用于产丁酸菌的益生元组合物的制作方法

1.本发明涉及用于产丁酸菌的益生元组合物。


背景技术：

2.近些年，肠道细菌与健康的相关性受到注目，在世界各地进行了研究。作为与改善肠道内环境相关的术语已知的“益生菌”通常是指通过改善肠道菌群的平衡而给人体带来有益作用的活微生物，通常已知的是双歧杆菌等。另外，作为上述益生菌所同化的物质，有“益生元”，其在消化道上部不会被分解/吸收，而成为大肠中共生的有益细菌的选择性营养源，促进它们的增殖，改善并维持大肠内的肠道菌群组成，使其健康且平衡，有助于促进并维持人体的健康。
3.作为大肠中共生的有益细菌之一，有产丁酸菌。丁酸是存在于肠道内的一种短链脂肪酸，不仅是对大肠细胞提供能量的主要营养素，而且是调节宿主的基因表达、细胞分化、肠道组织发育、免疫调节、氧化应激降低、和腹泻控制等包括肠道在内的各种功能的细胞介质(非专利文献1)。
4.虽然将丁酸摄入体内对健康而言是有益的，但丁酸会释放出非常强烈的难闻的气味，因此以食品、药物等形态摄取是不现实的。另外，在肠道内生息的主要的产丁酸菌的氧敏感性极高，因此在体外培养极为困难，也难以将产丁酸菌制剂化并摄取(非专利文献2)。
5.现有技术文献
6.非专利文献
7.非专利文献1：cell.2016jun 2；165(6)：1332-1345
8.非专利文献2：best.pract.res.clin.gastroenterol.2017dec；31(6)：643-648.


技术实现要素：

9.发明要解决的问题
10.鉴于上述状况，本发明人等想到，使在肠道内生息的产丁酸菌增殖对于维持/改善健康是有用的。因此，本发明的课题在于，提供使作为产丁酸菌的普拉氏粪杆菌(faecalibacterium prausnitzii)增殖的益生元。
11.用于解决问题的方案
12.本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现：藻酸和/或其盐能够在肠道内使包括普拉氏粪杆菌在内的产丁酸菌显著增殖。进而，还获得如下见解：在非肠道的环境、即不存在除产丁酸菌以外的细菌的情况下，普拉氏粪杆菌无法同化具有一定大小以上的藻酸和/或其盐且不会增殖。基于这些，想到特定大小的藻酸和/或其盐作为用于普拉氏粪杆菌的益生元是有效的，以至完成了本发明。
13.即，本发明的第一方式为用于普拉氏粪杆菌的益生元组合物，其含有重均分子量10000以下的藻酸和/或其盐。
14.本方式中优选前述产丁酸菌为粪杆菌属细菌。
15.本方式的组合物优选含有组合物整体的0.1质量％以上的藻酸和/或其盐。
16.本方式的组合物优选为饮食品。
17.本方式的组合物优选为药品。
18.另外，本发明的第二方式为制造用于产丁酸菌的益生元组合物的方法，其包括将长链藻酸和/或其盐水解至重均分子量10000以下的工序。
19.本方式中优选前述产丁酸菌为粪杆菌属细菌。
20.另外，本发明的第三方式为制造用于产丁酸菌的益生元饮食品的方法，其包括如下工序：将长链藻酸和/或其盐水解至重均分子量10000以下的工序；及在饮食品原料中添加前述工序中得到的重均分子量10000以下的藻酸和/或其盐的工序。
21.本方式中优选前述产丁酸菌为粪杆菌属细菌。
22.发明的效果
23.根据本发明，可提供能使普拉氏粪杆菌高效地增殖的益生元。普拉氏粪杆菌所产生的丁酸作为细胞介质发挥作用并维持改善健康，因此本发明在产业上是非常有用的。
附图说明
24.图1是对藻酸钠(试样1)与外部标准品(普鲁兰多糖)的分子量进行比较的hplc谱图。
25.图2是示出用分别添加了分子量不同的藻酸钠(试样1(
●
)、试样2(〇))或瓜尔胶水解物(试样3(
△
))的培养基、或用未添加试样的培养基(
◇
)单独培养普拉氏粪杆菌时的、培养基浊度的经时变化的图。
