与白介素蛋白的类似物组合治疗癌症的治疗性组合物和方法与流程

与白介素蛋白的类似物组合治疗癌症的治疗性组合物和方法1.本技术要求2019年5月16日提交的美国临时申请号62/848,962和2019年5月16日提交的美国临时申请号62/848,975的优先权，将这些申请的公开内容通过引用如同在本文中所写以其整体特此并入。2.本公开文本总体上涉及使用具有不同功能特征的抗cd47单克隆抗体(mab)和抗cd47融合mab或携带嵌合抗原受体(car)的免疫效应细胞与白介素蛋白的类似物的组合治疗癌症的方法。3.cd47表达和/或活性与许多疾病和障碍有关。许多人类癌症上调cd47的细胞表面表达，并且表达最高水平的cd47的癌症显现出对患者最具侵袭性且最为致命。增加的cd47表达被认为通过经由sirpα(一种阻止携带cd47的细胞的吞噬作用的抑制性受体)向巨噬细胞发送“不要吃我”信号来保护癌细胞免于吞噬清除。4.可以对t细胞进行基因修饰以表达嵌合抗原受体(car)，其是由抗原识别部分和t细胞激活结构域构成的融合蛋白。car旨在识别在癌细胞上过表达的抗原。car-t显示出针对b细胞恶性肿瘤的卓越临床功效，并且最近有两种疗法即kymriahtm(tisagenlecleucel，novartis)和yescartatm(axicabtageneciloleucel，kite/gilead)获得fda批准。最近的公开内容也显示了在以下方面的前景：将car-t疗法的用途扩展到t细胞恶性肿瘤，以及使来自供体的预工程化细胞能够“现成地”用于治疗恶性肿瘤而没有同种异体反应性。5.il-7是对b细胞和t细胞发育而言重要的细胞因子。il-7是由许多细胞类型产生的造血生长因子，包括但不限于由骨髓和胸腺中的基质细胞分泌。il-7刺激多能造血干细胞分化为淋巴祖细胞。il-7与il-7受体的结合产生对胸腺内t细胞发育和外周中的存活而言重要的信号级联。6.il-15诱导t和nk细胞的增殖和细胞因子产生，以及效应记忆t细胞分化和对细胞凋亡的敏感性。il-15rα广泛表达，例如由淋巴样细胞、树突状细胞(dc)、成纤维细胞以及上皮细胞、肝细胞、肠细胞和其他细胞表达，并且被认为将il-15反式呈递给表达il-15β和γ链的细胞。7.il-7、il-15和cd47的表达和/或活性与许多疾病和障碍有关。因此，存在对于用于治疗人的与il-7、il-15和cd47相关的疾病和病症(包括预防和治疗各种癌症)的治疗性组合物和方法的需要。本文公开了用于治疗有需要的受试者的癌症的治疗性用途，包括向所述受试者施用抗cd47mab和白介素蛋白即il-7和il-15的类似物。本文还公开了用于改善免疫效应细胞(包括携带嵌合抗原受体(car)的免疫效应细胞)的扩增和持久性的治疗性用途以及用于治疗有需要的受试者的癌症的治疗性用途，包括向所述受试者施用免疫效应细胞(例如携带car的免疫效应细胞)群和白介素蛋白即il-7和il-15的类似物。技术实现要素：8.实施方案1.一种多肽，所述多肽包含：第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含(i)第一结构域，其含有对人cd47具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变结构域(vl)的结合区；以及(ii)第二轻链恒定结构域(cl)；并且第二多肽链包含(i)第一结构域，其含有对人cd47具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区结构域(vh)的结合区；(ii)第二结构域重链恒定结构域(ch)；以及(iii)含有il-7蛋白或其变体的第三结构域。9.实施方案2.一种多肽，所述多肽包含：第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含(i)第一结构域，其含有对人cd47具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变结构域(vl)的结合区；(ii)第二轻链恒定结构域(cl)；以及(iii)含有il-7蛋白或其变体的第三结构域；并且第二多肽链包含(i)第一结构域，其含有对人cd47具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区结构域(vh)的结合区；以及(ii)第二结构域重链恒定结构域(ch)。10.实施方案3.一种多肽，所述多肽包含：第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含(i)含有il-7蛋白或其变体的第一结构域；(ii)第二结构域，其含有对人cd47具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变结构域(vl)的结合区；以及(iii)第三结构域轻链恒定结构域(cl)；并且第二多肽链包含(i)第一结构域，其含有对人cd47具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区结构域(vh)的结合区；以及(ii)第二结构域重链恒定结构域(ch)。11.实施方案4.一种多肽，所述多肽包含：第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含(i)第一结构域，其含有对人cd47具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变结构域(vl)的结合区；以及(ii)第二轻链恒定结构域(cl)；并且第二多肽链包含(i)含有il-7蛋白或其变体的第一结构域；(ii)第二结构域，其含有对人cd47具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区结构域(vh)的结合区；以及(iii)第三结构域重链恒定结构域(ch)。12.实施方案5.根据实施方案1-4中任一项所述的肽，其中所述il-7蛋白或其变体是经修饰的。13.实施方案6.根据实施方案1至4中任一项所述的il-7蛋白或其变体，其中对于所述il-7受体的经修饰的结合区能够与il-7受体结合以激活细胞中的il-7信号传导。