的 水平进行定量。
[0028]
7.前述项目中任一项的方法，其中所述与表达cd206的细胞相关的病 症是炎性病症。
[0029]
8.项目7的方法，其中所述与表达cd206的细胞相关的病症是血管生 成病症。
[0030]
9.项目7的方法，其中所述与表达cd206的细胞相关的病症是癌症、 结核病、hiv、卡波西肉瘤、阿尔茨海默病、类风湿性关节炎或多发性硬化。
[0031]
10.项目1和4-9中任一项的方法，其中所述至少一个受体底物是多 糖。
[0032]
11.项目11的方法，其中所述多糖是甘露聚糖。
[0033]
12.前述项目中任一项的方法，其中所述可检测基团是荧光团。
[0034]
13.项目12的方法，其中所述可检测基团是cy-3。
[0035]
14.前述项目中任一项的方法，其中所述可检测基团是放射性同位 素。
[0036]
15.项目14的方法，其中所述可检测基团是
68
ga。
[0037]
16.项目14的方法，其中所述可检测基团是
99m
tc。
[0038]
17.治疗与表达cd206的细胞相关的病症的方法，其包括以下步骤：
[0039]
(a)向个体给药治疗有效量的药物组合物，所述组合物包含具有与其 连接的治疗剂的载体分子，所述载体分子包含：
[0040]
i.葡聚糖主链；和
[0041]
ii.至少一个受体底物，其直接或间接缀合至所述葡聚糖主链，选择所 述至少一个受体底物使得其特异性结合至cd206；
[0042]
其中所述载体分子是水溶性的。
[0043]
18.项目17的方法，其中所述受体底物选自甘露糖、岩藻糖、n-乙酰 基葡糖胺、d-半乳糖、n-乙酰基半乳糖胺、唾液酸和神经氨酸的残基。
[0044]
19.项目18的方法，其中所述受体底物包含缀合至所述葡聚糖主链 的单个葡萄糖基团的甘露糖、岩藻糖、n-乙酰基葡糖胺、d-半乳糖、n-乙酰 基半乳糖胺、唾液酸和神经氨酸的两个或更多个残基。
[0045]
20.项目17-19中任一项的方法，其中所述载体分子具有至少一个链 索，并且所述受体底物以及所述治疗剂中的至少一个通过所述链索连接至 所述葡聚糖主链。
[0046]
21.项目20的方法，其中所述链索是-o(ch2)3s(ch2)2nh2。
[0047]
22.项目17-21中任一项的方法，其中所述与表达cd206的细胞相关 的病症是炎性
病症。
[0048]
23.项目22的方法，其中所述与表达cd206的细胞相关的病症是血 管生成病症。
[0049]
24.项目22的方法，其中所述与表达cd206的细胞相关的病症是癌 症、结核病、hiv、卡波西肉瘤、阿尔茨海默病、类风湿性关节炎、易损斑 块薄纤维-粥样斑或多发性硬化。
[0050]
25.项目17和20-24中任一项的方法，其中所述至少一个受体底物是 多糖。
[0051]
26.项目25的方法，其中所述多糖是甘露聚糖。
[0052]
27.项目17-21或25-26中任一项的方法，其中所述与表达cd206的 细胞相关的病症是类风湿性关节炎。
[0053]
28.项目17-21或25-26中任一项的方法，其中所述与表达cd206的 细胞相关的病症是卡波西肉瘤。
[0054]
29.项目1-6或10-16中任一项的方法，其中所述与表达cd206的细 胞相关的病症是类风湿性关节炎。
[0055]
30.项目1-6或10-16中任一项的方法，其中所述与表达cd206的细 胞相关的病症是卡波西肉瘤。
[0056]
31.诊断和/或治疗结核病的方法，其包括以下步骤：
[0057]
(a)向个体给药药物组合物，所述组合物包含具有与其连接的可检测 基团和/或治疗剂的载体分子，所述载体分子包含：
[0058]
i.葡聚糖主链；
[0059]
ii.至少一个受体底物，其直接或间接缀合至所述葡聚糖主链，选择所 述至少一个受体底物使得其特异性结合至cd206；和
[0060]
iii.至少一个放射性同位素或细胞毒素剂，其直接或间接缀合至所述葡 聚糖主链；以及
[0061]
(b)任选地，在所述给药步骤后，在所述个体的肺组织中检测所述放 射性同位素的存在。
[0062]
32.项目31的方法，其中所述受体底物选自甘露糖、岩藻糖、n-乙酰 基葡糖胺、d-半乳糖、n-乙酰基半乳糖胺、唾液酸和神经氨酸的残基。
[0063]
33.项目31的方法，其中所述受体底物是甘露聚糖。
[0064]
34.项目31-33中任一项的方法，其中
68
ga缀合至所述葡聚糖主链。
[0065]
35.对由哺乳动物个体获得的体液中表达cd206的细胞的数目进行 定量的离体方法，其包括以下步骤：
[0066]
(a)使由所述哺乳动物个体获得的所述体液与具有至少一个与其连 接的可检测基团的载体分子接触，使得所述载体分子结合至存在于所述体 液中的表达cd206的细胞，所述载体分子包含：
[0067]
i.葡聚糖主链；和
[0068]
ii.至少一个受体底物，其直接或间接缀合至所述葡聚糖主链，选择所 述至少一个受体底物使得其特异性结合至cd206，
[0069]
其中所述载体分子是水溶性的；
[0070]
(b)将不溶性细胞与未结合载体分子分离，以提供细胞部分；以及
[0071]
(d)测量所述细胞部分中可检测基团的水平，以对表达cd206的细胞 的数目进行定量。
[0072]
36.项目35的方法，其中使所述体液与所述载体分子接触的步骤包 括将所述体液与载体分子在容器中合并，之后将所得的混合物孵育预定的 时间。
[0073]
37.项目36的方法，其中将所述所得的混合物在约0℃至约25℃的 温度下孵育。
[0074]
38.项目36的方法，其中将所述所得的混合物在约4℃的温度下孵育。
[0075]
39.项目36-38中任一项的方法，其中将不溶性细胞与未结合载体分 子分离的步骤包括将体液与载体分子的混合物离心。
[0076]
40.项目35-39中任一项的方法，其中所述可检测基团包含至少一个 荧光团，并且所述测量所述细胞部分中可检测基团的水平的步骤包括所述 细胞部分的荧光水平的光谱学测量。
[0077]
41.项目35-39中任一项的方法，其中所述载体分子包含替马诺塞。
[0078]
42.项目40的方法，其中所述荧光团是cy3。
[0079]
43.项目35-42中任一项的方法，其中所述体液包括滑液。
[0080]
44.诊断药盒，其用于对由哺乳动物个体获得的体液中的表达cd206 的细胞的数目进行定量，其包含：
[0081]
(a)包含具有至少一个与其连接的可光谱学检测的基团的载体分子 的第一密封容器，所述载体分子包含：
[0082]
i.葡聚糖主链；和
[0083]
ii.至少一个受体底物，其直接或间接缀合至所述葡聚糖主链，选择所 述至少一个受体底物使得其特异性结合至cd206，
[0084]
其中所述载体分子是水溶性的；
[0085]
(b)包含稀释剂的第二密封容器；
[0086]
(c)至少一个离心瓶；以及
[0087]
(d)至少一个吸收池。
[0088]
45.项目44的诊断药盒，其中所述稀释剂是无菌盐水或缓冲的稀释 剂溶液。
[0089]
46.根据前述项目中任一项的载体分子组合物。
[0090]
47.药盒，其用于制备项目1-34中任一项的诊断或治疗组合物。
附图说明
[0091]
尽管本说明书以特别指出且明确地请求保护本发明的权利要求书结 束，相信由以下某些实施例的说明结合所附的附图会更好地理解本发明。图1a描绘pbmc的荧光激活细胞分选(“facs”)分析，其聚焦于巨 噬细胞和淋巴细胞。图1b中显示facs分析，其表明在未标记的替马诺塞 的存在下替马诺塞-cy3结合至巨噬细胞的抑制(**p《0.005)。图1c中上方 和下方左侧图像描绘共焦显微镜检查的代表性图像(放大率：120x)，其分别 显示在替马诺塞(无荧光团)不存在或存在下，替马诺塞-cy3与巨噬细胞的 结合(上方左侧)以及结合的抑制(下方左侧)；且中上方和下方右侧图像是显 示(与各个dic图像的左侧)相邻的荧光图像的单独细胞结构的dic图像。图2显示代表性的共焦图像(放大率：160x)，其表明cd206的表达(图 2a)、通过巨
述载体分子的形式，而在其它实施方案中，所述药盒包含已经具有与其连 接的一个或多个可检测基团和/或一个或多个治疗剂的载体分子。在一个特 定实施方案中，药盒包含容器中的载体分子(例如为冻干粉末的形式)以及一 种或多种便于在向个体给药前一个或多个放射性同位素的连接的辅料。
[0095]
在另一实施方案中，提供诊断和/或治疗方法，这些方法包括将所述载 体分子向个体给药。在治疗方法的情况中，一个或多个治疗剂被连接至所 述载体分子。在诊断方法中，一个或多个可检测基团被连接至所述载体分 子。在另外的实施方案中，提供组合的诊断和治疗方法，其中一个或多个 治疗剂以及一个或多个可检测基团均被连接至所述载体分子，使得所述载 体分子可用于诊断方法和治疗。在另一实施方案中，所述治疗剂和所述可 检测诊断基团是相同的化合物或物质—即，所连接的基团不仅可检测，还 是治疗性的(例如镓-68)。其它实施方案提供离体诊断方法，其中由个体收 集体液或组织样品，然后将其与具有一个或多个与其连接的可检测基团的 载体分子接触。
[0096]
如本文中所使用，术语“诊断”包括测定病症的存在或不存在、测定未来 特定病症会产生的可能性，和/或测定个体中之前确证的病症的状态。例如， 在癌症的情况中，术语诊断涵盖测定癌症的存在或不存在、癌症的阶段， 和/或检测患者中癌前病况的存在、不存在或阶段。测定之前确证的病症的 状态还包括测定病症(例如与巨噬细胞相关的病症)的进展、无进展、减弱或 缓解。并且术语“治疗”(“treatment”以及“treating”)意图意指最宽泛的含义， 不仅包括治愈或消除病症(例如疾病或医学病况)，还包括降低病症、减慢病 症的进展或者改善病症的一个或多个作用。
[0097]
