用于治疗平滑肌瘤的抗miRNA的制作方法

用于治疗平滑肌瘤的抗mirna
发明领域
1.本发明涉及药学和生物技术领域。
2.具体而言，本发明涉及用于治疗平滑肌瘤的抗mirna。
3.发明背景
4.子宫平滑肌瘤通常称为肌瘤，影响20-50％的育龄妇女，是最常见的妇科良性肿瘤(purohit p，vigneswaran k：肌瘤和不孕症(fibroids and infertility)，《最新妇产科报告(curr obstet gynecol rep)》2016，5：81-88)。
5.尽管肌瘤对女性生殖功能和生育能力的影响尚未完全确定，但普遍认为它们的存在会严重干扰成功开始怀孕的能力(pritts ea，parker wh，olive dl：肌瘤和不孕症：证据的更新系统评价(fibroids and infertility：an updated systematic review of the evidence)，《生育和不育(fertil steril)》2009，91:1215-1223)。尽管它们是良性肿瘤，甚至可能是无症状的，但在许多情况下，它们会导致重要的功能障碍，例如出血、盆腔压力以及如上所述的生育能力受损，因此需要治疗性干预。
6.目前，肌瘤的治疗基于使用干扰其生长背后的激素刺激并有时设法控制症状的药物以及手术切除。
7.子宫切除术，即手术切除子宫，是解决该问题的唯一最终解决方案。然而，在许多情况下，这种解决方案是不可行的，例如，如果妇女计划怀孕或仅仅出于心理原因。在这些病例中，局部切除肿瘤肿块是过去100年来的主要治疗选择，最初是通过剖腹手术，最近是通过腹腔镜或宫腔镜以侵入性较小的方式进行(el-balat a，dewilde rl，schmeil i，tahmasbi-rad m，bogdanyova s，fathi a，becker s：近20年现代肌瘤治疗：文献回顾(modern myoma treatment in the last 20years:a review of the literature)，《国际生物医学研究(biomed res int)》2018，2018：4593875)。
8.任何手术干预总是与有限但真实的并发症风险相关，例如出血(这通常需要输血，从而有传播传染性病原体的风险)、膀胱、肠道或输尿管病变、粘连形成、与麻醉和住院相关的并发症。
9.目前的药物疗法，包括口服避孕药、医用宫内节育器、gnrh激动剂和选择性孕酮调节剂(sprm)主要用于控制症状(出血和痛经)，而不影响平滑肌瘤的肿块大小(senol t，kahramanoglu i，dogan y，baktiroglu m，karateke a，suer n：左炔诺孕酮宫内节育器用作子宫平滑肌瘤手术治疗的替代方案(levonorgestrel-releasing intrauterine device use as an alternative to surgical therapy for uterine leiomyoma)，《临床和实验妇产科(clin exp obstet gynecol)》2015，42：224-227；singh ss，belland l：子宫肌瘤的现代管理：关注新兴医学疗法(contemporary management of uterine fibroids：focus on emerging medical treatments)，《当前医学研究意见(curr med res opin)》2015，31：1-12)。
10.即使最新一代的药物(如乙酸乌利司他)能够在没有明显副作用的情况下控制出血，也不能减小病变的大小(donnez j，tatarchuk tf，bouchard p，puscasiu l，