14.实施方案7.根据实施方案1至4中任一项所述的il-7蛋白或其变体，其中对于所述il-7受体的经修饰的结合区包含氨基酸的取代。15.实施方案8.根据实施方案1至4中任一项所述的il-7蛋白或其变体，其中对于所述il-7受体的经修饰的结合区中的氨基酸取代包括在选自氨基酸位置10、11、14、19、81和85的氨基酸位置中的取代，其中所述氨基酸位置是相对于seqidno:2。16.实施方案9.根据实施方案1至4中任一项所述的il-7蛋白或其变体，其中氨基酸位置10处的氨基酸取代是k10i、k10m或k10v。17.实施方案10.根据实施方案1至4中任一项所述的il-7蛋白或其变体，其中氨基酸位置10处的氨基酸取代是k10i。18.实施方案11.根据实施方案1至4中任一项所述的il-7蛋白或其变体，其中氨基酸位置11处的氨基酸取代是q11r。19.实施方案12.根据实施方案1至4中任一项所述的il-7蛋白或其变体，其中氨基酸位置14处的氨基酸取代是s14t。20.实施方案13.根据实施方案1至4中任一项所述的il-7蛋白或其变体，其中氨基酸位置19处的氨基酸取代是s19q。21.实施方案14.根据实施方案1至4中任一项所述的il-7蛋白或其变体，其中氨基酸位置81处的氨基酸取代是k81m或k81r。22.实施方案15.根据实施方案1至4中任一项所述的il-7蛋白或其变体，其中氨基酸位置85处的氨基酸取代是g85m。23.实施方案16.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案1至15中任一项所述的多肽。24.实施方案17.根据实施方案16所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤。25.实施方案18.根据实施方案17所述的方法，其中所述实体瘤选自宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌在内的肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌在内的胃部癌症或胃癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾脏癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝脏癌、肛门癌、阴茎癌、头颈癌及其何组合。26.实施方案19.根据实施方案18所述的方法，其中所述癌症是血液恶性肿瘤。27.实施方案20.根据实施方案19所述的方法，其中所述血液恶性肿瘤是急性儿童淋巴母细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、艾滋病相关淋巴瘤或其任何组合。28.实施方案21.根据实施方案19所述的方法，其中所述血液恶性肿瘤是t细胞恶性肿瘤。29.实施方案22.根据实施方案21所述的方法，其中所述t细胞恶性肿瘤是t细胞急性淋巴母细胞性白血病(t-all)。30.实施方案23.根据实施方案21所述的方法，其中所述t细胞恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤。31.实施方案24.根据实施方案16所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。32.实施方案25.根据实施方案16所述的方法，其中所述癌症是b细胞恶性肿瘤。33.实施方案26.根据实施方案1至25所述的方法，其中进一步向所述受试者施用抗癌剂。34.实施方案27.根据实施方案26所述的方法，其中所述抗癌剂是蛋白酶体抑制剂。35.实施方案28.根据实施方案27所述的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米、伊沙佐米和卡非佐米。36.实施方案29.根据实施方案26所述的方法，其中所述抗癌剂是免疫检查点抑制剂。37.实施方案30.根据实施方案29所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是pd-1、pd-l1、lag-3、tim-3、ctla-4或其任何组合的抑制剂。38.实施方案31.根据实施方案29所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是纳武单抗、派姆单抗、伊匹单抗、阿特珠单抗、度伐鲁单抗、阿维鲁单抗、曲美木单抗或其任何组合。39.实施方案32.根据实施方案16所述的方法，其中所述多肽通过静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外或胸骨内施用。40.实施方案33.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1至4中任一项所述的多肽。41.实施方案34.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的，包括向所述受试者施用治疗有效量的：a)抗cd47抗体或其抗原结合片段；以及b)il-7蛋白。42.实施方案35.根据实施方案34所述的方法，其中所述抗cd47抗体或其抗原结合片段包含重链(hc)和轻链(lc)的组合，其中所述组合选自：(i)包含seqidno:64的氨基酸序列的重链和包含seqidno:68的氨基酸序列的轻链；(ii)包含seqidno:65的氨基酸序列的重链和包含seqidno:68的氨基酸序列的轻链；(iii)包含seqidno:63的氨基酸序列的重链和包含seqidno:67的氨基酸序列的轻链；(iv)包含seqidno:64的氨基酸序列的重链和包含seqidno:67的氨基酸序列的轻链；(v)包含seqidno:65的氨基酸序列的重链和包含seqidno:67的氨基酸序列的轻链；以及(vi)包含seqidno:66的氨基酸序列的重链和包含seqidno:67的氨基酸序列的轻链。43.实施方案36.