可使用本文中的组合物和方法的与巨噬细胞相关的以及其它与表达 cd206的细胞相关的病症包括但不限于：获得性免疫缺陷综合征(aids)、 急性播散性脑脊髓炎(adem)、艾迪生病、丙种球蛋白缺乏血症、过敏性疾 病、斑秃、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、强直性脊柱炎、抗磷脂综合 征、抗合成酶综合征、动脉斑块病症、哮喘症、动脉粥样硬化、特应性变 态反应、特应性皮炎、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、 自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性 甲状腺功能减退、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴组织增生综合征、 自身免疫性周围神经病变、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病 综合征、自身免疫性孕酮皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫 性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、贝罗病/贝罗同心圆性硬化、贝西氏病(disease)、berger病、bickerstaff氏脑炎、布劳综合征(blau syndrome)、 大疱性类天疱疮、心血管易损斑块(vulnerable plaque)、卡斯尔曼病、乳糜泻、 美洲锥虫病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性复发性多病灶性骨 髓炎、慢性阻塞性肺疾病、慢性静脉淤积性溃疡、变应性肉芽肿性血管炎 (churg-strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮、寇甘综合征、冷凝集素疾病、 补体成分2缺乏、接触性皮炎、颅动脉炎、crest综合征、局限性肠炎、 库欣综合征、皮肤白细胞破碎性血管炎、德戈氏病(dego's disease)、德尔肯 氏病、疱疹样皮炎、皮肌炎、i型糖尿病、ii型糖尿病、弥漫性皮肤系统性 硬化症、德雷斯勒综合征、药物性狼疮、盘状红斑狼疮、湿疹、肺气肿、 子宫内膜异位症、与附著点炎症相关的关节炎、嗜酸细胞性筋膜炎、嗜酸 细胞性胃肠炎、嗜酸细胞性肺炎、获得性大疱性表皮松解症、结节性红斑、 胎儿红血球母细胞增多症、特发性混合性冷球蛋白血症、埃文斯综合征、 进行性骨化性纤维发育不良(fibrodysplasia ossificans progressive)、纤维化肺 泡炎(或者
特发性肺纤维化)、胃炎、胃肠道类天疱疮、戈谢病(gaucher’sdisease)、肾小球肾炎、肺出血-肾炎综合征、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征 (gbs)、桥本脑病、桥本甲状腺炎、心脏病、过敏性紫癜、妊娠疱疹(又称 作妊娠性类天疱疮)、化脓性汗腺炎、hiv感染、休-斯二氏综合征、低丙球 蛋白血症、感染性疾病(包括细菌感染性疾病)、特发性炎性脱髓鞘疾病、特 发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、iga肾病、包涵体肌炎、炎症性 关节炎、炎性肠病、炎性痴呆、间质性膀胱炎、间质性肺炎、青少年特发 性关节炎(又称作幼年型类风湿关节炎)、川崎病、兰伯特肌无力综合征、白 细胞碎裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、线状iga病(lad)、类狼疮性 肝炎(又称作自身免疫性肝炎)、红斑狼疮、淋巴瘤样肉芽肿病、马吉德综合 征(majeed syndrome)、恶性肿瘤(包括癌症(例如肉瘤、卡波西肉瘤、淋巴瘤、 白血病、癌和黑色素瘤)、美尼尔氏病、显微镜下多血管炎、米勒
·
费希尔综 合征、混合性结缔组织病、硬斑病、mucha-habermann病(又称作急性苔藓 痘疮样糠疹)、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓 炎(又称作德维克病)、神经性肌强直、眼瘢痕性类天疱疮、眼阵挛-肌阵挛 综合征、奥德氏甲状腺炎(ord's thyroiditis)、复发性风湿病、pandas(儿童 链球菌感染相关性自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、帕金森 病症、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、帕-罗二氏综合征、parsonage-turner综合征、睫状体扁平部炎、寻常型天疱疮、外周动脉疾病、 恶性贫血、静脉周脑脊髓炎、poems综合征、结节性多动脉炎、风湿性多 肌痛、多肌炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、进展性炎症 性神经病、银屑病、银屑病关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、 罗斯默森氏症、雷诺现象、复发性多软骨炎、莱特尔综合征、再狭窄、下 肢不宁综合征、腹膜后纤维化、类风湿性关节炎、风湿热、结节病、精神 分裂症、施密特综合征、schnitzler综合征、巩膜炎、硬皮病、败血症、血 清病、干燥综合征、脊椎关节病、斯提耳病(成人期发病)、僵人综合征、中 风、亚急性细菌性心内膜炎(sbe)、susac综合征、sweet综合征、西德纳姆 舞蹈病、交感性眼炎、系统性红斑狼疮、全身风湿性疾病、高安动脉炎、 颞动脉炎(又称作“巨细胞动脉炎”)、薄帽纤维粥样斑、血小板减少、痛性眼 肌麻痹综合征、移植(例如心/肺移植)排斥反应、横贯性脊髓炎、结核病、 溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病、未分化脊柱关节病、荨麻疹性血管炎、 脉管炎、白癜风以及韦格纳肉芽肿病。
[0098]
申请人发现，当向哺乳动物给药或者当与表达cd206的细胞离体接触 时，替马诺塞以及
‘
990专利中记载的其它相关载体分子以及基于葡聚糖主 链的其它载体分子专一性地与在巨噬细胞和某些其它细胞(例如卡波西肉瘤 梭形细胞和树突细胞)上发现的甘露糖受体蛋白cd206结合。即使在哺乳动 物中发现很多其它结合糖类的受体，相信没有其它受体特异地结合或转导 这些载体分子。cd206是在巨噬细胞和某些其它类型的细胞表面上发现的 c型凝集素蛋白。cd206蛋白(例如在巨噬细胞表面发现的)似乎是哺乳动物 患者中用于替马诺塞结合的单独途径的这一发现意味着替马诺塞载体分子 (以及相关的载体分子)可用作用于制备多种治疗和诊断有效分子物质(其用 于诊断和/或治疗与巨噬细胞相关的病症和其它与表达cd206的细胞相关 的病症)的基础。
[0099]
本文中所描述的组合物、药盒以及治疗和诊断方法中使用的载体分子 用于将可检测基团和/或治疗剂(例如细胞毒素剂)递送至细胞。这些载体分 子包含一个或多个能够使可检测基团和/或治疗剂连接至所述载体分子的特 征，以及一个或多个使所述载体分子与cd206专一性结合的受体配体(也称 作受体底物)。以这种方式，为了随后检测(即为了诊
断目的)和/或为了治疗 目的(例如为了将细胞毒素剂靶向至表达cd206的细胞或者表达cd206的 细胞附近的细胞)的目的，所述可检测基团或治疗剂被递送至表达cd206的 细胞。
[0100]
还发现本文中所描述的载体分子不仅在细胞表面上结合至cd206，而 且还内化入细胞中。一旦在巨噬细胞中，所述载体分子以看起来是稳定的、 非消化性囊泡的形式存留。该另外的发现意味着在体内结合至细胞的载体 分子的量不限于细胞表面上cd206受体的数目，因为一旦载体分子被内化， 所述载体分子连接的cd206蛋白会通过回收可用于结合另外的载体分子。 该方面允许大量的载体分子和所连接的可检测基团和/或治疗接团结合至 (包括结合入)靶细胞(从而改善诊断检测)，和/或允许大量的治疗剂被递送至 靶细胞。应注意，除非上下文另外说明，不管在何处提及结合至表达cd206 的细胞的载体分子时，这会被理解为包括已结合至cd206然后内化入细胞 的载体分子。
[0101]
如本文中进一步描述，在离体诊断测试的情况中，在一些实施方案中， 期望防止或限制载体分子的内化。对此的原因是本文中的一些离体诊断方 法是基于使结合至细胞的载体分子的数目与巨噬细胞或其它表达cd206的 细胞相互关联。如果载体分子被内化入细胞，则更多的载体分子能够连接 至cd206受体，因此使得在一些情况中将结合的载体分子的数目与表达 cd206的细胞的数目的相互关联更困难。如下文所描述，防止或限制载体 分子内化的一种方法是在孵育期间将体液和载体分子的混合物的温度降低 至低于哺乳动物个体的正常的生理温度(即正常体温)。载体分子内化抑制的 最高水平发生在稍高于0℃的温度(如下文所讨论)。
[0102]
本文中所使用的载体分子通常包含
‘
990专利中所记载类型的葡聚糖主 链。因此，所述主链包含多个主要通过α-1,6糖苷键连接的葡萄糖基团(即 残基)。也可存在其他键，例如α-1,4和/或α-1,3键。在一些实施方案中，所 述葡聚糖主链的mw为约1kda至约50kda，而在其它实施方案中，所述 葡聚糖主链的mw为约5kda至约25kda。在其它实施方案中，所述葡聚 糖主链的mw为约8kda至约15kda，诸如约10kda。而在其它实施方案 中，所述葡聚糖主链的mw为约1kda至约5kda，诸如约2kda。可基于 要诊断、评价或治疗的特定病症，以及高分子构建体是否用于治疗、诊断 或评价来选择所述葡聚糖主链的mw。
[0103]
例如，在期望所述分子跨过血脑屏障的情况中或者当期望降低停留时 间(即降低结合至cd206的持续时间)时，具有较小mw葡聚糖主链的载体 分子可能是适合的。在期望增加停留时间(即增加结合至cd206的持续时间) 的情况中，具有较大mw葡聚糖主链的载体分子可能是适合的。在其它实 施方案中，当更有效的受体底物(例如下文所述的支化的甘露糖基团)连接至 葡聚糖主链时，可应用具有较小mw(例如约1kda至约5kda)葡聚糖主链 的载体分子。更有效的受体底物会更有效地结合至cd206和/或持续更长的 时间，从而允许使用更小的葡聚糖主链。
[0104]