26.图3是用添加了藻酸钠(试样1)的培养基单独培养普拉氏粪杆菌时的、培养0或48小时后的培养基和普鲁兰多糖标准品的hplc谱图。
27.图4是用添加了藻酸钠(试样1)的培养基单独培养普拉氏粪杆菌时的、培养0或48小时后的培养基和试样1的hplc谱图。
具体实施方式
28.接着，对本发明进行详细地说明。但是，本发明不受以下的实施方式限定，可以在本发明的范围内进行自由变更。
29.本发明的组合物含有重均分子量10000以下的藻酸和/或其盐(以下也记为“藻酸类”)。重均分子量的上限优选为9000以下，更优选为8000以下，进一步优选为7000以下，特别优选为5000以下。重均分子量的下限没有特别限定，通常为194以上。此处，藻酸盐的重均分子量是换算为藻酸时的值。
30.对于本发明的组合物，只要不阻碍其效果，则也可以包含重均分子量大于上述数值范围的藻酸和/或其盐。
31.本说明书中藻酸类的重均分子量是在以下的条件下利用hplc法测得的值。
32.测定机器：ultimate3000(thermo公司制)
33.检测：refracto max 521检测器(thermo公司制)、
34.柱：tskgel g3000pw(东曹公司制)
35.流动相：0.1m硝酸钠水溶液
36.流速：0.3ml/分钟
37.柱温：40℃
38.标准品：standard p-82(shodex公司制)
39.需要说明的是，在上述条件下利用hplc测得的分子量是可能会偏离实际的由聚合度计算出的“真实的”分子量的“表观的”值。
40.如后述的实施例所示，聚合度4～5的藻酸低聚糖在上述条件下测定时分子量约为3500。
41.因此，本发明的组合物所含有的藻酸类可以是聚合度优选为20以下、更优选为10以下、进一步优选为8以下、特别优选为5以下的低聚糖。
42.本发明的组合物所含有的藻酸类的、在以下的条件下利用hplc法测定时的分子量可以低于4万。另外，其上限优选为3.5万以下，更优选为3万以下，进一步优选为2.5万以下，特别优选为2.2万以下。另外，在以下的条件下利用hplc法测定时的分子量的下限没有特别限定，通常为194以上，更优选为0.5万以上，进一步优选为1万以上。此处，藻酸盐的分子量是换算为藻酸时的值。
43.此处的条件如下所述。
44.测定机器：ultimate3000(thermo公司制)
45.检测：corona带电粒子检测器(thermo公司制)、
46.柱：tskgel g6000pw(东曹公司制)
47.流动相：0.1％乙酸铵水溶液
48.流速：0.4ml/分钟
49.柱温：40℃
50.标准品：standard p-82(shodex公司制)
51.需要说明的是，在上述条件下利用hplc测得的分子量也是可能会偏离实际的由聚合度计算出的“真实的”分子量的“表观的”值。
52.藻酸是海带、裙带菜等海藻中包含的多糖类，包括作为增稠稳定剂应用于食品在内被广泛利用。藻酸具有由β-d-甘露糖醛酸和α-l-古洛糖醛酸以1-4键连接而成的直链结构。藻酸的聚合度因来源而不同。
53.作为藻酸的盐，可列举出钠盐、钾盐、钙盐、铵盐等，本发明中没有特别限定，从水溶性的观点出发，优选钠盐和钾盐。
54.通常藻酸类可以从海藻等中提取而获得，此外也可以获得市售品。它们的分子量通常高达约4万～数百万。根据本发明人等的实验，证实了普拉氏粪杆菌单独时无法同化这些重均分子量超过10000的“长链藻酸类”。
55.用作本发明的益生元组合物的有效成分的重均分子量10000以下的藻酸类可以通过将“长链藻酸类”水解而获得。即，作为本发明的另一方式，可提供制造用于普拉氏粪杆菌的益生元组合物的方法，所述方法包括将长链藻酸和/或其盐水解至重均分子量10000以下的工序。