根据实施方案34所述的方法，其中所述il-7蛋白具有与选自seqidno.1(genbank登录号p13232)的氨基酸序列至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。44.实施方案37.根据实施方案34或35所述的方法，其中所述il-7蛋白是经修饰的。45.实施方案38.根据实施方案34至36中任一项所述的方法，其中所述il-7蛋白是融合蛋白。46.实施方案39.根据实施方案37所述的经修饰的il-7蛋白，其中所述经修饰的il-7蛋白能够与il-7受体结合以激活细胞中的il-7信号传导。47.实施方案40.根据实施方案37所述的经修饰的白介素蛋白，其中所述经修饰的il-7蛋白包含氨基酸的取代。48.实施方案41.根据实施方案40所述的经修饰的白介素蛋白，其中所述经修饰的il-7蛋白中的氨基酸取代包括在选自氨基酸位置10、11、14、19、81和85的氨基酸位置中的取代，其中所述氨基酸位置是相对于seqidno:2。49.实施方案42.根据实施方案41所述的经修饰的白介素蛋白，其中氨基酸位置10处的氨基酸取代是k10i、k10m或k10v。50.实施方案43.根据实施方案42所述的经修饰的白介素蛋白，其中氨基酸位置10处的氨基酸取代是k10i。51.实施方案44.根据实施方案41所述的经修饰的白介素蛋白，其中氨基酸位置11处的氨基酸取代是q11r。52.实施方案45.根据实施方案41所述的经修饰的白介素蛋白，其中氨基酸位置14处的氨基酸取代是s14t。53.实施方案46.根据实施方案41所述的经修饰的白介素蛋白，其中氨基酸位置19处的氨基酸取代是s19q。54.实施方案47.根据实施方案41所述的经修饰的白介素蛋白，其中氨基酸位置81处的氨基酸取代是k81m或k81r。55.实施方案48.根据实施方案41所述的经修饰的白介素蛋白，其中氨基酸位置85处的氨基酸取代是g85m。56.实施方案49.根据实施方案38所述的方法，其中所述融合蛋白包含异源部分。57.实施方案50.根据实施方案49所述的方法，其中所述异源部分是延长所述il-7蛋白的半衰期的部分(“半衰期延长部分”)。58.实施方案51.根据实施方案50所述的方法，其中所述半衰期延长部分选自免疫球蛋白的fc区或其部分、白蛋白、白蛋白结合多肽、pro/ala/ser(pas)、人绒毛膜促性腺激素亚基的c末端肽(ctp)、聚乙二醇(peg)、长非结构化亲水氨基酸序列(xten)、羟乙基淀粉(hes)、白蛋白结合小分子及其组合。59.实施方案52.根据实施方案51所述的方法，其中所述半衰期延长部分是fc结构域。60.实施方案53.根据实施方案36至52中任一项所述的方法，其中所述il-7蛋白将以在约20μg/kg与约600μg/kg之间的基于体重的剂量或约0.25mg至约9mg的平剂量施用。61.实施方案54.根据实施方案36至53中任一项所述的方法，其中所述il-7蛋白将以约20μg/kg、约60μg/kg、约120μg/kg、约240μg/kg、约480μg/kg、约600μg/kg或约10mg/kg的基于体重的剂量或者约0.25mg、约1mg、约3mg、约6mg或约9mg的平剂量施用。62.实施方案55.根据实施方案36至54中任一项所述的方法，其中所述il-7蛋白是以每周至少一次、每周至少两次、每周至少三次、每周至少四次、每月至少一次或每月至少两次的给药间隔施用。63.实施方案56.根据实施方案36至55中任一项所述的方法，其中所述il-7蛋白是在抗cd47抗体或其抗原结合片段之后施用。64.实施方案57.根据实施方案36至56中任一项所述的方法，其中所述il-7蛋白是在抗cd47抗体及其抗原结合片段之前施用。65.实施方案58.根据实施方案36至57中任一项所述的方法，其中所述il-7蛋白是与抗cd47抗体或其抗原结合片段并行施用。66.实施方案59.根据实施方案34所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤。67.实施方案60.根据实施方案59所述的方法，其中所述实体瘤选自宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌在内的肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌在内的胃部癌症或胃癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾脏癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝脏癌、肛门癌、阴茎癌、头颈癌及其何组合。68.实施方案61.根据实施方案34所述的方法，其中所述癌症是血液恶性肿瘤。69.实施方案62.根据实施方案61所述的方法，其中所述血液恶性肿瘤是急性儿童淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、艾滋病相关淋巴瘤或其任何组合。70.实施方案63.根据实施方案61所述的方法，其中所述血液恶性肿瘤是t细胞恶性肿瘤。71.实施方案64.根据实施方案63所述的方法，其中所述t细胞恶性肿瘤是t细胞急性淋巴细胞性白血病(t-all)。72.实施方案65.根据实施方案63所述的方法，其中所述t细胞恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤。73.实施方案66.根据实施方案34所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。74.实施方案67.根据实施方案34所述的方法，其中所述癌症是b细胞恶性肿瘤。75.实施方案68.根据实施方案34至67中任一项所述的方法，其中进一步向所述受试者施用抗癌剂。76.实施方案69.根据实施方案68所述的方法，其中所述抗癌剂是蛋白酶体抑制剂。77.实施方案70.根据实施方案69所述的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米、伊沙佐米和卡非佐米。78.实施方案71.根据实施方案68所述的方法，其中所述抗癌剂是免疫检查点抑制剂。79.实施方案72.