除了葡聚糖主链，所述载体分子还包含一个或多个结合cd206的受体 底物，其中所述受体底物缀合至葡聚糖主链。连接至所述葡聚糖主链的各 受体底物包括连接至所述葡聚糖主链的一个或多个葡萄糖残基的选自甘露 糖、岩藻糖、n-乙酰基葡糖胺、d-半乳糖、n-乙酰基半乳糖胺、唾液酸和神 经氨酸的一个或多个残基。在一些实施方案中，受体底物连接至葡聚糖主 链的约10％至约50％的葡萄糖残基，或者约20％至约45％的葡萄糖残基、 或者约25％至约40％的葡萄糖残基。(应注意，本文中提及的mw，以及受 体底物、链索以及连接至葡聚糖主链的诊断/治疗基团的数目和缀合程度是 指对于给定量的载体分子的平
均量，因为合成技术会导致一些变化。)
[0105]
在一些实施方案中，各受体底物包括连接至单独的葡萄糖残基的甘露 糖、岩藻糖、n-乙酰基葡糖胺、d-半乳糖、n-乙酰基半乳糖胺、唾液酸和神 经氨酸的单个残基(即各受体底物是单糖)。在其它实施方案中，两个或更多 个受体底物(其可以是相同或不同的)相互缀合，并在单个葡萄糖残基处连接 至所述葡聚糖主链。因此，在这些实施方案中，各个受体底物包括二糖、 寡糖或多糖。在多糖受体底物的情况中，一个实施方案包括甘露聚糖，特 别是支化的甘露聚糖。
[0106]
在一个特定实施方案中，所述载体分子包含葡聚糖主链(例如其mw为 约1kda至约50kda)，至少一个甘露糖残基与其连接，任选地连同岩藻糖、 n-乙酰基葡糖胺、d-半乳糖、n-乙酰基半乳糖胺、唾液酸和神经氨酸的一个 或多个残基。在另一实施方案中，一个或多个支化的甘露糖残基连接至所 述葡聚糖主链的一个葡萄糖基团。支化的甘露糖残基意指包含甘露糖残基 (另一甘露糖、岩藻糖、n-乙酰基葡糖胺、d-半乳糖、n-乙酰基半乳糖胺、 唾液酸和神经氨酸残基单独地或组合地，线性地或以一个或多个分支的形 式与其连接)的二、寡或多糖。例如，所述载体分子的一些实施方案包含具 有至少一个与葡聚糖的葡萄糖基团连接的受体底物的葡聚糖主链，其中所 述受体底物包含三个或更多个甘露糖残基(线性的或支化的)。这样另外的甘 露糖残基提供与cd206增加的结合，从而能够例如使用更小mw的葡聚糖 主链。
[0107]
所述受体底物直接或间接地连接至所述葡聚糖主链的葡萄糖基团。在 一些实施方案中，所述受体底物通过首先连接至葡聚糖主链的至少一些葡 萄糖残基的链索(例如链索连接至葡萄糖基团的约50％至100％、或者约70％ 至约95％，或者甚至约80％至90％)连接。可在所有位置连接相同的链索， 或者可使用两种或更多种链索。
[0108]
如在
‘
990专利中所记载，在一些实施方案中，多个氨基封端的链索连 接至大部分的葡萄糖基团，其中所述氨基封端的链索包括
ꢀ‑
o(ch2)3s(ch2)2nh2，使得所述葡聚糖主链的葡萄糖基团的羟基被所述氨基 封端的链索代替。所述链索可通过使用烯丙基溴在葡聚糖主链的至少一些 羟基基团处烯丙基化来连接至葡聚糖主链。然后烯丙基与氨基乙硫醇盐酸 盐反应，以生成具有多个-o(ch2)3s(ch2)2nh2链索的葡聚糖主链。为了提 供cd206结合，受体底物(如上文所描述)缀合至至少一些链索的氨基。这 可通过
‘
990专利中所记载的方法或者本领域技术人员已知的其它方法来实 现。例如，甘露糖和/或半乳糖缀合至一些链索的氨基。如上文所讨论，所 连接的受体底物可以是单个基团，或者是两个或更多个受体底物的线性或 支化的链。
[0109]
可使用本领域技术人员已知的或者随后发现的多种其它链索来代替(或 者除了)-o(ch2)3s(ch2)2nh2。这些包括例如双官能团链索基团，例如亚烷 基二胺(h2n-(ch2)
r-nh2)，其中r为2-12；氨基醇(ho-(ch2)
r-nh2)，其中r 为2-12；氨基硫醇(hs-(ch2)
r-nh2)，其中r为2-12；任选地羧基保护的氨基 酸；乙二醇或聚乙二醇(h-(o-ch
2-ch2)
n-oh，其中n为1-4)。适合的双官能 团二胺包括乙二胺、1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、亚精胺、2,4-二氨基丁酸、赖 氨酸、3,3
’‑
二氨基二丙胺、二氨基丙酸、n-(氨乙基)-1,3-丙二胺、2-(4-氨基 苯基)乙基胺以及类似的化合物。一个或多个氨基酸也可用作所述双官能团 链索分子，例如β-丙氨酸、γ-氨基丁酸或者半胱氨酸，或者寡肽，诸如二或 三丙氨酸。
[0110]
其它双官能团链索包括但不限于：
[0111]-nh-(ch2)
r-nh-，其中r为2-5，
[0112]-o-(ch2)
r-nh-，其中r为2-5，
[0113]-nh-ch
2-c(o)-，
[0114]-o-ch
2-ch
2-o-ch
2-ch
2-o-，
[0115]-nh-nh-c(o)-ch
2-，
[0116]-nh-c(ch3)2c(o)-，
[0117]-s-(ch2)
r-c(o)-，其中r为1-5，
[0118]-s-(ch2)
r-nh-，其中r为2-5，
[0119]-s-(ch2)
r-o-，其中r为1-5，
[0120]-s-(ch2)-ch(nh2)-c(o)-，
[0121]-s-(ch2)-ch(cooh)-nh-，
[0122]-o-ch
2-ch(oh)-ch
2-s-ch(co2h)-nh-，
[0123]-o-ch
2-ch(oh)-ch
2-s-ch(nh2)-c(o)-，
[0124]-o-ch
2-ch(oh)-ch
2-s-ch
2-ch
2-nh-，
[0125]-s-ch
2-c(o)-nh-ch
2-ch
2-nh-，和
[0126]-nh-o-c(o)-ch
2-ch
2-o-p(o2h)-。
[0127]
在本文中所描述的治疗和诊断方法以及组合物中所使用的高分子还包 含连接至所述载体分子的可检测基团和/或治疗剂。在一些实施方案中，所 述可检测基团和/或治疗剂直接连接(例如通过共价键合化学和合成技术)至 所述载体分子的葡萄糖残基，而在其它实施方案中，如下文所描述，使用 一个或多个链索(其可以是如连接受体底物所使用的相同的或不同的链索) 连接所述可检测基团和/或治疗剂。
[0128]
在其它实施方案中，螯合剂连接至载体分子，以用于连接可检测基团 和/或治疗剂。在一些实施方案中，使用链索连接至载体主链，并且如
‘
990 专利中所记载，螯合剂缀合至一些链索的氨基，并且用于向其结合所述可 检测基团。适合的螯合剂包括本领域技术人员已知的或者之后研发的，诸 如四氮杂环十二烷四乙酸(dota)、巯基乙酰甘氨酰甘氨酰-甘氨酸(mag3)、 二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、二巯丁二酸、二苯基乙二胺、卟啉、亚胺二乙 酸和乙二胺四乙酸(edta)。
[0129]
在一个特定实施方案中，所述载体分子包含约10个至约15个葡萄糖 基团、或者约11个至约12个葡萄糖基团、或者约13个葡萄糖基团的葡聚 糖主链。受体底物缀合至约2个至约4个葡萄糖基团，或者在其它实施方 案中，两个葡萄糖基团。所述受体底物直接连接至葡萄糖基团或者使用链 索(例如本文中之前描述的那些之一，如-o(ch2)3s(ch2)2nh2)间接连接至葡 萄糖基团。所述受体底物包括支化的寡糖基团，各个包含三个或更多个选 自甘露糖、岩藻糖、n-乙酰基葡糖胺、d-半乳糖、n-乙酰基半乳糖胺、唾液 酸和神经氨酸的连接的基团。在一些实例中，连接至所述葡聚糖主链的一 个葡萄糖残基的各个受体底物包括支化的寡糖，其包含四个或更多个选自 甘露糖、岩藻糖、n-乙酰基葡糖胺、d-半乳糖、n-乙酰基半乳糖胺、唾液酸 和神经氨酸的连接的基团。在其它实施方案中，连接至所述葡聚糖主链的 一个葡萄糖残基的各个受体底物包括支化的寡糖，其包含五个或更多个， 或者甚至六个或更多个选自甘露糖、岩藻糖、n-乙酰基葡糖胺、d-半乳糖、 n-乙酰基半乳糖胺、唾液酸和神经氨酸的连接的基团。在其它实施方案中， 连接至所述葡聚糖主链的一个葡萄糖残
基的各个受体底物包括支化的寡 糖，其包含四个或更多个，或者在一些实例中五个或更多个甘露糖残基。 在载体分子包含约10-15、11-12或13个葡萄糖基团的葡聚糖主链的这些实 施方案中，诸如dtpa和/或dota的螯合剂直接或通过链索缀合至一个或 多个不具有受体底物的葡萄糖基团，以提供可检测基团和/或治疗剂的连接 点。
[0130]
在其它实施方案中，不需要螯合剂，特别是当可检测基团和/或治疗剂 可直接连接至所述葡聚糖主链的一个葡萄糖残基或者连接至所述葡聚糖主 链的葡萄糖残基的一个链索时。例如，胺反应性染料(诸如多种商购可得的 荧光团)容易与链索-o(ch2)3s(ch2)2nh2的氨基反应。这些染料通常为n
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯的形式，并且可以与载体分子链索上的氨基简单地 通过将载体分子与染料的nhs酯在共溶剂(例如dmso或者dmf)中混合 来反应。因此，对于一些应用，载体分子上不需要螯合剂。
[0131]
在一个具体的实施方案中，所述载体分子包含替马诺塞(本文中背景部 分描述的结构)。可检测基团(诸如胺反应性染料)可简单地通过使染料与未 缀合胺侧链(即未结合甘露糖残基或者dtpa的链索)上的氨基反应来容易 地连接至替马诺塞。放射性同位素也可容易地连接至替马诺塞，以提供可 检测基团和/或治疗剂。
[0132]
在一个特定实施方案中，所述载体分子为替马诺塞，如上文所描述， 其包含连接至部分链索的氨基的螯合剂dtpa。在为了诊断目的使用稍前， 放射性同位素(诸如
99m
tc)结合至dtpa(即起可检测基团的作用)。作为具体 实例，并且如在第8,545,808号美国专利(将其通过援引加入本文)中所记载， 提供包含在小瓶中的替马诺塞粉末的药盒，其中所述小瓶包含250mcg的 替马诺塞、20mg海藻糖二水合物、0.5mg甘氨酸、0.5mg抗坏血酸钠和 0.075mg氯化亚锡二水合物的混合物。所述小瓶的内容物是冻干的并且在 氮气下。在向个体给药前，将过锝酸钠tc 99m无菌地加入至替马诺塞粉末 的小瓶，以将替马诺塞用tc 99m放射性标记。之后，将稀释剂(诸如无菌 盐水)或者包含0.04％(w/v)磷酸钾、0.11％(w/v)磷酸钠(七水合物)、0.5％(w/v) 氯化钠和0.4％(w/v)苯酚的无菌的、缓冲的稀释剂溶液(ph为约6.8-7.2)加 入小瓶。所得的放射性标记的替马诺塞则容易用于向患者给药(例如通过静 脉内)。本文中所描述的其它载体分子可以类似地方式用
99m