56.作为水解的方法，可列举出酸水解法、基于水解酶的方法、基于具有水解酶的细菌的方法等。
57.具体而言，酸水解通过在长链藻酸类的水溶液中添加乙酸等弱酸，进行数小时加
热至高温例如100℃以上的操作来进行，但不限定于此。
58.作为水解酶，例如使市售的水解酶作用于长链藻酸类而进行水解。
59.作为具有水解酶的细菌，例如可列举出市售的黄杆菌(flavobacterium)属等，通过在适当的条件下在长链藻酸类的存在下对这些进行培养而进行水解。
60.本发明的组合物中的重均分子量10000以下的藻酸类的量可根据组合物的形态进行适宜设定，没有特别限定，例如，优选为组合物整体的0.1质量％以上、更优选为1质量％以上为宜。重均分子量10000以下的藻酸类的含量的上限没有特别限制，例如可以是组合物整体的5质量％以下，或者可以是100质量％以下。需要说明的是，藻酸盐的情况，这些数值是换算为藻酸的值。另外，这些含量包括本发明组合物的制造时的值、流通时的值、及摄取(给予)时的值。
61.本发明的组合物可用作用于产丁酸菌的益生元。即，可以被产丁酸菌同化并促进其增殖。
62.需要说明的是，产丁酸菌是产生丁酸的细菌的统称。本发明中的产丁酸菌没有特别限定，例如可列举出粪杆菌属，更具体而言，可列举出存在于人肠道内的普拉氏粪杆菌等。
63.本发明的组合物对于能够通过增加体内的丁酸而预防或改善的疾病、病情、或者对于由体内丁酸减少所引起的疾病、病情的对象者是有用的。例如，可以是肠道调节用途、免疫调节用途、氧化应激降低用途、或腹泻的预防/改善用途、炎症性肠疾病用途、大肠癌的预防用途等。
64.本发明的另一方式为重均分子量10000以下的藻酸和/或其盐在制造用于产丁酸菌的益生元组合物中的应用。
65.本发明的另一方式为重均分子量10000以下的藻酸和/或其盐在普拉氏粪杆菌的增殖中的应用。
66.本发明的另一方式为用于使普拉氏粪杆菌增殖的、重均分子量10000以下的藻酸和/或其盐。
67.一种使普拉氏粪杆菌增殖的方法，其包括向动物给予重均分子量10000以下的藻酸和/或其盐。此处，动物没有特别限定，通常为人。
68.本发明的组合物的摄取(给予)时期没有特别限定，可以根据给予对象的状态进行适宜选择。
69.本发明的组合物的摄取(给予)量可根据摄取(给予)对象的年龄、性别、状态、其它条件等进行适宜选择。作为重均分子量10000以下的藻酸类的量，优选以1～300mg/kg/天、更优选以20～50mg/kg/天的范围的量作为基准。
70.需要说明的是，无论摄取(给予)的量、期间如何，药剂可以1天给予1次或分成多次给予。
71.本发明的组合物的摄取(给予)途径可以是经口或非经口中的任意者，但通常为经口。另外，作为非经口摄取(给予)，可列举出直肠给予等。
72.本发明的组合物也可以是与重均分子量10000以下的藻酸类一起含有产丁酸菌的形态。另外，本发明的组合物也可以与产丁酸菌或含有产丁酸菌的制剂组合使用而进行摄取。通过上述方式，可以进一步期待肠道内的产丁酸菌增殖促进效果、和由该效果带来的丁
酸增加效果。
73.需要说明的是，在这些方式的情况下，产丁酸菌优选为活菌。
74.将本发明的组合物制成经口摄取的组合物时，优选制成饮食品的形态。
75.作为饮食品，只要在不损害本发明的效果的情况下能够经口摄取，形态、性状就没有特别限制，除了含有重均分子量10000以下的藻酸类以外，可以使用通常饮食品中使用的原料并利用通常的方法而制造。
76.如前所述，通常，一般可获得的藻酸类为长链，因此也可以通过作为本发明的另一方式的包括如下工序的方法来制造用于产丁酸菌的益生元饮食品，所述工序为：将长链藻酸和/或其盐水解至重均分子量10000以下的工序；及在饮食品原料中添加前述工序中得到的重均分子量10000以下的藻酸和/或其盐的工序。