根据实施方案71所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是pd-1、pd-l1、lag-3、tim-3、ctla-4或其任何组合的抑制剂。80.实施方案73.根据实施方案71所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是纳武单抗、派姆单抗、伊匹单抗、阿特珠单抗、度伐鲁单抗、阿维鲁单抗、曲美木单抗或其任何组合。81.实施方案74.一种经修饰的il-7蛋白，所述il-7蛋白包含构成seqidno:8-16的至少一个氨基酸取代。82.实施方案75.根据实施方案74所述的经修饰的il-7蛋白，其中所述经修饰的il-7蛋白能够与il-7受体结合以激活细胞中的il-7信号传导。83.实施方案76.根据实施方案74或75中任一项所述的经修饰的il-7蛋白，其中所述经修饰的il-7蛋白中的氨基酸取代包括在选自氨基酸位置10、11、14、19、81和85的氨基酸位置中的取代，其中所述氨基酸位置是相对于seqidno:2。84.实施方案77.根据实施方案76所述的经修饰的il-7蛋白，其中氨基酸位置10处的氨基酸取代是k10i、k10m或k10v。85.实施方案78.根据实施方案77所述的经修饰的il-7蛋白，其中氨基酸位置10处的氨基酸取代是k10i。86.实施方案79.根据实施方案76所述的经修饰的il-7蛋白，其中氨基酸位置11处的氨基酸取代是q11r。87.实施方案80.根据实施方案76所述的经修饰的il-7蛋白，其中氨基酸位置14处的氨基酸取代是s14t。88.实施方案81.根据实施方案76所述的经修饰的il-7蛋白，其中氨基酸位置19处的氨基酸取代是s19q。89.实施方案82.根据实施方案76所述的经修饰的il-7蛋白，其中氨基酸位置81处的氨基酸取代是k81m或k81r。90.实施方案83.根据实施方案76所述的经修饰的il-7蛋白，其中氨基酸位置85处的氨基酸取代是g85m。91.实施方案84.一种编码根据实施方案77至83中任一项所述的蛋白质的核酸构建体。92.实施方案85.根据实施方案84所述的核酸构建体，其中所述经修饰的il-7蛋白还包含c末端组氨酸标签。93.实施方案86.一种改善携带嵌合抗原受体(car)的免疫效应细胞的扩增和持久性的方法，所述方法包括向患者施用携带car的免疫效应细胞以及根据实施方案77至83中任一项所述的蛋白质。实施方案87.一种在携带car的免疫效应细胞中启动内部信号传导的方法，所述方法包括：将根据实施方案77至83中任一项所述的蛋白质施用至有需要的患者，其中所述经修饰的白介素蛋白结合il-7受体；并且其中所述经修饰的白介素蛋白的结合启动所述细胞中的内部信号传导。94.实施方案88.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案77至83中任一项所述的蛋白质以及携带car的免疫效应细胞。95.实施方案89.根据实施方案86至88中任一项所述的方法，其中所述经修饰的il-7蛋白能够与il-7受体结合以激活细胞中的il-7信号传导。96.实施方案90.根据实施方案86至89中任一项所述的方法，其中所述携带car的免疫效应细胞选自car-t细胞、car-inkt细胞或car-nk细胞。97.实施方案91.根据权利要求86至90中任一项所述的方法，其中所述经修饰的白介素蛋白和所述携带car的免疫效应细胞是与药物并行施用。98.实施方案92.一种经修饰的il-15蛋白，所述il-15蛋白包含构成seqidno:31-45的至少一个氨基酸取代。99.实施方案93.根据实施方案92所述的经修饰的白介素蛋白，其中所述经修饰的il-15蛋白能够与il-15受体结合以激活细胞中的il-15信号传导。100.实施方案94.根据实施方案92或93中任一项所述的经修饰的il-15蛋白，其中所述经修饰的il-15蛋白中的氨基酸取代包括在选自氨基酸位置3、4、11、72、79和112的氨基酸位置中的取代，其中所述氨基酸位置是相对于seqidno:30。101.实施方案95.根据实施方案94所述的经修饰的白介素蛋白，其中氨基酸位置3处的氨基酸取代是v3i、v3m或v3r。102.实施方案96.根据实施方案94所述的经修饰的白介素蛋白，其中氨基酸位置4处的氨基酸取代是n4h。103.实施方案97.根据实施方案94所述的经修饰的白介素蛋白，其中氨基酸位置11处的氨基酸取代是k11l、k11m或k11r。104.实施方案98.根据实施方案94所述的经修饰的白介素蛋白，其中氨基酸位置72处的氨基酸取代是n72d、n72r或n72y。105.实施方案99.根据实施方案94所述的经修饰的白介素蛋白，其中氨基酸位置79处的氨基酸取代是n79e或n79s。106.实施方案100.根据实施方案94所述的经修饰的白介素蛋白，其中氨基酸位置79处的氨基酸取代是n79s。107.实施方案101.根据实施方案94所述的经修饰的白介素蛋白，其中氨基酸位置112处的氨基酸取代是n112h、n112m或n112y。108.实施方案102.一种编码根据实施方案95至101中任一项所述的经修饰的白介素蛋白的核酸构建体。109.实施方案103.根据实施方案102所述的核酸构建体，其中所述经修饰的il-15蛋白还包含n末端组氨酸标签。110.实施方案104.一种改善免疫效应细胞例如携带嵌合抗原受体(car)的免疫效应细胞的扩增和持久性的方法，所述方法包括向患者施用携带car的免疫效应细胞以及根据实施方案95至101中任一项所述的经修饰的白介素蛋白。111.实施方案105.一种在免疫效应细胞例如携带car的免疫效应细胞中启动内部信号传导的方法，所述方法包括：将根据实施方案95至101中任一项所述的经修饰的白介素蛋白施用至有需要的患者，其中所述经修饰的白介素蛋白结合il-15受体；并且其中所述经修饰的白介素蛋白的结合启动所述细胞中的内部信号传导。112.实施方案106.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案95至101中任一项所述的经修饰的白介素蛋白以及携带car的免疫效应细胞。113.实施方案107.根据实施方案104至106中任一项所述的方法，其中所述经修饰的il-15蛋白能够与il-15受体结合以激活细胞中的il-15信号传导。