tc或者多种其 它放射性同位素进行放射性标记。放射性治疗剂可类似地连接至所述载体 分子(视需要)-单独地或者与一个或多个可检测基团或者其它治疗剂组合。
[0133]
如本文中所使用，术语“可检测基团”意指原子、同位素或者化学结构， 其：(1)能够连接至所述载体分子；(2)对于人或者其它哺乳动物个体是无 毒性的；以及(3)直接或间接提供可检测信号，特别是不仅可以被测量，而 且其强度与可检测基团的量相关(例如成比例)的信号。所述信号可通过任意 适合的方法(包括光谱学、电学、光学、磁、听觉、无线电信号或者触诊检 测方法)检测。
[0134]
适合的可检测基团包括但不限于放射性同位素(放射性核素)、荧光团、 化学发光剂、生物发光剂、磁性基团(包括顺磁性基团)、金属(例如用作造 影剂)、rfid基团、酶促反应物、色度释放剂、染料和颗粒形成剂。
[0135]
作为具体实例，适合的可检测基团包括但不限于：
[0136]-适合用于磁共振成像(mri)的造影剂(诸如钆(gd
3
))、顺磁性和超顺磁 性材料(诸如超顺磁性氧化铁)；
[0137]-适合用于计算机断层(ct)成像的造影剂，诸如碘化分子、镱和镝；
[0138]-适合用于闪烁成像(或者闪烁显像)的放射性同位素，诸如锝-99m、 210/212/213/214
bi、
131/140
ba、
11/14
c、
51
cr、
67/68
ga、
153
gd、
88/90/91
y、
123/124/125/131
i、 111/115m
in、
18
f、
105
rh、
153
sm、
67
cu、
166
ho、
177
lu、
186
re和
188
re、
32/33
p、
46/47
sc、 72/75
se、
35
s、
182
ta、
123m/127/129/132
te、
65
zn和
89/95
zr；
[0139]-适合用于单光子发射型计算机断层成像(spect)的γ发射剂，诸如 99m
tc、
111
in、
117m
sn和
123
i。
[0140]-适合用于光学成像的染料和荧光剂，其包括但不限于染料(诸如青色素 荧光团(例如cy3、cy5、cy5.5、cy7)、alexa染料(由molecular probes, inc.获得))、蒽、香豆素、荧光黄、罗丹明、phrodo
tm
、绿荧光蛋白、双砷
‑ꢀ
四半胱氨酸、2-(4)-脱羟基腔肠素(dehydroxycoelenterazine)、5-fam-二乙酸 盐、异花青绿(isocyanine green)及其衍生物；以及
[0141]-适合用于正电子成象术(pet)的物质，例如
18
f。
[0142]
在一个特定实施方案中，本文中所描述的治疗和诊断方法以及组合物 中使用的载体分子包括青色素染料cy3。可例如通过将使用vera等人jnm 2001,42:951-9中记载的方法制备的甘露糖基-葡聚糖的二甲基亚砜(dmso) 溶液用滴加的cy3的n-羟基琥珀酰亚胺酯的dmso溶液处理来制备cy3
‑ꢀ
替马诺塞。在室温下放置1小时，然后将反应混合物纯化，以提供cy3-替 马诺塞。
[0143]
在另一特定实施方案中，将荧光剂alexa488(alexa488 羧酸，琥珀酰亚胺基酯)以与cy3类似的方式连接至所述载体分子。
[0144]
在一些实施方案中，在本文中所描述的治疗和诊断方法以及组合物中 使用的载体分子包含连接至所述载体分子的治疗剂—其代替可检测基团或 者与之结合。如本文中所使用，术语“治疗剂”意指在治愈或者消除疾病或者 其它病况中是有效的以及在减少、减慢其进展或者改善疾病或者其它病况 的不良反应中是有效的原子、同位素或者化学结构。
[0145]
在一些实施方案中，所述治疗剂包含具有杀死巨噬细胞以及巨噬细胞 环境周围的组织的能力的高能量杀死性同位素。适合的放射性同位素包括： 210/212/213/214
bi、
131/140
ba、
11/14
c、
51
cr、
67/68
ga、
153
gd、
99m
tc、
88/90/91
y、
123/124/125/131
i、 111/115m
in、
18
f、
105
rh、
153
sm、
67
cu、
166
ho、
177
lu、
186
re和
188
re、
32/33
p、
46/47
sc、 72/75
se、
35
s、
182
ta、
123m/127/129/132
te、
65
zn以及
89/95
zr。
[0146]
在其它实施方案中，所述治疗剂包含非放射性种类，其选自但不限于： bi、ba、mg、ni、au、ag、v、co、pt、w、ti、al、si、os、sn、br、 mn、mo、li、sb、f、cr、ga、gd、i、rh、cu、fe、p、se、s、zn和 zr。
[0147]
在另外的实施方案中，所述治疗剂选自细胞生长抑制剂、烷化剂、抗 代谢药、抗增殖剂、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂、蒽环类抗生素 药物、长春胺药物、丝裂霉素、博来霉素、细胞毒核苷、蝶啶类药物、二 炔烯(diynene)、鬼臼毒素、毒性酶和辐射增敏药物。作为更具体的实例，所 述治疗剂选自氮芥、三亚乙基磷酰胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮 芥、白消安、美法仑、三亚胺醌、亚硝基脲化合物、阿霉素、洋红霉素、 柔红霉素(道诺霉素)、多柔比星、异烟肼、吲哚美辛、镓(iii)、
68
镓(iii)、氨 基蝶呤、氨甲蝶呤、甲氨蝶呤、光神霉素、链黑霉素、二氯甲氨蝶呤、丝 裂霉素c、放线菌素-d、泊非霉素、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、替加氟、6-巯嘌 呤、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷、鬼臼毒素、依托泊苷、磷酸依托泊苷、 美法仑、长春碱、长春新碱、异长春碱、长春地辛、长春罗新、泰素、紫 杉烷、细胞松弛素b、短
杆菌肽d、溴乙啶、依米丁、替尼泊苷(tenoposide)、 秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、普 鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、蓖麻毒蛋白亚基a、 相思豆毒蛋白、白喉毒素、肉毒菌毒素、微囊藻毒素(cyanginosin)、蛤蚌毒 素、志贺毒素、破伤风、海豚毒素、单端孢霉烯、震颤真菌毒素(verrucologen)、 皮质类固醇、黄体酮、雌激素、抗雌激素、雄激素、芳香酶抑制剂、卡奇 霉素、埃斯波霉素和蒽环类抗生素。
[0148]
在其中治疗剂为激素或者激素拮抗剂的实施方案中，所述治疗剂可选 自泼尼松、羟孕酮、甲羟孕酮(medroprogesterone)、己烯雌酚、他莫昔芬、 睾酮和氨鲁米特。
[0149]
在其中所述治疗剂为前药的实施方案中，所述治疗剂可选自可转化为 更有活性的细胞毒游离药物的包含磷酸酯的前药、包含硫代磷酸酯的前药、 包含硫酸酯的前药、包含肽的前药、(包含-内酰胺的前药，包含任选取代的 苯氧乙酰胺的前药、包含任选取代的苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和5
‑ꢀ
氟尿苷前药。
[0150]
所述治疗剂通过多种方式连接至载体分子。在一些实施方案中，并且 如
‘
990专利中所记载，螯合剂缀合至一些链索的氨基，并且用于向其结合 治疗剂。适合的螯合剂包括本领域技术人员已知的或者之后研发的，诸如 四氮杂环十二烷四乙酸(dota)、巯基乙酰甘氨酰甘氨酰-甘氨酸(mag3)、 二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、二巯丁二酸、二苯基乙二胺、卟啉、亚胺二乙 酸和乙二胺四乙酸(edta)。
[0151]
本文中所描述的高分子化合物可通过使用多种药学上可接受的载体和 媒介物中的任意种类，以多种方法给药。例如将包含具有一个或多个与其 连接的可检测基团和/或治疗剂的载体分子以及药学上可接受的载体的药物 制剂通过静脉内注射、皮下注射、皮内注射、实质性引入(parenchymalintroduction)、吸入、肺灌洗、栓剂或口服、舌下、颅内、眼内、鼻内或者 耳内引入来给药。本发明的诊断方法不仅包括检测病症存在或不存在，还 包括追踪对于病症治疗的进展，例如通过首次在预定的靶点位置检测表达 cd206的细胞，施用治疗(通过本文中所描述的治疗方法或者其它治疗方法) 以及之后再次在预定的靶点位置检测表达cd206的细胞。表达cd206的细 胞的差异(如果足够显著)可用于证明所述治疗的效果或者缺乏治疗效果。诊 断还包括鉴别易罹患病症的个体或者表明病症有可能在未来出现症状或者 产生的诊断标记物。
[0152]
除了诊断和治疗多种病症的体内方法，上文所描述的载体分子(特别是 当一个或多个可检测基团连接至所述载体分子时)可在离体诊断方法和诊断 药盒中使用。这些方法和药盒用于对体液样品中表达cd206的细胞的数目 进行定量，然后将其用于诊断目的。例如，在给定量的体液中测定的表达 cd206的细胞的数目用于诊断存在或不存在医学病况，或者用于测定患者 中之前确证的医学病况的状态，其通过将表达cd206的细胞的数目与之前 获得的或者搜集的数据对比来进行。
[0153]
在一个具体实例中，这些离体诊断方法和药盒用于诊断哺乳动物个体 中类风湿性关节炎(“ra”)的存在，以及评价之前测定患有ra的哺乳动物个 体中类风湿性关节炎的阶段或治疗进展。在ra的情况中，由所述个体收集 的体液为滑液，其由怀疑或者已知被ra侵袭的关节提取。
[0154]
使所述体液与具有至少一个与其连接的可检测基团的载体分子接触， 使得所述载体分子结合至存在于所述体液中的表达cd206的细胞。该接触 步骤可在任意适合的容器
中实现，如适合地利用的小瓶，其可为有帽的， 以能够使液体和载体分子充分地混合。在一个实施方案中，所述液体和载 体分子在离心瓶(也称作离心管)中合并。在使液体和载体分子混合后，将所 得的混合物孵育足以使载体分子结合至体液中的细胞表面上的cd206的预 定的时间。
[0155]