77.作为饮食品，液体、膏状、凝胶状固体、粉末等形态没有限制，可列举例如压片糖；流食(经管摄取用营养食品)；面包、通心粉、意大利细面条、面类、蛋糕混合料、油炸粉、面包粉等小麦粉产品；方便面、杯面、蒸煮/烹调食品、烹调罐头、微波用食品、速溶汤/日式炖菜、速溶大酱汤/吸入物、罐装浓汤、冻干/干燥食品、其它速食品等速食品类；农作物罐头、水果罐头、果酱(jam)/橘子酱(marmalade)类、咸菜、煮豆类、农产品干物类、谷物(谷物加工品)等农产加工品；水产罐头、鱼肉火腿/香肠、水产糜类产品、水产鱼贝类、佃煮类等水产加工品；畜产罐头/糊剂类、畜肉火腿/香肠等畜产加工品；加工乳、乳饮料、酸奶类、乳酸菌饮料类、乳酪、冰激凌类、配方奶粉类、奶油、其它乳制品等乳/乳制品；黄油、人造奶油类、植物油等油脂类；酱油、大酱、沙司(sauce)类、西红柿加工调味剂、味醂类、食醋类等基础调味剂；烹调混合料、咖喱的原料类、鱼露类、调味汁(dressing)类、面汤类、香辛料类、其它复合调味剂等复合调味剂/食品类；冷冻食品材料、半烹调冷冻食品、经烹调的冷冻食品等冷冻食品；焦糖、糖果、口香糖、巧克力、曲奇(cookie)、饼干(biscuits)、蛋糕(cake)、馅饼(pie)、小吃(snack)、薄脆饼(cracker)、日本点心、米点心、豆点心、西式甜点、果子冻、其它点心等点心类；碳酸饮料、天然果汁、果汁饮料、带有果汁的清凉饮料、果肉饮料、带有果粒的果实饮料、蔬菜系饮料、豆奶、豆奶饮料、咖啡饮料、茶饮料、粉末饮料、浓缩饮料、运动饮料、营养饮料、酒精饮料、其它嗜好饮料等嗜好饮料类；婴儿食品、米饭伴侣、茶泡饭海带等其它市售食品等；育儿用配方奶粉；经肠营养食品；功能性食品(特定保健用食品、营养功能食品)等。
78.另外，作为饮食品的一形态，也可以是饲料。作为饲料，可列举出宠物食品、家畜饲料、鱼饲料等。
79.作为饲料的形态，没有特别限制，除了重均分子量10000以下的藻酸类之外，例如可以含有重均分子量大于194的藻酸类、玉米、小麦、大麦、黑麦、西非高粱等谷类；大豆油粕、菜籽油粕、椰子油粕、亚麻仁油粕等植物性油粕类；麸皮、麦糠、米糠、脱脂米糠等糠类；玉米蛋白粉、玉米酱等制造粕类；鱼粉、脱脂奶粉、乳清、饲用油脂、牛脂等动物性饲料类；圆酵母、啤酒酵母等酵母类；磷酸三钙、碳酸钙等矿物质饲料；油脂类；单体氨基酸；糖类等。
80.本发明的组合物为饮食品(包括饲料)的形态时，可以以标示为用于产丁酸菌的益生元、使肠道内的产丁酸菌增殖这样的用途的饮食品的形式提供/贩卖。
81.上述“标示”行为包括用于使需要者知悉上述用途的全部行为，只要是可想起或类推上述用途的标示则不论标示目的、标示内容、标示对象物/介质等如何，均相当于本发明的“标示”。
82.另外，“标示”优选通过需要者直接意识到上述用途的表现方式来标示。具体而言，可列举出对在饮食品的商品或商品的包装上记载了上述用途的物品进行转让、交货、为了转让或交货而进行展示、进口的行为；在与商品有关的广告、价格表或交易文件中记载上述用途并展示或发布、或在以这些为内容的信息中记载上述用途并通过电磁方法(互联网等)进行提供的行为等。
83.另一方面，作为标示内容，优选为得到行政等许可的标示(例如，基于行政规定的各种制度而得到许可、并以基于这样的许可的形态进行的标示)。另外，优选将这样的标示内容标示在包装、容器、商品目录、宣传手册、pop等销售现场的宣传材料、其他文件等中。