114.实施方案108.根据实施方案104至107中任一项所述的方法，其中所述携带car的免疫效应细胞选自car-t细胞、car-inkt细胞或car-nk细胞。115.实施方案109.根据实施方案104至108中任一项所述的方法，其中所述经修饰的白介素蛋白和所述携带car的免疫效应细胞是与药物并行施用。116.实施方案110.一种多肽，所述多肽包含：与il-7蛋白、il-7变体、il-15蛋白或il-15变体中的至少一种连接的对人cd47具有特异性的免疫球蛋白可变区。117.实施方案111.根据实施方案110所述的多肽，其中所述对人cd47具有特异性的免疫球蛋白可变区与il-7蛋白、il-7变体、il-15蛋白或il-15变体通过接头连接。118.实施方案112.根据实施方案123所述的多肽，其中所述接头是(ggggs)n，其中n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18。119.实施方案113.根据实施方案110至实施方案113中任一项所述的多肽，其中所述免疫球蛋白可变区是特异性的，是抗cd47单克隆抗体或其片段。120.附图说明121.本公开文本的上述和其他方面、特征和优点将从以下结合附图进行的详细描述中得到更好的理解，所有这些都仅通过示例的方式给出，而不是对本公开文本的限制。122.图1.显示了il-7rα和il-2rγ在cos-7细胞中的共表达。顶行：第1天的il-7rα阳性细胞(左)、il-2rγ阳性细胞(中)和il-7rα/il2rγ双阳性细胞(右)；中行：第2天的il-7rα阳性细胞(左)、il-2rγ阳性细胞(中)和il-7rα/il2rγ双阳性细胞(右)；底行：第3天的il-7rα阳性细胞(左)、il-2rγ阳性细胞(中)和il-7rα/il-2rγ双阳性细胞(右)。123.图2.显示了il-7诱导的pstat5外周血单个核细胞(pbmc)信号传导。124.图3.显示了内部制备的和商业的与il-7rα结合的il-7的tr-fret结果。左上图：内部制备的il-7；左下图：商业获得的il-7；右图：商业与内部制备的il-7的比较。125.图4.显示了与wt相比，il-7突变体s1与il-7rα的结合。126.图5.显示了与il-7rα结合的具有和不具有γ亚基的il-7的tr-fret结果。左上图：不具有γ的il-7；左下图：具有γ的il-7；右图：具有和不具有γ亚基的il-7的比较。127.图6.显示了il-7rα和il-2rγ在cos-7细胞中的共表达。顶行：第1天的il-7rα阳性细胞(左)、il-2rγ阳性细胞(中)和il-7rα/il2rγ双阳性细胞(右)；中行：第2天的il-7rα阳性细胞(左)、il-2rγ阳性细胞(中)和il-7rα/il2rγ双阳性细胞(右)；底行：第3天的il-7rα阳性细胞(左)、il-2rγ阳性细胞(中)和il-7rα/il2rγ双阳性细胞(右)。128.图7.显示了il-15pstat5外周血单个核细胞(pbmc)信号传导。129.图8.显示了wtil-15sec纯化级分6在使用人pbmc的pstat5测定中的活性。130.图9.显示了il-15突变体m2(n72r)的汇合细胞因子活性的示例曲线。左侧显示了以pg/ml为单位的il-15m2批次11-20-18，n＝1；右侧显示了以pg/ml为单位的il-15m2批次11-20-18，n＝2。131.图10.显示了il-15突变体m5(n79s)的汇合细胞因子活性的示例曲线。左侧显示了以pg/ml为单位的il-15m5批次11-20-18，n＝1；右侧显示了以pg/ml为单位的il-15m5批次11-20-18，n＝2。132.图11.显示了内部制备的和商业的与il-15rβ结合的il-15的tr-fret结果。左上图：内部制备的il-15；左下图：商业获得的il-15；右图：商业与内部制备的il-15的比较。133.图12.显示了野生型il-15以及il-15突变体m2和m5与il-15rβ的结合。左上图：il-15突变体m2；左下图：wtil-15；右图：il-15突变体m5。134.图13.显示了内部制备的与il-15rβ结合的具有和不具有γ亚基的il-15的tr-fret结果。左上图：不具有γ的il-15；左下图：具有γ的il-15；右图：具有和不具有γ亚基的il-15的比较。135.图14.显示了il-15rβ和γ受体的m-07e膜提取物的蛋白质印迹。136.图15a.显示了抗cd47-il-7融合蛋白的示意图。137.图15b.显示了抗cd47-il-7融合蛋白的示意图。138.图15c.显示了抗cd47-il-7融合蛋白的示意图。139.图15d.显示了抗cd47-il-7融合蛋白的示意图。具体实施方式140.除非另外定义，否则结合本公开文本使用的科学和技术术语应具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交结合使用的命名法及其技术是本领域熟知且常用的那些。141.本文公开了经修饰的白介素-7(il-7)蛋白。142.在一些实施方案中，所述经修饰的il-7蛋白包含下表7中列出的氨基酸取代。143.在一些实施方案中，所述经修饰的il-7蛋白中的氨基酸取代包括在选自氨基酸位置10、11、14、19、81和85的氨基酸位置中的取代，其中所述氨基酸位置是相对于seqidno:2。144.在一些实施方案中，氨基酸位置10处的氨基酸取代是k10i、k10m或k10v。145.在一些实施方案中，氨基酸位置11处的氨基酸取代是q11r。146.在一些实施方案中，氨基酸位置14处的氨基酸取代是s14t。147.在一些实施方案中，氨基酸位置19处的氨基酸取代是s19q。148.在一些实施方案中，氨基酸位置81处的氨基酸取代是k81m或k81r。149.在一些实施方案中，氨基酸位置85处的氨基酸取代是g85m。150.在一些实施方案中，本公开文本提供了编码如本文所述的经修饰的il-7蛋白的核酸构建体。151.在一些实施方案中，所述经修饰的il-7蛋白还包含c末端组氨酸标签。152.