在一些实施方案中，在低于个体的生理温度的温度下进行孵育，以抑 制载体分子被内化入细胞。如果载体分子被内化入细胞，所述分子连接的 cd206受体变得对于连接另外的载体分子再次可用。然而，通过降低孵育 温度，载体分子的内化被抑制或预防。在一些实施方案中，将混合物在约0℃ 至约25℃的温度下孵育；在其它实施方案中，在约1℃至约10℃的温度下 孵育；并且在另一实施方案中，在约1℃至约4℃的温度下孵育。在一个特 定实施方案中，将所述混合物在约4℃的温度下孵育。
[0156]
在一些实施方案中，将所述混合物孵育约1分钟至约1天的时间。在 一些实施方案中，将所述混合物孵育约1分钟至约1小时的时间。在其它 实施方案中，将所述混合物孵育约1分钟至约5分钟的时间。
[0157]
孵育后，将体液的细胞由未结合的载体分子分离。由于细胞是不溶的， 并且所述载体分子是水溶性的，可通过离心实现分离。未结合的载体分子 会留在液体相中，因此可被容易地移除(例如通过倾析或使用吸管)。之后， 测量细胞部分(即离心后的固体相)中可检测基团的水平。测量方法会取决于 可检测基团的性质。
[0158]
例如当可检测基团时染料(诸如荧光团)时，测量所述细胞部分中可检测 基团的水平包括所述细胞部分的荧光水平的光谱学测量。
[0159]
本发明的实施方案还包括用于对体液样品中表达cd206的细胞的数目 进行定量的诊断药盒，因而其用于诊断目的。所述药盒通常包含：
[0160]
(a)包含具有至少一个与其连接的可光谱学检测的基团(例如荧光团) 的如本文中之前所描述的载体分子的第一密封容器；
[0161]
(b)包含稀释剂的第二密封容器；
[0162]
(c)至少一个离心瓶；和
[0163]
(d)至少一个用于光谱学测量装置的吸收池。
[0164]
在一个特定实施方案中，所述稀释剂为盐水、灭菌水或缓冲溶液，诸 如磷酸盐缓冲液。
[0165]
所述诊断药盒可例如与适合在医师办公室或者小实验室中使用的荧光 计结合使用。可使用任意适合的荧光计。荧光计的实例包括但不限于 quantus
tm
荧光计(promega corporation)、单管荧光计和-multi 多 模式酶标仪。
[0166]
类似地，所述药盒可例如与适合在医师办公室或者小实验室中使用的 离心机结合使用。在一个实施方案中，所述离心机是迷你离心机。在另一 实施方案中，所述离心机是微型离心机。离心机的实例包括但不限于 myfuge
tm
迷你离心机,alkali scientific。
[0167]
在一个实施方案中，所述离心管是离心滤器(centrifugal filter)。在另一 实施方案中，所述离心管是微型离心滤器。在一个特定实施方案中，所述 微型离心滤器的体积为约50μl至约750μl。在另一特定实施方案中，所 述微型离心滤器包括配备有锥形的2ml、加盖的接收管的聚丙烯滤器 (thermo scientific)。
[0168]
下面的部分提供表明结合至cd206的载体分子的实施例，并且描述可 用本文中所
描述的载体分子诊断和/或治疗的多种与表达cd206的细胞相 关的病症(包括数据和诊断/治疗方法)。然而会理解，以下实施例中描述的 具体载体分子仅是可用于诊断或治疗下文所讨论的病症的那些的示例。因 此，任意上文描述的载体分子可用于代替下文具体实施例中的那些。此外， 还会理解本发明不限于下文讨论的具体病症的诊断和/或治疗，因为其仅意 在是特定实施方案的示例。
[0169]
替马诺塞-cy3结合至人巨噬细胞
[0170]
使用人外周血单核细胞(pbmc)测定替马诺塞是否结合至淋巴细胞或 巨噬细胞。将由淋巴细胞和巨噬细胞组成的一定量的pbmc培养5天，以 使血单核细胞能够分化为巨噬细胞(人单核细胞源性巨噬细胞或者
ꢀ“
mdm”)，然后用或不用未标记的(冷)替马诺塞预处理。然后，将细胞用不 同浓度(1.25、2.5、5.0、10和20μg/ml)的cy-3标记的替马诺塞(cy3-替马 诺塞)孵育。由流式细胞仪通过对巨噬细胞和淋巴细胞单独地设门(gating)来 分析结合至pbmc细胞群落的替马诺塞。所得的数据表明替马诺塞以剂量 依赖性地方式特异性地结合至巨噬细胞群落，如图1a中所示。图1a描绘 pbmc的荧光激活细胞分选(“facs”)分析，其聚焦于巨噬细胞和淋巴细胞。 对于用冷替马诺塞(100倍过量)预处理的巨噬细胞，cy3-替马诺塞的结合接 近被完全破坏，即使是在最高的浓度下，如图1b中所示，(facs分析表明 在未标记的替马诺塞的存在下替马诺塞-cy3结合至巨噬细胞的抑制，**p《 0.005)。
[0171]
为了确证这些发现，以类似的方法处理在单层培养物中的mdm，并进 行荧光共焦显微镜检查实验。cy3-替马诺塞与巨噬细胞的结合是很明显的， 并且对于用冷替马诺塞预处理的巨噬细胞，该结合接近被完全破坏，如图 1c中所示。描绘的数据是两个独立的实验(各个一式两份地进行)中代表性 的，并且结果与替马诺塞和巨噬细胞的受体介导的结合一致。图1c中上方 和下方左侧图像描绘共焦显微镜检查的代表性图像(放大率：120x)，其分别 显示在替马诺塞(无荧光团)不存在或存在下，替马诺塞-cy3与巨噬细胞的 结合(上方左侧)以及结合的抑制(下方左侧)。灰色区域表明巨噬细胞细胞核， 并且白色部分表明替马诺塞-cy3。图1c中上方和下方右侧图像是显示(与 各个dic图像的左侧)相邻的荧光图像的单独细胞结构的dic图像。“dic
”ꢀ
是微分干涉对比(相差显微镜检查)。
[0172]
替马诺塞与人巨噬细胞上的cd206的共定位
[0173]
将mdm单层用cy3-替马诺塞孵育10分钟，用低聚甲醛固定，用抗 mr初级ab孵育，并用alexa fluor 488-缀合的次级ab染色。然后通过共 焦显微镜检查分析单层。图2显示代表性的共焦图像(放大率：160x)，其表 明cd206的表达(图2a)、通过巨噬细胞的替马诺塞结合(图2b)以及在共焦 和相差图像(图2c和2d)中cd206和替马诺塞之间的共定位。所显示的结 果是三个独立的实验中的代表。
[0174]
已知巨噬细胞与数种疾病状态有关，例如卡波西肉瘤(ks)、类风湿性 关节炎(ra)和结核病(tb)，其中具有高cd206表达的巨噬细胞定位至疾病 损伤处，并且可用于使用cd206生物标记技术成像的靶向。
[0175]
卡波西肉瘤的诊断和治疗
[0176]
炎症是对于多种疾病状态的必须响应，包括肿瘤表达。现在认为该炎 症性过程的主要组分由巨噬细胞驱动，巨噬细胞影响肿瘤发生、增进和进 展。对于癌症组织，已发现与肿瘤相关巨噬细胞(tam)在肿瘤侵入、癌症细 胞增殖和转移中发挥重要作用。这些m2-型巨噬细胞通常表达高水平的 cd206。对于巨噬细胞依赖性进展的模型肿瘤是卡波西肉瘤
(ks)，因为ks 由tam驱动。还有ks转移与共表达巨噬细胞标记物的肿瘤细胞相关的有 力证据。因此，巨噬细胞可能是在ks的发病机制中要探索的重要靶点。
[0177]
hiv相关的ks是与疱疹病毒(hhv8/kshv)感染相关的进展性、多病 灶肿瘤。ks涉及皮肤和内脏组织，后期疾病与器官受累有关。ks是其中 炎症似乎在肿瘤进展中发挥关键作用的癌症形式。ks肿瘤细胞共表达的多 种巨噬细胞标记物对于目前用于ks和aids治疗的抗病毒方法变得耐药。 申请人发现，由于替马诺塞和上文中所描述的相关载体分子结合至cd206， 在肿瘤实质中，该cd206表达可能是研发针对tam和转移性肿瘤细胞， 并追踪其转移模式、诊断和对疗法响应的新抗肿瘤药的关键途径。
[0178]
ks巨噬细胞可能是对于标准抗逆转录病毒疗法耐药的受感染细胞的 主要hiv贮器。肿瘤相关形式可能直接有助于ks发病，但是患有晚期疾 病的aids患者的组织中的所有形式的hiv都是巨噬细胞向性的。
[0179]
脂质体多柔比星((多柔比星hcl脂质体注射剂),janssenproducts,lp)是对于治疗对抗逆转录病毒疗法(art)耐药的ks最有效的， 然而其通常是不可用的。治疗会受益于对卡波西肉瘤的免疫组成的更好理 解，这通常对于监测治疗响应是特别重要的。
[0180]
历史上没有能够鉴别患有ks的患者中ks特异性病损或者转移病灶的 成像平台。这在临床护理的递送中是麻烦的，因为除了追踪皮肤病损，医 师不能对患有ks的患者适当地分期。已知ks累及淋巴结和器官，但至今 没有方法能够确证肿瘤累及至皮肤下。
[0181]
在一个实施方案中，上文中所描述的具有结合至cd206的受体底物的 载体分子用于提供ks累及的节以及疾病的其它内脏部位的有效成像。在另 一实施方案中，本发明的组合物提供定义肿瘤负担的方法，使得除了目前 使用的单独抗逆转录病毒疗法(其在世界范围内越来越多数目的ks患者中 被证明是无效的)，能够进行更早的肿瘤特异性治疗。在另一实施方案中， 本发明的组合物提供通过数种外部成像方法之一示踪肿瘤转移模式的方 法，所述外部成像方法包括但不限于闪烁显像、spect、spect/ct、γ探 测(体内或离体)、外部(离体)或内部(体内)荧光。在另一实施方案中，本发 明的组合物提供示踪对于肿瘤疗法的响应的方法，所述肿瘤疗法如之前说 明的方法，或者在体内利用生检组织以及实验室情境中应用的相同诊断剂。
[0182]
对于上述的巧妙精确的诊断方法是通过关键受体(cd206)介导的靶向 巨噬细胞的成像。已将cd206成功地用作使用替马诺塞的准确成像的靶点， 其通过替马诺塞分子上的甘露糖基团的相互作用结合至cd206，其被带入 巨噬细胞，在此其在稳定的非消化性囊泡中持续。可检测基团(诸如cy3或 者tc99m)允许靶向成像。该精确的靶向机制提供对巨噬细胞驱动的疾病过 程(诸如ks和其它巨噬细胞介导的疾病和病症)的关键功能成像的新方法。 cd206的存在使得本发明的组合物能够被用作肿瘤特异性成像剂，其能够 鉴别患有ks的患者中的肿瘤细胞以及tam。
[0183]
在以下列出的研究中，在由aids患者中得到的卡波西肉瘤(ks)中评价 cd206靶向替马诺塞平台成像方法。这些研究表明大部分的tam和ks细 胞表达巨噬细胞标记物cd206，其可被本文中所描述的载体分子(诸如替马 诺塞)特异性靶向。这使得例如能够为了诊断的目的将可检测基团靶向至ks 病损。这还提供使用本文中所描述的载体分子的治疗组合物和方法。申请 人测试了大量ks的皮肤和内脏形式，以测定cd206是否存在于ks肿瘤 细胞和tam。申请人测试了hhv8/kshv感染的ks肿瘤细胞上巨噬细胞 的出现率以及ks病损细胞