zakharenko nf，ivanova t，ugocsai g，mara m，jilla mp，bestel e，terrill p，osterloh i，loumaye e，pis组：术前肌瘤治疗的乙酸乌利司他对比安慰剂(ulipristal acetate versus placebo for fibroid treatment before surgery)，《新英格兰医学杂志(n engl j med)》2012，366：409-420；donnez j，tomaszewski j，vazquez f，bouchard p，lemieszczuk b，baro f，nouri k，selvaggi l，sodowski k，bestel e，terrill p，osterloh i，loumaye e，pis组：乙酸乌利司他与乙酸亮丙瑞林治疗子宫肌瘤(ulipristal acetate versus leuprolide acetate for uterine fibroids)，《新英格兰医学杂志(n engl j med)》2012，366：421-432)。
11.目前没有可以减小平滑肌瘤大小的药物疗法。
12.因此，有必要开发能够阻止或逆转平滑肌瘤生长的新保守疗法。
13.尤其，希望开发一种能够减小平滑肌瘤大小而不干扰女性排卵周期和生育能力的药物。
14.从形态学的角度来看，平滑肌瘤是子宫平滑肌细胞的良性增生性病变。尽管其频率很高，但平滑肌细胞异常增殖的原因仍然未知。
15.已经提出了几种理论来试图解释这些病变的病因，这些理论表明雌激素和孕酮的参与，以及其他几种生长因子、细胞因子、趋化因子、基因和microrna(mirna)的参与。
16.尤其，mirna是一种小rna分子，长约21个核苷酸，可调节不同基因的表达，与相应mrna的3'末端的非翻译区结合。
17.可以使用基于特定lna(锁核酸)的寡核苷酸或antagomir、即具有与mirna互补序列的寡核苷酸来抑制mirna。这些寡核苷酸通常包含化学修饰，这些修饰增加了它们对靶mrna分子的亲和力，并将它们捕获在非活性构型中或促进降解。
18.一般来说，基于mirna的生物药物或其抑制剂是干扰几种疾病潜在过程的有用工具。
19.发明概述
20.现已发现，抑制以下任何一种mirna都能够阻断原发性平滑肌瘤细胞的增殖：mir-148a-3p、mir-199a-5p、mir-33b-3p。
21.因此，本发明的一个目的是选自mir-148a-3p、mir-199a-5p和mir-33b-3p的一种或多种mirna的抑制剂，其用途是治疗子宫平滑肌瘤。
22.所述抑制剂优选地在基于锁核酸(lna)的寡核苷酸和抗mir之间选择。优选地，它是基于lna的寡核苷酸。
23.用于治疗子宫平滑肌瘤的包含所述抑制剂和至少一种药学上可接受的载剂和/或赋形剂的药物组合物也在本发明的范围内。
具体实施方式
24.定义
25.在本发明的上下文中，术语“microrna”或“mirna”是指存在于真核细胞中的短核糖核酸(rna)。
26.在本发明的上下文中，术语“抑制剂”是指能够降低或阻断一种或多种靶mirna活性的试剂。具体而言，它是指能够充分降低一种或多种靶mirna的活性的试剂。在一个具体
实施方式中，根据本发明的抑制剂是包含至少5个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够通过互补碱基配对与靶mirna结合，从而降低或阻断所述mirna的功能。对于“互补碱基配对”，意指所述寡核苷酸的一些或所有碱基与所述mirna靶标的一些或所有碱基配对。尤其，所述抑制剂能够将其至少40％的碱基与靶mirna的碱基配对；例如，所述抑制剂能够将其碱基的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％与靶mirna的碱基配对。术语“碱基”是指核碱基，即核苷的含氮部分，其又是核苷酸的组分。
27.在本发明的上下文中，术语“抗mir”或“antagomir”是指阻止其他分子与一种或多种特异性mirna结合的寡核苷酸分子。通常，它是一种小的合成rna，至少与靶mirna部分互补。尤其，其充分互补以结合和阻断所述靶mirna。
28.在本发明的上下文中，术语“锁核酸”或“lna”是指核糖环被2'-o、4'-c桥以n型构象封闭的核苷酸。lna描述于例如wo 99/14226、wo 00/56746、wo 00/56748、wo 01/25248、wo 02/28875、wo 03/006475和wo 03/095467以及其中提及的参考文献中。