在一些实施方案中，所述经修饰的il-7蛋白能够与il-7受体结合以激活细胞中的il-7信号传导，其中所述il-7受体在多种细胞类型上表达，所述细胞类型包括但不限于初始和记忆t细胞。153.在一些实施方案中，经修饰的il-7蛋白与il-7受体的结合导致所述细胞的扩增或激活。154.本文公开了经修饰的白介素-15(il-15)蛋白。155.在一些实施方案中，所述经修饰的白介素(il)蛋白包含下表7中列出的氨基酸取代。156.在一些实施方案中，所述经修饰的il-15亚基中的氨基酸取代包括在选自氨基酸位置3、4、11、72、79和112的氨基酸位置中的取代，其中所述氨基酸位置是相对于seqidno:30。157.在一些实施方案中，氨基酸位置3处的氨基酸取代是v3i、v3m或v3r。158.在一些实施方案中，氨基酸位置4处的氨基酸取代是n4h。159.在一些实施方案中，氨基酸位置11处的氨基酸取代是k11l、k11m或k11r。160.在一些实施方案中，氨基酸位置72处的氨基酸取代是n72d、n72r或n72y。161.在一些实施方案中，氨基酸位置79处的氨基酸取代是n79e或n79s。162.在一些实施方案中，氨基酸位置112处的氨基酸取代是n112h、n112m或n112y。163.在一些实施方案中，本公开文本提供了编码如本文所述的经修饰的白介素蛋白的核酸构建体。164.在一些实施方案中，所述经修饰的il-15蛋白还包含n末端组氨酸标签。165.在一些实施方案中，所述经修饰的il-15蛋白能够与il-15受体结合以激活细胞中的il-15信号传导。166.在一些实施方案中，经修饰的il-15蛋白与il-15受体的结合导致所述细胞的扩增或激活，其中所述il-7受体在树突状细胞、单核细胞和上皮细胞上表达。167.在一些实施方案中，本公开文本提供了一种改善携带嵌合抗原受体(car)的免疫效应细胞的扩增和持久性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用携带car的免疫效应细胞与如本文所述的经修饰的il-7蛋白或经修饰的il-15。168.在一些实施方案中，本公开文本提供了一种在携带car的免疫效应细胞中启动内部信号传导的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如本文所述的经修饰的il-7蛋白，其中所述经修饰的il-7蛋白结合il-7受体；并且其中经修饰的il-7蛋白的结合启动所述细胞中的内部信号传导。169.在一些实施方案中，本公开文本提供了一种在携带car的免疫效应细胞中启动内部信号传导的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如本文所述的经修饰的il-15蛋白，其中所述经修饰的il-15蛋白结合il-15受体；并且其中所述经修饰的il-15蛋白的结合启动所述细胞中的内部信号传导。170.在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用携带car的免疫效应细胞与如本文所述的经修饰的il-7蛋白或经修饰的il-15蛋白。171.在一些实施方案中，所述携带car的免疫效应细胞选自car-t细胞、car-inkt细胞或car-nk细胞。172.在一些实施方案中，所述经修饰的il-7蛋白和所述携带car的免疫效应细胞是与药物并行施用。173.在一些实施方案中，所述经修饰的il-7蛋白和所述携带car的免疫效应细胞是与抗体即抗cd47抗体一起施用。174.在一些实施方案中，所述经修饰的il-15蛋白和所述携带car的免疫效应细胞是与药物并行施用。175.在一些实施方案中，所述经修饰的il-7蛋白和所述携带car的免疫效应细胞是与抗体即抗cd47抗体一起施用。176.本文还公开了组合疗法、针对组合疗法的试剂盒和方法，所述组合疗法包含用于治疗疾病的免疫效应细胞(例如携带car的免疫效应细胞)群、白介素蛋白(如il-7蛋白或il-15蛋白)。177.在一些实施方案中，可以在体内施用il-7蛋白、il-7变体或其类似物以刺激此类免疫效应细胞(例如，car-t细胞或其他携带car的免疫效应细胞)在接受过继细胞转移疗法的患者中的扩增。178.在一些实施方案中，可以在体内施用il-15蛋白、il-15变体或其类似物以刺激此类免疫效应细胞(例如，car-t细胞或其他携带car的免疫效应细胞)在接受过继细胞转移疗法的患者中的扩增。179.在一些实施方案中，所述疾病可以是过度增殖疾病或障碍，例如癌症。所述癌症可以是血液恶性肿瘤或实体瘤。所述血液恶性肿瘤可以是多发性骨髓瘤和/或t细胞恶性肿瘤。所述t细胞恶性肿瘤可以是t细胞急性淋巴母细胞性白血病(t-all)和/或非霍奇金淋巴瘤。所述实体瘤或血液恶性肿瘤。所述实体瘤可以是宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤或肺7，并且所述经修饰的或突变体白介素蛋白可以具有至少一个氨基酸取代。所述经修饰的或突变体白介素蛋白保留了天然、未修饰的白介素蛋白的活性，使得所述经修饰的白介素激活细胞中的信号传导途径。189.如本文所述，根据本公开文本可用的氨基酸取代可以是任何氨基酸取代。在一些实施方案中，经修饰的il-7可以具有单个氨基酸取代，或可以具有2、3、4或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，特定氨基酸可以被取代为具有相似特性的另一氨基酸，即极性氨基酸被取代为另一极性氨基酸，或非极性氨基酸被取代为另一非极性氨基酸。在一些实施方案中，可用于本公开文本的氨基酸取代可以如表7中列出的取代。190.在一些实施方案中，可以被修饰或可以向其中引入突变的白介素蛋白可以是例如il-7。在一些实施方案中，所述经修饰的il-7蛋白可能能够与所述il蛋白的天然受体结合。例如，如本文所述的经修饰的il-7蛋白将与天然il-7受体结合以激活细胞中的il-7信号传导。191.在一些实施方案中，如本文所述的经修饰的il-7蛋白中的氨基酸取代包括在选自氨基酸位置10、11、14、19、81和85的氨基酸位置中的取代，其中所述氨基酸位置是相对于seqidno:2。例如，在一些实施方案中，氨基酸位置10处的氨基酸取代可以是k10i、k10m或k10v。