亚群中结合cd206 替马诺塞的细胞的出现率。
[0184]
超过96％的ks病损细胞表达人甘露糖受体(mr,cd206)。
[0185]
ks病损细胞的免疫表型分析证实超过96％的肿瘤相关巨噬细胞(tam) 和ks细胞表达cd206，其可用本文中所描述的载体分子特异性靶向，以 定义ks病损或者提供ks的靶向治疗。包含66个aids ks的病例和对照 的组织微阵列(tma)获得自aids and cancer specimen resource(acsr)。 通过ihc研究鉴别mo抗原，并将结果标准化为kshv lana 细胞(ks肿 瘤特异性标记物)的比率。对于hhv8/kshv潜伏抗原(lana)以及巨噬细 胞标记物mac387(m1)、cd163(m2)、cd68(pan巨噬细胞)和cd206(巨 噬细胞甘露糖受体，m2)的存在，将tma染色，以测试在ks的情况中这 些抗原的流行率。包括在tma中的是皮肤以及内脏病损。66个ks病例的 免疫组织化学分析的结果如表1中所示。
[0186]
表1
[0187][0188]
mac387、cd163和cd68是巨噬细胞特异性标记物。
[0189]
表1总结了在tam和hhv8/kshv lana 肿瘤细胞上表达巨噬细胞 抗原的ks病例的比率。免疫组织化学分析表明在ks肿瘤相关细胞中，巨 噬细胞抗原是高度相关的。在ks病损中cd68巨噬细胞抗原染色的出现率 与ks为具有高度tam浸润的肿瘤高度一致。此外，如在有限数目的病例 中所报道，该深入分析证实ks梭形细胞也共表达包括cd206的巨噬细胞 抗原。
[0190]
ks组织中的大多数tam用m2特异性抗cd163抗体鉴别，而m1抗 mac387抗体鉴别细胞的较小子集。在多于90％的肿瘤中，cd68抗体还鉴 别大量的tam。ks肿瘤梭形细胞通常表达巨噬细胞抗原；然而，对于ks 肿瘤细胞(lana )和tam的最普遍抗原是cd206分子。在肿瘤组织中mo 抗原和cd206的表达与lana水平的关系在所有ks组织形式(斑、口、内 脏)中相似。来自非洲的ks组织的先导研究显示相似的结果。大多数lana ks肿瘤细胞共表达cd206。cd68 组织巨噬细胞也与非洲ks组织中 cd206抗原相关。结果证实tam和ks肿瘤细胞都表达cd206巨噬细胞 甘露糖受体(uccini等人ajp 1997年3月,150:929938)。
[0191]
图3描绘显示细胞核(蓝色)、ks肿瘤细胞(红色)和cd206(绿色)的标 记物的ks肿瘤细胞的显微照片，其表明结合至本文中所描述的载体分子的 cd206人甘露糖受体的全细胞(pan-cellular)表达。
[0192]
表达cd206的ks肿瘤细胞和巨噬细胞结合并内化替马诺塞-cy3
[0193]
如图4所示，ks肿瘤细胞和巨噬细胞均表达cd206，并在表面上结合 替马诺塞-cy3(红色)(图4a)，并且随后将替马诺塞-cy3内化入胞质小泡(图 4b)。内化是期望的，以提供替马诺塞-cy3的稳定蓄积，以及可能的特异性 ks病损成像。因此，本文中所描述的替马诺塞和其它载体可用作患有ks 的患者中的诊断和治疗组合物，以例如分期并对于对疗法特异性响应的肿 瘤定量地成像。作为扩展，其它种类的肿瘤可能包含类似的杂交样细胞， 并且可用替马诺塞系药剂成像，并且临床上用靶向巨噬细胞的疗法处理。
[0194]
免疫荧光染色和共焦显微镜检查
[0195]
免疫荧光染色和共焦显微镜检查研究组织巨噬细胞和表达lana的 ks肿瘤细胞的上cd206共表达的测定的比率。在由aids and cancer specimen resource(acsr)获得的包含66个aids ks病例和对照的组织微 阵列(tma)上进行免疫荧光染色和共焦显微镜检查研究。结果如图5中所 示，其描绘显示表达lana的肿瘤细胞和组织巨噬细胞上巨噬细胞甘露糖 受体cd206的共定位的共焦显微镜检查代表性图像。a,dapi(蓝色)；b, cd206(绿色)；c,lana(红色)；d,cd68(黄色)；e,全部合并(63x)。还检查 由hhv8 ks肿瘤细胞摄取的cy3-替马诺塞，并且图6描绘含cy3替马诺 塞的ks活检组织培养物的实施例共焦图像。hhv8 ks肿瘤细胞活检的共 焦图像。25x(cd68,黄色；cy3-替马诺塞,红色；hhv8,绿色；dapi,蓝色)
[0196]
还检查摄取入表达cd206的巨噬细胞的cy3-替马诺塞。将3天cd206 巨噬细胞培养物用cy3-替马诺塞(100μg/ml)在37℃下孵育4、24和48小 时。在于室温下暴露至缀合物持续相同的时间的培养物中测定cy3荧光的 背景水平。在表明cy3-替马诺塞摄取入cd206 巨噬细胞的所有时间点进 行cy3和cd206的流式细胞术评价。图7显示在用cy3-替马诺塞孵育3 天的cd206 巨噬细胞培养物中cy3和cd206的流式细胞术评价。
[0197]
鉴于上述，在另一具体实施方案中，本文中所描述的载体分子用于诊 断和/或治疗ks(以及相似类型的癌症和肿瘤)。为了诊断的目的，将可检测 基团(诸如
99m
tc或
68
ga)连接至载体分子(例如，连接至dtpa或dota螯 合剂)，并将所述放射性标记的组合物向个体给药(例如通过皮下或真皮内注 射至肿瘤或者疑似病损的近端(即附近)、直接向肿瘤内/病损内的肿瘤内或 病损内注射，或者通过静脉内注射)。会理解，本文中所描述的、本领域技 术人员已知的或者之后研发的可检测基团(诸如多种荧光团中的任一种)可 连接至所述载体分子以用于诊断ks。在向患者给药后，对肿瘤或病损部位 (或者疑似肿瘤或病损部位)成像，诸如通过闪烁显像(例如使用γ照相机)、 单光子发射型计算机断层成像(spect)、正电子成象术(pet)或者光学成像 (例如当可检测基团是荧光染料(诸如青色素(cyanimine)时)。然而会理解，可 以使用除了上述提及那些的用于检测ks肿瘤或者病损中标记的载体分子 的存在的其它诊断基团，以及多种其它成像或诊断方法。
[0198]
在一个用于ks诊断成像的具体实施方案中，所述载体分子是替马诺 塞：葡聚糖3-[(2-氨乙基)硫代]丙基17-羧基-10,13,16-三(羧甲基)-8-氧代-4
‑ꢀ
硫杂-7,10,13,16-四氮杂十七烷-1-基3-[[2-[[1-亚胺基-2-(d-甘露吡喃糖基硫 代)乙基]氨基]乙基]硫代]丙醚络合物。在该特定实施方案中，所述可检测基 团是
99m
tc或者
68
ga，并且在即要使用前，如本领域技术人员已知，通过将 所述载体分子与由
99m
tc产生器或者镓-68产生器的洗脱物混合来将所述可 检测基团连接至dtpa螯合剂。在其它实施方案中，所述可检测基团是 cy-3，并且如本领域技术人员已知连接至替马诺塞的链索。为了使用
99m
tc
‑ꢀ
替马诺塞或者
68
ga-替马诺塞的ks诊断成像，在一些实施方案中，所述放 射性标记的载体分子具有足够的放射性同位素，以当在向个体局部(例如皮 下)给药时，提供约0.3毫居里至约5.0毫居里，或者约0.5毫居里至约2.0 毫居里，或者约0.5毫居里或者约1毫居里的剂量。在其它实施方案中，诸 如为了使用
99m
tc-替马诺塞或者
68
ga-替马诺塞的ks诊断成像，所述放射 性标记的载体分子具有足够的放射性同位素，以当在向个体全身(例如静脉 内)给药时，提供约2mci至约30mci，或者约5mci至约30mci，以及约 10mci至约25mci的剂量。当通过注射向个体给药时，在一些实施方案中， 将所述放射性标记的载体与包括一种或多种赋形剂、稀释剂等(例如
无菌盐 水)的药学上可接受的载体组合。为了使用具有一个或多个与其连接的可检 测基团的替马诺塞的ks诊断成像，给药约50毫克至约500毫克的替马诺 塞。
[0199]
为了本文中所描述的载体分子在治疗ks中的治疗用途，将适合的治疗 剂连接至载体，并将所得的组合物与包括一种或多种赋形剂、稀释剂等的 药学上可接受的载体组合。如同诊断成像，将具有连接的治疗剂的载体分 子例如通过注射向患者给药，或者甚至向肿瘤或病损局部给药。适合用于 治疗ks的治疗剂包括功能化疗剂，例如多柔比星、柔红霉素、紫杉醇霉素、紫杉醇吉西他滨长春瑞滨博来霉素、长春碱(硫酸长 春碱)、长春新碱(硫酸长春新碱)和依托泊苷(vp-16)。 在一个特定实施方案中，所述治疗组合物包含多柔比星-替马诺塞，将其局 部(例如10μg剂量)或静脉内(例如5mg剂量)给药。
[0200]
ks成像实施例1
[0201]
获得由navidea biopharmaceuticals inc.销售的名称为注射剂药盒的替马诺塞冻干粉末。替马诺塞粉末的平均直径为约7nm，并 以0.250mg替马诺塞、20mg海藻糖二水合物、0.5mg甘氨酸、0.5mg抗 坏血酸钠和0.075mg氯化亚锡二水合物的混合物的形式包含在0.5ml的小 瓶中。然后使用由锝-99m产生器洗脱的钠99mtc-过锝酸盐，将替马诺塞粉 末用tc 99m放射性标记。使用无菌注射器，将大约92.5mbq(2.5mci)的 约0.35ml的钠99mtc-过锝酸盐无菌地加入到小瓶中。轻轻摇动小瓶，并 使放射性标记反应在室温下进行至少10-15分钟。然后向小瓶中加入生理盐 水，使内容物至2.5cc。任选地加入缓冲液，如在2010年8月5日公开的 第2010/0196272 a1号美国专利公开(其通过援引加入本文)中所记载。
[0202]
单个患者剂量为如上述制备的50mcg的替马诺塞和0.5mci的锝99m (总共0.5cc)。在放射性标记的六个小时内，将放射性标记的替马诺塞通过 皮下或真皮内注射给药。在又一实施方案中，在放射性标记的六小时内， 将100mcg的替马诺塞和1.0mci的锝(总共1cc)静脉内注射。
[0203]
在注射的30至180分钟内，将患者使用单光子发射型计算机断层成像 (spect)成像。皮肤病损内集中的放射性的发现是甘露糖结合受体和/或巨 噬细胞活性(其与卡波西肉瘤的存在一致)的推定证据，并且不存在这样的活 性会基本上排除卡波西肉瘤。
[0204]
ks成像实施例2
[0205]
以下说明通过使用(也称作锝99mtc-替马诺塞注射剂， 其为结合至存在于树突细胞和巨噬细胞的表面的甘露糖结合受体(cd206) 的放射性药物)的spect和spect/ct成像评价原发性皮肤卡波西肉瘤(ks) 的另一实施例。结果表明，在患有原发性皮肤卡波西肉瘤的患者中，使用 单光子发射型计算机断层成像(spect)和spect计算机断层成像 (spect/ct)，lymphoseek辅助卡波西肉瘤病损的检测。