29.在本发明的上下文中，术语“基于lna的寡核苷酸”是指包含至少一个如上定义的锁核酸(lna)的寡核苷酸。该寡核苷酸通常是与靶mirna至少部分互补的小的合成rna，特别是充分互补以结合和阻断靶mirna，包括至少一种锁核酸。
30.在本发明的上下文中，术语“子宫平滑肌瘤”是指子宫的良性肿瘤。“子宫纤维瘤”是同义词。
附图说明
31.图1：未处理或用对照mirna或用能够抑制mir-148a-3p、mir-199a-5p和mir-33b-3p的基于lna的寡核苷酸转染后的人平滑肌细胞的增殖(*p≤0.05；***p≤0.001)。
32.图2：未处理或用对照mirna或用能够抑制mir-148a-3p、mir-199a-5p和mir-33b-3p的基于lna的寡核苷酸转染后的人成纤维细胞的增殖(ns，不显著)。
33.图3：未处理、或在gymnosis条件下(在没有转染剂的情况下)施用对照mirna或施用能够抑制mir148a-3p、mir-199a-5p和mir-33b-3p的基于lna的寡核苷酸后的人平滑肌细胞的增殖(*p≤0.05)。
34.发明详述
35.mirna mir-148a-3p、mir-199a-5p和mir-33b-3p的序列是本领域专家已知的，例如它们可以在mirbase数据库中找到(www.mirbase.org，第22版)。
36.根据本发明，选自mir-148a-3p、mir-199a-5p和mir-33b-3p的至少一种mirna被抑制。
37.这些mirna的抑制是特别有利的，因为它显示出细胞特异性，实际上它诱导子宫平滑肌细胞增殖的减少而不影响成纤维细胞的增殖，从而减少可能的副作用。
38.甚至更优选地，mir-148a-3p被抑制。事实上，发现抑制这种mirna在减少子宫肌细胞的增殖方面特别有效。
39.根据本发明，使用一种或多种所述mirna的抑制剂。
40.任何能够降低或阻断一种或多种上述mirna的活性的抑制剂都可以根据本发明用于治疗子宫平滑肌瘤。
41.在一个具体实施方式中，所述抑制剂是包含至少5个核苷酸并且能够通过互补碱
基配对结合至靶mirna的寡核苷酸。例如，所述寡核苷酸可包含5至27个核苷酸，优选10至21个核苷酸。
42.所述寡核苷酸能够将其部分或全部碱基与所述mirna靶标的部分或全部碱基配对。尤其，所述抑制剂能够将其至少40％的碱基与靶mirna的碱基配对；例如，它将其至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的碱基与靶mirna的碱基配对。
43.在一个优选的实施方式中，所述抑制剂优选地在基于锁核酸(lna)的寡核苷酸和抗mir之间选择。
44.在一个实施方式中，所述抑制剂是抗-mir，其中所述抗-mir是与靶mirna至少部分互补的rna寡核苷酸。尤其，其充分互补以结合和至少部分地阻断所述靶mirna。优选地，所述抗-mir包含5至27个核苷酸并且具有至少40％的与靶mirna的碱基互补的碱基。
45.在一个优选的实施方式中，所述抑制剂是如上定义的基于lna的寡核苷酸。优选地，其包含5-27个核苷酸并且包含至少一种锁核酸。其还可以包含一种以上的锁核酸。所述基于lna的寡核苷酸与mirna靶至少部分互补，特别是它可以与mirna靶标至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％互补。
46.基于lna的寡核苷酸是该领域常用的抑制剂且可商购获得。例如，它们可从以下公司获得：凯捷公司(qiagen)、艾菲美特公司(affymetrix)、珀金埃尔默公司(perkin elmer)。
47.在本发明的一个具体实施方式中，所述基于lna的寡核苷酸是寡核苷酸，特别是反义寡核苷酸，具有与mirna靶标互补的完美序列。所述基于lna的寡核苷酸可以与mirna靶标100％互补。例如，它可以是基于lna的寡核苷酸，具有与mircury lna mirna power inhibitor(可从凯捷公司商购获得)类型的mirna靶标互补的完美序列。
48.本领域的专家能够根据本领域的一般知识找到适合根据本发明使用的抑制剂。