在一些实施方案中，氨基酸位置11处的氨基酸取代可以是q11r。在一些实施方案中，氨基酸位置14处的氨基酸取代可以是s14t。在一些实施方案中，氨基酸位置19处的氨基酸取代可以是s19q。在一些实施方案中，氨基酸位置81处的氨基酸取代可以是k81m或k81r。在一些实施方案中，氨基酸位置85处的氨基酸取代可以是g85m。192.在一些实施方案中，如本文所述的经修饰的il-7保留了与天然il-7相似或基本相似的活性或功能。例如，在一些实施方案中，如本文所述的经修饰的il-7能够在细胞中启动内部信号传导。在一些实施方案中，细胞中的内部信号传导导致所述细胞的扩增或激活。193.根据本发明，还提供了编码如本文所述的经修饰的il-7的核酸。这种核酸可以能够被引入任何适当的宿主中、由任何适当的宿主繁殖以及在任何适当的宿主中表达，所述任何适当的宿主如细菌(即，大肠杆菌细胞)或真核宿主细胞(即，哺乳动物细胞)。编码经修饰的il-7的核酸可以提供于载体中以供在宿主细胞中产生。视情况而定，这种载体可以具有在宿主细胞中表达和复制所需的任何元件。此类元件以及用于其使用的方法是熟知的并且可以在本领域中获得。194.在一些实施方案中，经修饰的il-7蛋白可以进一步通过添加蛋白质标签进行修饰。蛋白质标记和相关方法是本领域熟知的。在一些实施方案中，经修饰的il-7可以被工程化为在c末端或n末端或两个末端同时含有组氨酸标签。例如，如本文所述的经修饰的il-7蛋白可以被修饰为具有c末端组氨酸标签。195.在一些实施方案中，il-7或其变体可以包含特定氨基酸位置中的突变。在一些实施方案中，突变体il-7可以在氨基酸位置10、11、14、19、81和85中的一个或多个位置中具有氨基酸取代。在一些实施方案中，突变体il-7可以在氨基酸位置10、11、14、19、81和85中的多于一个位置中具有氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，il-7变体或突变体可以具有如表7所列出的氨基酸取代。196.在一些实施方案中，il-7可以具有如下结构，所述结构包括具有il-7的生物活性的多肽和由1至10个氨基酸组成的寡肽。在一些实施方案中，il-7可以具有选自seqidno:8-16的氨基酸序列。另外，il-7蛋白可以包含与seqidno:8-16的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％和至少约99％的同源性的氨基酸序列。197.在一些实施方案中，il-7蛋白由编码il-7蛋白的核酸分子编码。所述核酸分子可以是编码具有选自seqidno:8-16的氨基酸序列的多肽的核酸分子，或与那些序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源性的核酸分子。所述核酸分子可以包括选自seqidno:8-16的多核苷酸序列，或与那些序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的多核苷酸序列。所述核酸分子还可以包含信号序列或前导序列。198.在一些实施方案中，中央疏水区包括4至12个疏水残基，其在未成熟多肽的易位期间通过膜脂双层将信号序列固定。在启动之后，通过称为信号肽酶的细胞酶可以频繁地在er的内腔内切断信号序列。特别地，所述信号序列可以是用于组织纤溶酶原激活(tpa)的分泌信号序列、单纯疱疹病毒糖蛋白d的信号序列(hsvgds)或生长激素。优选地，可以使用在高等真核细胞(包括哺乳动物等)中所用的分泌信号序列。另外，在一些实施方案中，作为分泌信号序列，可以使用包含在野生型il-7中的信号序列，或者其可以在用宿主细胞中具有高表达频率的密码子取代之后进行使用。199.在一些实施方案中，可用于本公开文本的il-7蛋白可以通过包含编码il-7蛋白的核酸分子的表达载体来编码。所述表达载体可以是rccmv(invitrogen，卡尔斯巴德)或其变体。所述表达载体可以包括用于促进靶基因在哺乳动物细胞中连续转录的人巨细胞病毒(cmv)，以及用于增加转录后rna的稳定状态的牛生长激素的多腺苷酸化信号序列。在一些实施方案中，所述表达载体是pad15，其是rccmv的经修饰的形式。200.在一些实施方案中，可用于本公开文本的il-7蛋白可以由包含表达载体的宿主细胞表达。适当的宿主细胞可以通过dna序列的转导或转染用于靶蛋白的表达和/或分泌。201.在一些实施方案中，待使用的适当的宿主细胞可以包括永生杂交瘤细胞、ns/0骨髓瘤细胞、293细胞，中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞、人羊水来源的细胞(capt细胞)或cos细胞。202.在一些实施方案中，可用于本公开文本的il-7蛋白可以通过以下方式制备：培养由表达载体转化的细胞；并且从培养物或从获得自培养过程的细胞收获il-7蛋白。203.在一些实施方案中，可用于本公开文本的il-7蛋白可以从培养基或细胞提取物纯化。例如，在获得其中分泌重组蛋白的培养基的上清液之后，可以通过市场上可获得的蛋白质浓度过滤器(例如，amicon或milliporepellicon超滤单元)浓缩上清液。然后，可以通过本领域已知的方法纯化浓缩液。例如，所述纯化可以使用与蛋白质a偶联的基质进行。204.在一些实施方案中，可以通过以下方式制备可用于本公开文本的il-7蛋白：在具有il-7活性或其类似活性的多肽的n末端包含具有由甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸或其组合组成的1至10个氨基酸残基的氨基酸序列的接头。205.当所述接头是肽接头时，在一些实施方案中，所述连接可以发生在任何连接区。它们可以使用本领域已知的交联剂偶联。在一些实施方案中，所述交联剂的例子可以包括n-羟基琥珀酰亚胺酯，如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛和4-叠氮基水杨酸；酰亚胺酯，包括二琥珀酰亚胺酯，如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)；以及双官能马来酰亚胺，如双-n-马来酰亚胺基-1,8-辛烷，但不限于此。