[0206]
18岁的男性患者通过皮下注射接受单次剂量的用2.0mci 99mtc放射 性标记的50μg替马诺塞。99mtc-替马诺塞注射剂的总体积是0.3-0.5ml。
[0207]
具有标记病损(直径≥1cm)的患者通过打孔活组织检查确诊有ks(表达 cd206的皮下ks)。标记ks病损的部位在骨端：从肩至掌区域或者从腹股 沟至跖区。
[0208]
通过具有5/8英寸、25-或27-厚度尺寸固定针的注射器或者其它注射器 /针组合
给药的剂量是对于皮下注射可接受的。使注射离标记病损1.5
±
0.25 cm远，离标记病损4-8cm远，或者标记病损4-8cm的近处。
[0209]
在注射后立即使患者经历局部动态spect扫描，持续30分钟的时间。 初始扫描后，使患者在注射后1小时时经历全身spect/ct成像，并在注 射后4-6小时时经历全身spect成像。在4-6小时的spect扫描后，允许 患者离开成像中心。
[0210]
在注射后立即进行动态spect/ct(有限的ct暴露；ge infiniahawkeye 4)，持续30分钟(～3分钟/转)。各双头旋转分割入32(5.625
°
)角度。 在前、45
°
前斜位和后位置处采集spect图像，各个采集为3-5分钟，持续 总共30-45分钟的时间。
[0211]
以顺序模式进行在spect/ct系统上的采集。在设备具有低剂量的ct 组分下，通常通过在患者周围220
°
旋转x射线检测器来获得数据，x射线 管在140kv和2.5ma下操作。所获得ct图像具有面内2.5mm的空间分 辨率以及轴向10mm的空间分辨率。扫描时间为大约16秒每片，对于ct 的总共持续时间为30-45分钟。使用诊断ct组分的spect/ct系统的特征 在于更高的空间分辨率和更快的扫描时间(对于整个视野大约30秒)，但是 与之相关的是较高的辐射剂量。在ct采集时间结束时产生衰减图。
[0212]
结核病的诊断和治疗
[0213]
结核病是由细菌结核分枝杆菌引起的呼吸感染。响应于tb感染，患者 的免疫系统形成肉芽肿，这使得tb细菌能够保留在肉芽肿中持续长的时间 而无tb的明显临床症状。尽管治疗可以降低患者发生活性tb感染的风险， 但肉芽肿发挥对于诊断剂和治疗剂的屏障作用。巨噬细胞是形成和维持肉 芽肿过程中的一部分。由于此，申请人推测本文中所描述的载体分子可用 于靶向与tb肉芽肿相关的巨噬细胞表面上的cd206。
[0214]
替马诺塞与被tb感染的巨噬细胞的结合
[0215]
为了证明本文中所描述的载体分子与被tb感染的巨噬细胞结合以及 向其中居住有tb细菌的巨噬细胞内部递送诊断剂和/或治疗剂的能力，将 单层培养物中人单核细胞源性巨噬细胞(其构成tb肉芽肿的组分)用表达 gfp(gfp＝绿色荧光蛋白)的结核分枝杆菌(其通过巨噬细胞内化)感染。然 后将感染的细胞暴露于已用青色素(cy3)染料标记的替马诺塞，并通过共焦 显微镜检查进行分析。图5描绘tb感染的巨噬细胞的共焦显微镜检查。红 色表示cy3-替马诺塞，绿色表示gfp结核分枝杆菌，并且黄色表示cy3
‑ꢀ
替马诺塞与gfp结核分枝杆菌共定位。因此，图8表明cy3-替马诺塞结合 至巨噬细胞，并通过巨噬细胞内化。
[0216]
鉴于上述，在另一具体实施方案中，本文中所描述的载体分子用于诊 断和/或治疗结核病。为了诊断目的，将可检测基团(诸如
99m
tc或
68
ga)连接 至载体分子(例如连接至dtpa或者dopa螯合剂)，并将放射性标记的组 合物通过吸入、静脉内注射或者肺灌洗向个体给药。会理解，本文中所描 述的、本领域技术人员已知的或者之后研发的可检测基团可连接至所述载 体分子以用于诊断结核病。在向患者给药后，对个体的肺成像，诸如通过 闪烁显像(例如使用γ照相机)、单光子发射型计算机断层成像(spect)、正 电子成象术(pet)。然而会理解，可以使用除了上述提及那些的用于检测个 体的肺组织中标记的载体分子的存在的其它诊断基团，以及多种其它成像 或诊断方法。
[0217]
在一个用于结核病诊断成像的具体的实施方案中，所述载体分子是替 马诺塞：葡聚糖3-[(2-氨乙基)硫代]丙基17-羧基-10,13,16-三(羧甲基)-8-氧代
ꢀ‑
4-硫杂-7,10,13,16-四氮杂十七烷-1-基3-[[2-[[1-亚胺基-2-(d-甘露吡喃糖基 硫代)乙基]氨基]乙基]硫
代]丙醚络合物。在该特定实施方案中，所述可检测 基团是
99m
tc或者
68
ga，并且在即要使用前，如本领域技术人员已知，通过 将所述载体分子与由
99m
tc产生器或者镓-68产生器的洗脱物混合来将所述 可检测基团连接至dtpa螯合剂。为了使用
99m
tc-替马诺塞或者
68
ga-替马 诺塞的结核病诊断成像，在一些实施方案中，所述放射性标记的载体分子 具有足够的放射性同位素，以当在向个体给药时，提供约0.3毫居里至约 5.0毫居里，或者约0.5毫居里至约2.0毫居里，或者约1毫居里的剂量。
[0218]
当通过吸入向个体给药时，在一些实施方案中，将所述放射性标记的 载体与药学上可接受的媒介物组合。作为具体实例，将放射性标记的载体 通过吸入装置(例如固定剂量吸入器、吸入器中的干燥粉末、计量吸入器或 者喷雾器)递送至人个体的肺。在一个实施方案中，使用包含媒介物(包括药 学上可接受的惰性液体抛射剂，例如氟氯化碳、碳氟化合物或者氢氟烷烃) 中的放射性标记的载体的悬浮液的计量吸入器给药所述放射性标记的载 体。作为更具体的实施例，配制所述计量吸入器，以每喷(puff)递送约10 毫克至约5000毫克，或者约10毫克至约500毫克的放射性标记的载体。 在另一实施方案中，将放射性标记的载体在药学上可接受的媒介物(包括灭 菌水或盐水)中悬浮，并通过喷雾法给药。在另一实施方案中，将放射性标 记的载体干燥为粉末，然后由小袋或其它容器给药。
[0219]
为了本文中所描述的载体分子在治疗tb中的治疗用途，将适合的治疗 剂连接至载体，并将所得的组合物与包括一种或多种赋形剂、稀释剂等的 药学上可接受的媒介物组合。如同诊断成像，将具有连接的治疗剂的载体 分子例如通过吸入、静脉内注射或者肺灌洗向患者给药，以治疗tb(潜伏 或活性感染)。
[0220]
当通过吸入向个体给药时，在一些实施方案中，将所述治疗剂 载体与 药学上可接受的媒介物组合。作为具体实例，将治疗剂 载体通过吸入装置 (例如固定剂量吸入器、吸入器中的干燥粉末、计量吸入器或者喷雾器)递送 至人个体的肺。在一个实施方案中，使用包含媒介物(包括药学上可接受的 惰性液体抛射剂，例如氟氯化碳、碳氟化合物或者氢氟烷烃)中的治疗剂 载体的悬浮液的计量吸入器给药所述治疗剂 载体。作为更具体的实施例， 配制所述计量吸入器，以每喷递送约10毫克至约5000毫克，或者约10毫 克至约500毫克的治疗剂 载体。在另一实施方案中，将治疗剂 载体在药 学上可接受的媒介物(包括灭菌水或盐水)中悬浮，并通过喷雾法给药。在另 一实施方案中，将治疗剂 载体干燥为粉末，然后由小袋或其它容器给药。 并且在另一实施方案中，将所述治疗剂 载体在药学上可接受的媒介物中悬 浮，并以多达10mg治疗剂 载体分子的剂量静脉内给药。
[0221]
适合连接至载体分子用于治疗tb的治疗剂包括吲哚美辛、异烟肼和/ 或ga(任选地为
68
ga，使得组合物既用作诊断组合物又用作治疗组合物)。 在另一实施方案中，提供用于诊断和治疗结核病的组合物，其中
68
ga和ga (即非放射性ga)均缀合至所述载体分子。在其它实施方案中，吲哚美辛、 异烟肼和ga(任选地为
68
ga)中的两种或更多种缀合至所述载体分子。吲哚 美辛、异烟肼和ga是用于tb的已知治疗剂，但是通过将这些药剂中的一 种或多种连接至本文中所描述的载体分子，它们能够更好地进入与tb相关 的肉芽肿的巨噬细胞，其中所述治疗剂会靶向这些巨噬细胞中的tb细菌。
[0222]
下文提供有效用于诊断或治疗tb的组合物和方法。
[0223]
结核病成像实施例
[0224]
获得由navidea biopharmaceuticals inc.销售的名称为注
射剂药盒的替马诺塞冻干粉末。替马诺塞粉末以0.250mg替马诺塞、20 mg海藻糖二水合物、0.5mg甘氨酸、0.5mg抗坏血酸钠和0.075mg氯化亚 锡二水合物的混合物的形式包含在0.5ml的小瓶中。然后使用由锝-99m产 生器洗脱的钠
99m
tc-过锝酸盐，将替马诺塞粉末用tc 99m放射性标记。使 用无菌注射器，将大约92.5mbq(2.5mci)的约0.35ml的钠
99m
tc-过锝酸 盐无菌地加入到小瓶中。轻轻摇动小瓶，并使放射性标记反应在室温下进 行至少10-15分钟。然后在即要给药前向小瓶中加入生理盐水，使内容物至 5cc。
[0225]
制备放射性标记的组合物的单个患者剂量，使得剂量为100mcg 99m
tc
‑ꢀ
替马诺塞，1mci，总计2cc。在放射性标记的六个小时内，将放射性标记 的替马诺塞通过吸入给药。将组合物装载入气雾剂机器，然后患者吸入所 述组合物。在吸入后的约30至180分钟内，将患者的肺使用单光子发射型 计算机断层成像(spect)成像。在胸腔的门和纵膈区域中的集中放射性的发 现会是肉芽肿形成(其为结核病的标志)的推定证据。
[0226]
结核病治疗实施例
[0227]
获得由navidea biopharmaceuticals inc.销售的名称为注射剂药盒的替马诺塞冻干粉末。替马诺塞粉末的平均直径为约7nm，并 以0.250mg替马诺塞、20mg海藻糖二水合物、0.5mg甘氨酸、0.5mg抗 坏血酸钠和0.075mg氯化亚锡二水合物的混合物的形式包含在0.5ml的小 瓶中。然后将替马诺塞粉末结合至异烟肼分子。然后向小瓶中加入生理盐 水，使内容物至2.5cc。任选地加入缓冲液，如2010年8月5日公开的第 2010/0196272 a1号美国专利公开(其通过援引加入本文)中所记载。
[0228]