49.实际上，如何鉴定能够抑制已知mirna活性的试剂在本领域是众所周知的。尤其，抗mir和基于lna的寡核苷酸通常用于抑制靶mirna的活性。本领域技术人员可以容易地设计或购买能够抑制选自mir-148a-3p、mir-199a-5p和mir-33b-3p之间的至少一种mirna的活性的抗mir或基于lna的寡核苷酸。
50.如本发明所述使用的抑制剂可以任何形式施用于有需要的对象。
51.特别地，它可以通过施用小rna的常规方法施用。
52.在一个实施方式中，其是在不使用转染剂的情况下施用的。
53.在另一个实施方式中，其以药物组合物的形式施用。
54.所述药物组合物可以是用于肠胃外或宫内施用的制剂形式，但其他形式同样适用于实施本发明。
55.该领域的专家将根据患者的状况、病理的严重程度、患者的反应以及该领域一般知识中包括的任何其他临床参数来决定施用的有效时间。
56.所述药物组合物含有至少一种本发明的抑制剂以及药学上可接受的载剂和/或赋形剂。所述赋形剂可以是特别有用的制剂助剂，例如增溶剂、分散剂、悬浮剂或乳化剂。
57.根据本发明，根据现有技术，所述抑制剂可以与脂质分子一起施用，例如可以促进其运输的阳离子脂质。施用这种抑制剂的另一种方法是通过已知用于施用rna或dna的合适的载体。优选的载体是腺相关载体(aav)，一种众所周知的用于体内施用dna的病毒载体
(mingozzi f，high ka：使用aav治疗遗传疾病的体内基因转移：进展与挑战(therapeutic in vivo gene transfer for genetic disease using aav：progress and challenges).《自然评论遗传学(nature reviews genetics)》.2011may；12(5)：341)。
58.注射是优选的施用途径。注射优选是全身性的。宫内施用也是有利的。该领域的专家可以决定通过任何常规途径施用抑制剂。
59.对于该领域的一般知识，可以参考remington's pharmaceutical sciences，最新版本。
60.另一种可能的施用方法包括使用具有非病毒超声的基因转移技术(声穿孔)，其可用于用根据本发明的抑制剂局部转染子宫细胞。这种技术是众所周知的，可以参考例如工作具有相移纳米乳液的小干扰核糖核酸的声空化介导传递(acoustic cavitation-mediated delivery of small interfering ribonucleic acids with phase-shift nano-emulsions)；《医学和生物学超声(ultrasound med biol)》.2015aug；41(8)：2191-201。
61.另一种施用方式是通过使用含药宫内节育器释放抑制剂。例如，所述宫内节育器可以用如上定义的能够抑制所述一种或多种mirna的至少一种基于锁核酸(lna)的寡核苷酸或至少一种抗mir进行药物治疗。用于本文公开的这种含药宫内节育器在本发明的范围内。
62.所有这些方法和制剂都是本领域常规的和众所周知的，不需要进一步解释。
63.基因疗法是另一种递送形式，其中将核酸递送到有需要的对象的细胞中。根据本发明，基因疗法可用于将如上定义的寡核苷酸抑制剂引入对象的细胞中，例如引入子宫细胞中，用于根据本发明的用途。
64.以下实施例进一步说明本发明。
65.实施例1
66.mirna候选物的选择
67.使用2000个mirna的文库进行筛选，以鉴定能够调节平滑肌细胞系增殖的mirna。特别是，筛选旨在鉴定能够刺激平滑肌细胞增殖的mirna。
68.筛选结果如下表1所示。
69.在筛选中被考虑的mirna中，1913个不干扰细胞活力，37个增加了2.5倍以上的增殖。
70.通过将这些数据与已发表的平滑肌瘤和正常子宫肌层样本基因表达谱数据库中可用的数据进行交叉引用(chuang td，khorram o：利用下一代rna测序对lncrna、mirna和mrna的表达谱及其在平滑肌瘤中的差异表达进行分析(expression profiling of lncrnas，mirnas，and mrnas and their differential expression in leiomyoma using next-generation rna sequencing)，《生殖科学(reprod sci)》2018，25：246-255)，选择了14种mirna(表1)。