84.另外，“标示”也可以示例出作为健康食品、功能性食品、经肠营养食品、特殊用途食品、保健功能食品、特定保健用食品、营养功能食品、功能性标示食品、准药物等的标示。其中，特别是，经消费厅许可的标示、可列举例如特定保健用食品、营养功能食品、或功能性标示食品相关的制度、或与这些类似的制度许可的标示等。具体而言，可以列举出作为特定保健用食品的标示、作为附加条件的特定保健用食品的标示、主旨为对身体的结构、功能带来影响的标示、降低疾病风险的标示、基于科学根据的功能性的标示等，更具体而言，典型的例子是作为关于健康增进法中规定的特别用途标示的许可等的内阁府令(平成二十一年八月三十一日内阁府令第五十七号)所确定的特定保健用食品的标示(特别是保健用途的标示)及与其类似的标示等。
85.作为上述标示，例如可列举出标示为“希望增加腹中的产丁酸菌者”、“希望增加粪杆菌属细菌者”、“用丁酸调节肠道作用”等。
86.本发明的组合物中，可以制成药物的形态。
87.药物的给予途径优选经口或非经口中的任意者，但优选经口。另外，作为非经口摄取(给予)，可列举出直肠给予等。
88.作为药物的形态，可以根据给予方法制成适宜期望的剂型。例如，经口给予的情况，可以制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂等固体制剂；溶液制剂、糖浆剂、悬浮剂、乳剂等液体制剂等。另外，非经口给予的情况，可以制成栓剂、软膏剂、注射剂等。
89.进行制剂化时，除了重均分子量10000以下的藻酸类之外，可以使用通常用于制剂化的赋形剂、ph调节剂、着色剂、矫味剂等成分。另外，也可以组合使用其它药效成分、公知的或将来发现的益生元等。
90.此外，制剂化可以根据剂型利用适宜公知的方法来实施。在进行制剂化时，可以适宜配混制剂载体进行制剂化。
91.作为赋形剂，可列举例如：乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等糖衍生物；玉米淀粉、马铃薯淀粉、α-淀粉、糊精、羧甲基淀粉等淀粉衍生物；结晶纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙等纤维素衍生物；阿拉伯胶；葡聚糖；普鲁兰多糖；轻质无水硅酸、合成硅酸铝、偏硅酸铝酸镁等硅酸盐衍生物；磷酸钙等磷酸盐衍生物；碳酸钙等碳酸盐衍生物；硫酸钙等硫酸盐衍生物等。
92.作为结合剂，例如除了上述赋形剂以外还可列举：明胶；聚乙烯基吡咯烷酮；macrogol等。
93.作为崩解剂，例如除了上述赋形剂以外还可列举：交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯基吡咯烷酮等经化学修饰的淀粉或纤维素衍生物等。
94.作为润滑剂，可列举例如：滑石；硬脂酸；硬脂酸钙、硬脂酸镁等硬脂酸金属盐；硅胶；胶状硅酸镁铝(veegum)、鲸蜡等蜡类；硼酸；甘醇；富马酸、己二酸等羧酸类；苯甲酸钠等羧酸钠盐；硫酸钠等硫酸盐类；亮氨酸；月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁等月桂基硫酸盐；硅酸酐、硅酸水合物等硅酸类；淀粉衍生物等。
95.作为稳定剂，可列举例如：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸酯类；氯代丁醇、苯甲醇、苯乙醇等醇类；苯扎氯铵；乙酸酐；山梨酸等。
96.作为矫味矫臭剂，可列举例如甜味剂、酸味剂、香料等。
97.需要说明的是，作为经口给予用的液体制剂所使用的载体，可列举水等溶剂等。
98.摄取本发明的药物的时机例如在餐前、餐后、进餐过程中、睡前等没有特别限定。
99.实施例
100.以下使用实施例对本发明进行进一步具体地说明，但本发明不限定于这些实施例。
101.＜制造例＞
102.(1)长链藻酸钠的水解物的获得
103.用99.7ml的milliq水溶解市售的藻酸钠原料(“ulv-l3(分子量4万～6万)”(kimica corporation制))1g。然后添加0.3ml的乙酸(国产化学株式会社)，施加104℃、7.5小时的高压釜处理。接着以8000