如上述制备的组合物的单个患者剂量的组合物为约100mcg至约500 mcg的替马诺塞(取决于患者的年龄和体重)，总计1cc。通过静脉内注射向 患者给药异烟肼-替马诺塞组合物。当以该方式给药时，预计异烟肼-替马诺 塞组合物会集中在包含细胞内结核杆菌的肉芽肿中，并将异烟肼递送至其 中tb居中的巨噬细胞的细胞内间隙。这能够将浓缩剂量的异烟肼直接递送 至结核杆菌，绕过了在tb治疗中经常碰到的药物递送的常见屏障。
[0229]
在上述tb治疗组合物和方法的变体中，吲哚美辛和/或ga(任选地为 68
ga)也以上文所描述的方式连接至替马诺塞，以提供ga-异烟肼-替马诺塞、 吲哚美辛-异烟肼-替马诺塞和/或吲哚美辛-ga-异烟肼-替马诺塞，然后将其 配制为适合的组合物，并以上文所述的多种方式给药。作为另外的变体， ga(任选地为
68
ga)和/或ga-异烟肼-替马诺塞代替异烟肼，以上文所描述的 方式连接至替马诺塞，以提供ga-替马诺塞、吲哚美辛-替马诺塞和/或ga
‑ꢀ
吲哚美辛-替马诺塞，然后将其配制为适合的组合物，并以上文所述的多种 方式给药。
[0230]
加重的动脉炎的诊断
[0231]
经历心脏性猝死的患者中的高风险冠状动脉粥样硬化斑块样品中的巨 噬细胞表达cd206，连同cd163。以将这些高风险斑块形态学上表征为薄 帽纤维粥样斑(thin-cap fibroatheromas,tcfa)，并通过活化的巨噬细胞经过 坏死斑块核和薄、纤维斑块帽浸润。因此，通过存在巨噬细胞证明的加重 的动脉炎是产生高风险形态学冠状斑块负担的增加的风险的指标。
[0232]
图9描绘恒河猕猴的左心室和主动脉的免疫荧光染色的图像。图像表 明cd163/alex-fluor488、cd206/alexa-fluor 568和cy3替马诺塞的共定 位。alexa-flour 568是容易以之前描述的方式连接至替马诺塞的荧光染料。
[0233]
基于它们标记活化的巨噬细胞的独特的性质，本发明的组合物提供对 动脉炎成
像并鉴别患有动脉巨噬细胞特异性炎症以及具有增高的免疫介导 心血管疾病(cvd)风险的个体的方法。
[0234]
本发明的一个实施方案提供使用单光子发射型计算机断层成像 (spect/ct)，对全身注射的本发明的靶向cd206的组合物的可测量的主动 脉摄取定量的方法。在另一实施方案中，本发明提供测量在动脉粥样硬化 斑块中浸润活化的巨噬细胞的密度的方法。
[0235]
在另一实施方案中，本发明提供功能动脉成像以表征单个冠状斑块破 裂倾向的方法。在另一实施方案中，本发明提供鉴别在经历临床显著事件 之前，处于cvd风险的患者的方法。在一个特定实施方案中，将所述方法 施用于特定高风险患者，诸如hiv感染患者。在另一特定实施方案中，将 所述方法施用于一般群落中具有处于破裂风险的易损斑块的患者。在另一 特定实施方案中，本发明提供用于监测调节加速的动脉粥样硬化形成的抗 炎策略的功效的功能动脉成像。
[0236]
动脉炎成像实施例
[0237]
以下实施例说明使用spect和spect/ct成像)评价主动脉和冠状动脉 99mtc-替马诺塞摄取的评价。
[0238]
具有记录的hiv感染与ccta上亚临床主动脉斑块和高风险形态冠状 斑块历史的18岁男性患者通过导管接受静脉内注射～10mci的99mtc-替马 诺塞。注射后将导管用大约10ml的盐水溶液冲洗。
[0239]
使个体位于siemens spect/ct扫描器(siemens medical solutions, hoffman estates,il)的扫描桌上。在大约60分钟的延滞时间后，使用2x60 视图，静态调强模式(step and shoot mode)，1min每胸和颈的视图(基于 spect之间进行的探测ct)进行spect采集。当对心脏成像时，进行门控 采集。胸廓图像包含所有的肺。spect和ct的数据采集花费大约70分钟。 在两个能量窗(即[90-120kev]和[126-154kev])获得所有投影，对于康普顿 散射使用散射窗校正，并且对于衰减使用ctac校正，以及使用迭代顺序 子集期望最大化算法(osem)重建)中。所得的重建量用于将靶点相对于背景 定额定量，使用引向感兴趣的99mtc-替马诺塞摄取的区域(相对于参比的感 兴趣区域标准化)的感兴趣区(roi)
[0240]
类风湿性关节炎的诊断
[0241]
类风湿性关节炎(“ra”)也是难以诊断和治疗的自身免疫病。本文中所 描述的载体分子(例如替马诺塞)被设计为结合至网状内皮细胞(其侵入病灶 ra组织)的cd206，使得其存在与受累的关节和/或内脏的ra相关。因此， 这些载体分子可用于ra的诊断成像以及治疗。例如，对于替马诺塞，甘露 糖起cd206的配体基团的作用，并且dtpa用作对于用例如tc99m放射性 标记的螯合基团。当将tc 99m-替马诺塞被注射入疑似病变部位(即其中存 在ra或疑似有ra的关节)附近时，为了诊断ra的目的，可使用结合静 态γ照相机的闪烁显像和/或结合手持γ检测探针的外科手术来定位受累的 组织。替马诺塞的平均直径为约7nm，该小直径允许向组织通道和毛细血 管中增强的扩散，这导致快速的注射部位清除和炎性体中cd206结合。例 如，之前所描述的荧光和/或放射性替马诺塞以及其它载体分子可用于具有 早期形式ra的关节的诊断和非侵入性成像。
[0242]
为了证明替马诺塞结合至患有ra的个体的滑液中巨噬细胞上发现的 cd206受体上，由诊断患有frank ra的患者获得滑液和组织。用 manocept-cy3、dapi核氟石(nuclear fluor)以及抗cd206-青色素绿探测组 织。通过微荧光对组织和液体成像，并将其与正常的
冷冻记录组织和由患 有骨关节炎(oa)的患者获得的滑液组织对比。通过数字图像分析比较mp 定位和荧光程度。特别地，使用扫描定量荧光显微法分析微荧光图像，使 用积分算法对组织和滑液的图像中cy3荧光染料的像素数定量和对比。
[0243]
结果表明患有ra的个体的滑液组织和液体包含大量的表达高水平 cd206的巨噬细胞群落。此外，这些mp将cy3-替马诺塞强烈地集中在 cd206上。此外，在正常和oa组织中巨噬细胞侵入和cd206保留的程度 显著低于ra组织，如参见图10。因此，本发明的载体分子(当提供有可检 测基团(如荧光团)时)不仅能够由滑液诊断ra(体内或离体)，而且可区分 ra和oa。
[0244]
使用cy3替马诺塞对小鼠中的软骨抗体诱导的关节炎中的巨噬细胞成 像
[0245]
使用荧光发光，将cy3-替马诺塞用于早期免疫介导关节炎的小鼠模型 和dba1小鼠中软骨抗体诱导的关节炎中的巨噬细胞成像。通过注射五种单 克隆抗体抗软骨混合物，随后三天中通过注射大肠杆菌脂多糖来在小鼠中 诱导关节炎。小鼠在7-11天中，于足、腕、跗、肘和膝中产生不同程度的 肿胀和发红的关节，表明有关节炎。
[0246]
在第7天或第8天对小鼠体内成像，并在第9天或第11天将小鼠安乐 死。安乐死后，将四肢解剖，移除皮肤，并将样品再次成像(表面荧光成像)， 放射照相(faxitron mx20)，然后脱钙、包埋，并用h&e染色。
[0247]
对于表面荧光成像，将小鼠静脉内注射cy3-替马诺塞，并在1-2小时 使用ivis lumina ii机器(caliper life sciences,hopkinton,ma)在体内和离体 进行表面荧光成像。使用活动图像软件观察可见和荧光图像，并使用兴趣 区(“roi”)和扣除背景荧光而对光子的数目进行定量。安乐死后，将四肢解 剖，移除皮肤(除了趾)，并再次成像。在关节炎膝和肘中检测特异性荧光， 参见图11。图12描绘患有免疫介导的关节炎的小鼠(上方)和对照小鼠(底部) 的肘和足的体内荧光。由于肘中的cy3-替马诺塞，与对照小鼠相比，患有 关节炎的小鼠具有增强的荧光。具有来自皮肤的背景荧光，其在足部是显 著的。图13显示离体荧光数据，并且图14描绘对照小鼠和患有免疫介导 的关节炎的小鼠的膝的离体荧光。尽管治疗的小鼠的两个膝(较下方的图像) 均患有关节炎，但右侧膝感染的更严重，并由于cy3-替马诺塞标记，具有 更大的荧光。
[0248]
在对于ra诊断成像的特定实施方案中，所述载体分子是替马诺塞，并 且所述可检测基团是在使用前连接至dtpa螯合剂的
99m
tc或
68
ga，或者连 接至氨基端封的链索的荧光染料(例如cy3)。在cy3-替马诺塞的情况中，应 用光学成像以测定ra的存在和/或程度。上文描述的小鼠研究证实了标记 的替马诺塞(例如cy-3-替马诺塞)可用于诊断ra。
[0249]
在对于ra治疗的特定实施方案中，所述载体分子为替马诺塞，并且所 述治疗剂为治疗性同位素。在一个特定实施方案中，所述治疗性同位素为 117m
sn。在对于ra治疗的另一特定实施方案中，所述载体分子为替马诺塞， 并且所述治疗剂为毒素。在一个特定实施方案中，所述毒素为肉毒菌毒素 或者霍乱毒素。在对于ra治疗的另一特定实施方案中，所述载体分子为替 马诺塞，并且所述治疗剂为氨甲蝶呤。
[0250]
ra成像实施例
[0251]
获得由navidea biopharmaceuticals inc.销售的名称为注射药盒的替马诺塞冻干粉末。替马诺塞粉末的平均直径为约7nm，并以 0.250mg替马诺塞、20mg海藻糖二水合物、0.5mg甘氨酸、0.5mg抗坏血 酸钠和0.075mg氯化亚锡二水合物的混
合物的形式包含在0.5ml的小瓶 中。然后使用由锝-99m产生器洗脱的钠99mtc-过锝酸盐，将替马诺塞粉末 用tc 99m放射性标记。使用无菌注射器，将大约92.5mbq(2.5mci)的约 0.35ml的钠99mtc-过锝酸盐无菌地加入到小瓶中。轻轻摇动小瓶，并使 放射性标记反应在室温下进行至少10-15分钟。然后向小瓶中加入生理盐 水，使内容物至5cc，并且如上文所描述，可任选地加入缓冲液。
[0252]
单个患者剂量为100mcg的替马诺塞和1mci的锝99m(总共2cc)。在 放射性标记的六个小时内，将放射性标记的替马诺塞通过静脉内注射给药。 在注射的30至180分钟内，将患者使用单光子发射型计算机断层成像 (spect)成像。在关节中集中的放射性的发现是关节区域中炎性过程(其为 类风湿性关节炎(ra)的标志)的推定证据，从而如果其不存在，则排除ra， 如果其均在，其辅助诊断早期或进行的ra。
[0253]
尽管在上文中详细讨论了用于诊断和/或治疗与巨噬细胞相关的病症的 数种组合物和方法，应理解，所讨论的组合物、特征、配置和使用所述组 合物的方法不限于上文提供的内容。