71.表1
[0072][0073]
在选择的14个mirna中，只有7个“种子序列”被表示出来，这表明它们的促增殖作用可能是由常见的分子机制介导的。此外，两个mirna(mir-20a-5p和mir-17-5p)属于同一簇，位于13号染色体上，因此预计它们的表达会受到共同调节。
[0074]
从相同的选择中，考虑了以下mirna进行进一步验证：mir-148a-3p、mir-199a-5p、mir-20a-5p、mir-17-5p和mir-33b-3p。选择mir-148a-3p和mir-199a-5p是因为它们在筛选中位于第二和第五位，在平滑肌瘤中表达最多，并且与健康子宫肌层相比在平滑肌瘤中也过度表达。已知另外两种mirna(mir-20a-5p和mir-17-5p)可刺激其他细胞类型的增殖，并被选为潜在的阳性对照。最后，发现mir-33b-3p在平滑肌瘤中的表达相对较差，但在健康的子宫肌层中完全不存在，因此包括在潜在的感兴趣的候选物中。
[0075]
实施例2
[0076]
体外验证
[0077]
根据实施例1中报告的结果，我们测试了五种候选的基于lna的寡核苷酸(mircury lna mirna强力抑制剂，凯捷公司)阻断原发性平滑肌瘤细胞增殖的能力，这是通过与的里雅斯特burlo garofolo妇幼医院的现有合作获得的。
[0078]
基于lna的寡核苷酸使用标准转染方案与阳离子脂质进行测试，或在g ymnosis条件下(不使用转染剂)进行测试，以更好地模拟可能的体内应用(对于使用的程序，请参见例如单剂量心内注射促再生microrna可改善心肌梗塞后的心脏功能(single-dose intracardiac injection of pro-regenerat ive micrornas improves cardiac function after myocardial infarction).lesizza p，prosdocimo g，martinelli v，sinagra g，zacchigna s，giacca m.《循环研究(circ res)》.2017apr 14；120(8)：1298-1304；通过递送锁核酸反义寡核苷酸进行有效的基因沉默，无需转染试剂的辅助(effici ent gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleoti des，unassisted by transfection reagents).stein ca，hansen jb，lai j，w u s，voskresenskiy a，a，worm j，m，souleimanian n，miller p，soifer hs，
castanotto d，benimetskaya l，h，koch t.《核酸研究(nucleic acids res)》.2010jan；38(1)：e3)。通过掺入edu分析增殖，随后通过荧光显微镜(imagexpress micro，分子装置公司(molecular devices))进行量化，以观察标记有抗体的平滑肌细胞，该抗体识别对平滑肌具有特异性的肌动蛋白同种型。所有细胞的细胞核都用dapi染色。
[0079]
使用17-5p lna和20a-5p lna作为阳性对照，在平滑肌瘤细胞和原代成纤维细胞中测试了抑制剂(3个候选物加2个阳性对照)以验证它们的作用特异性。
[0080]
这些实验能够选择三种基于lna的寡核苷酸，它们在抑制平滑肌瘤细胞的增殖方面非常有效，并且在成纤维细胞中没有活性：lna 148a-3p、lna 199a-5p和lna 33b-3p(图1和2)。
[0081]
使用gymnosis方法，我们验证了使用以下mirna特异性抑制剂显著减少细胞增殖：148a-3p lna、199a-5p lna和33b-3p lna。所有三种抑制剂都强烈减少平滑肌细胞的增殖(图3)。