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g进行5分钟离心分离，回收上清液。将上清液供于快速回流(speed back)，并去除全部乙酸和水分量的70％，得到了长链藻酸钠的水解物(试样1)的水溶液。
104.(2)藻酸钠的分子量的推测
105.通过hplc求出(1)中得到的藻酸钠(试样1)的分子量。使试样1通过0.22μm过滤器(merck millipore公司制)并供于hplc。
106.hplc使用ultimate3000(thermo公司制)、corona带电粒子检测器(thermo公司制)、和tskgel g6000pw(东曹公司制)。外部标准品使用p-82普鲁兰多糖标准品(shoudex公司制)。流动相使用溶解有0.1％乙酸铵的蒸馏水以等度测定110分钟。流速设定为0.4ml/分钟、柱温箱温度设定为40℃。
107.图1示出试样1和外部标准品的hplc谱图。p-5的mp(峰顶分子量)为6600、p-20的mp为23000、p-50的mp为48800。由此推测，基于前述测定条件的试样1的mp低于40000。
108.＜试验例1＞普拉氏粪杆菌单独培养1
109.(1)培养基的制备
110.在前述的制造例中得到的藻酸钠水溶液(试样1)中加入除糖以外的ycfa培养基组成粉末，得到了含有藻酸钠的ycfa培养基。
111.作为比较，制备了含有市售的藻酸钠原料或瓜尔胶水解物的培养基。需要说明的是，已知瓜尔胶水解物具有普拉氏粪杆菌增殖能力。首先，在99.7ml的milliq水中添加0.3ml的乙酸(国产化学株式会社)，施加104℃、7.5小时的高压釜处理。将得到的灭菌水供于快速回流，并去除全部乙酸和水分量的70％，得到了水溶液。在该水溶液中添加市售的藻酸钠原料(试样2：“ulv-l3(分子量4万～6万)”(kimica corporation制))、或市售的瓜尔胶水解物(试样3：“sunfiber”(太阳化学株式会社制))1g，进而加入除糖以外的ycfa培养基组成粉末，得到了ycfa培养基。另外，作为阴性对照，还准备了未添加被检试样的培养基。
112.(2)单独培养
113.在(1)中制备的各ycfa培养基中添加以无菌方式进行过滤器灭菌处理的维生素液和半胱氨酸液，制备了被检试样的终浓度为1％(w/v)的培养液。将培养液注入96孔板353072(falcon公司制)中各200μl。然后，在concept plus(central chemical company制)内将前述96孔板静置一夜将培养液置换为厌氧状态。向其中在供于培养实验的24小时前接种普拉氏粪杆菌(mcc2041、于2019年9月20日在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(邮政编号292-0818、千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)以保藏编号nite bp-03027进行了国际保藏)并在37℃进行厌氧培养，将由此得到的前培养液各6μl接种在培养液中，在37℃下进行48小时厌氧培养。
114.图2示出各培养基的浊度(od
600
)的经时变化。普拉氏粪杆菌无法同化分子量大的藻酸钠(试样2)而增殖缓慢，但分子量因水解而降低的藻酸钠(试样1)被同化，观察到显著的增殖。另外，与瓜尔胶水解物(试样3)相比，试样1显示出普拉氏粪杆菌较高的增殖能力。
115.＜试验例2＞普拉氏粪杆菌单独培养2
116.使用与试验例1同样制备的添加了试样1的ycfa培养基，对普拉氏粪杆菌(mcc2041、保藏编号：nite abp-03027)进行单独培养。分别采集了培养开始0小时后和48小时后的培养基，进行了hplc。
117.hplc使用ultimate3000(thermo公司制)、corona带电粒子检测器(thermo公司制)、和tskgel g3000pw(东曹公司制)。外部标准品使用p-82普鲁兰多糖标准品(shoudex公司制)。流动相使用溶解有0.1％乙酸铵的蒸馏水以等度测定110分钟。流速设定为0.3ml/分钟、柱温箱温度设定为40℃。
118.图3重叠示出培养开始0小时后和48小时后的各培养基以及标准品的谱图。在培养前后，分子量25000～10000左右的范围减少，特别是20000左右的峰降低，因此可知分子量在该范围的藻酸被普拉氏粪杆菌同化。需要说明的是，在27分钟附近的谱图的减少被认为相当于培养基来源成分的消耗。
119.＜试验例3＞普拉氏粪杆菌单独培养3
120.使用与试验例1同样制备的添加了试样1的ycfa培养基，对普拉氏粪杆菌(mcc2041、保藏编号：nite abp-03027)进行单独培养。分别采集了培养开始0小时后和48小时后的培养基，进行了hplc。
121.hplc使用ultimate3000(thermo公司制)、refracto max 521(thermo公司制)、和tskgel g3000pw(东曹公司制)。外部标准品使用p-82普鲁兰多糖标准品(shoudex公司制)。流动相使用溶解有0.1％硝酸钠的蒸馏水以等度测定80分钟。流速设定为0.3ml/分钟、柱温箱温度为40℃。
122.图4重叠示出培养开始0小时后和48小时后的各培养基以及试样1的谱图。在培养前后，测定开始起31～32.5分钟附近的峰减少、以及峰大体上与试样1中出现的峰一致，因此可知该范围的分子量的藻酸被普拉氏粪杆菌同化。
123.图4中，基于由外部标准品的洗脱时间制作的标准曲线计算出相当于在培养前后降低的峰的级分、即被普拉氏粪杆菌同化的藻酸的重均分子量，结果推测约为3500。另外，计算出试样1的重均分子量，结果推测约为6000。
124.＜试验例4＞普拉氏粪杆菌同化级分的分析
125.通过薄层色谱(tlc)对普拉氏粪杆菌所同化的藻酸的大小进行了更详细地分析。
126.分别将试验例3的培养48小时后的培养液、及与试验例1同样地制备的添加了试样1的ycfa培养基以13000
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g、4℃进行3分钟离心分离，回收各上清液作为样品。作为标准产品，准备了试样1、市售的长链藻酸钠(“ulv-l3(分子量4万～6万)”(kimica corporation制))、市售的藻酸低聚糖(主要包含2～6糖。“藻酸低聚糖(aos)”(北海道三井化学公司制))、葡萄糖、麦芽糖、和棉子糖。
127.将各样品各1μl点样在薄层色谱用铝板silica gel 60(merck公司制)中，用展开剂(甲酸：1-丁醇：蒸馏水＝6：4：1)展开。喷雾二苯胺
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苯胺
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磷酸试剂(100ml丙酮、1g二苯胺、1ml苯胺、10ml磷酸)后，进行加热使糖显色。
128.作为长链藻酸钠的水解物的试样1中，观察到多个斑点。大体上斑点与在藻酸低聚糖中出现的多个斑点几乎一致，因此可推测出试样1是将长链藻酸钠分解为2～6糖的低聚糖。需要说明的是，长链藻酸钠中未出现上述斑点。
129.另外，培养液中，观察到分别相当于试样1中的低聚糖、特别是4糖和5糖的斑点与培养前相比更浅。由此可知，普拉氏粪杆菌同化了长链藻酸的水解物中的聚合度为数个的糖、特别是4糖和5糖。