206.另外，在一些实施方案中，所述接头可以是白蛋白接头。207.当所述接头由化学键形成时，所述化学键可以是二硫键、二胺键、硫胺键、羧胺键、酯键和共价键。208.上述制备方法还可以包括将编码由异质序列组成的多肽的多核苷酸与il-7蛋白连接的步骤。具体地，由异质序列组成的多肽可以是选自以下的任一种：免疫球蛋白的fc区或其部分、白蛋白、白蛋白结合多肽、pas、人绒毛膜促性腺激素β亚基的ctp、peg、xten、hes、白蛋白结合小分子以及它们的组合。209.所述il-7蛋白是与抗cd47抗体或其抗原结合片段组合施用。210.可以施用所述il-7蛋白以促进免疫效应细胞的增殖或存活，所述免疫效应细胞例如携带嵌合抗原受体(car)的免疫效应细胞，特别是工程化car-t细胞、car-inkt细胞或car-nk细胞。211.在一些实施方案中，可用于本公开文本的il-7蛋白还包含药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以是适合于递送至患者中的任何无毒材料。所述载体可以是蒸馏水、醇、脂肪、蜡或惰性固体。另外，其中还可以含有任何药学上可接受的佐剂(缓冲剂、分散剂)。212.另外，可以通过多种方法将含有所述il-7蛋白的药物组合物施用至受试者。此外，可以通过多种方法将含有所述il-7蛋白和抗cd47单克隆抗体及其抗原结合片段的药物组合物施用至受试者。例如，所述组合物可以是肠胃外施用，例如皮下、肌内或静脉内例如肌内施用。可以通过常规的无菌方法对所述组合物进行灭菌。所述组合物可以含有药学上可接受的辅助材料和调节生理条件如ph调节所需的佐剂、毒性调节剂及其类似物。具体例子可以包括乙酸钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。待包含在配制品中的所述il-7蛋白的浓度可以广泛变化。例如，根据重量，所述il-7蛋白的浓度可以小于约0.5％，并且通常或至少为约1％至多达15％至20％。可以基于所选择的特定施用方法、流体体积、粘度等来选择浓度。213.本发明方法包括将治疗有效量的所述il-7蛋白与抗cd47抗体或其抗原结合片段组合施用至具有与目标疾病相关或无关的健康状态的有需要的受试者。所述受试者可以是哺乳动物，并且优选地是人。214.可以通过适当的途径施用组合物。组合物可以通过直接施用(例如，通过经由注射、移植或局部施用至组织区域中局部施用)提供或系统地(例如，肠胃外或口服)提供。在一些实施方案中，所述il-7蛋白可以通过静脉内、皮下、眼内、腹膜内、肌内、口服、直肠内、眼眶内、大脑内、颅内、脊柱内、心室内、鞘内、脑内、囊内、鼻内或气溶胶施用。在其他实施方案中，所述组合物被配制为含有体液的水性或生理上适用的悬浮液或其溶液的一部分。因此，可以将所述生理上可接受的载体或转运体添加至所述组合物中并递送至患者，并且这不会对患者的电解质和/或体积平衡引起负面影响。因此，所述生理上可接受的载体或转运体可以是生理盐水。抗cd47抗体或其抗原结合片段将通过注射或输注施用，典型地通过静脉内施用。215.为了重构或补充所需蛋白质的功能，能够在特定细胞中表达融合蛋白的表达载体可以与任何生物学有效的载体一起施用。这可以是能够有效地将编码所需蛋白质或il-7融合蛋白的基因递送至体内细胞中的任何配制品或组合物。216.所述经修饰的il-7或il-7融合蛋白的单位剂量可以在0.001mg/kg至10mg/kg的范围内。在一个实施方案中，有待于与抗cd47抗体或其抗原结合片段组合用于组合疗法中的治疗有效量的所述il-7蛋白可以在0.01mg/kg至2mg/kg的范围内。在另一个实施方案中，对人的治疗有效量的所述蛋白质可以在0.02mg/kg至1mg/kg，例如20μg/kg至600μg/kg，例如60μg/kg至600μg/kg的范围内。在一些实施方案中，治疗有效量的il-7蛋白是约10mg/kg。在其他实施方案中，治疗有效量的il-7蛋白是约20μg/kg、约60μg/kg、约120μg/kg、约240μg/kg、约480μg/kg或约600μg/kg。在其他实施方案中，治疗有效量的il-7蛋白大约是约0.25mg、约1mg、约3mg、约6mg或约9mg的平剂量。在其他实施方案中，治疗有效量的il-7蛋白是平剂量。在一些实施方案中，治疗有效量的il-7蛋白是约0.25mg至约9mg，例如约0.25mg、约1mg、约3mg、约6mg或约9mg。在一些实施方案中，所述治疗有效量可以根据用于治疗的主题疾病和不利作用的存在而变化。在一些实施方案中，所述il-7蛋白的施用可以通过周期性推注或外部储库(例如，静脉输液袋)或通过来自内置装置(例如，生物腐蚀性植入物)的连续静脉内、皮下或腹膜内施用来进行。217.在某些实施方案中，所述il-7蛋白是以至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至少八周、至少九周或至少十周的给药间隔施用。218.在其他实施方案中，所述il-7蛋白可以重复施用。在其他实施方案中，所述il-7蛋白是施用至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。219.在某些实施方案中，可以配制所述il-7蛋白如下：例如，约3mg/ml至约100mg/mlil-7蛋白、约20mm柠檬酸钠、约5w/v％蔗糖、约1w/v％至2w/v％山梨糖醇或甘露糖醇以及约0.05w/v％tween80或泊洛沙姆(ph为约5.0)。220.在一些实施方案中，所述il-7蛋白和抗cd47抗体或其抗原结合片段可以与对于待预防或治疗的疾病具有预防或治疗作用的其他一种或多种药物或一种或多种生理上活性的物质组合施用，或者可以与其他一种或多种药物组合配制成组合制剂，例如，可以与免疫刺激剂(如造血生长因子、细胞因子、抗原和佐剂)组合施用。所述造血生长因子可以是干细胞因子(scf)、g-csf、gm-csf或flt-3配体。所述细胞因子可以是γ干扰素、il-2、il-15、il-21、il-12、rantes或b7-1。il-15和il-15类似物221.本文公开了经修饰的/突变体白介素-15(il-15)蛋白。此类经修饰的il-15蛋白在本文中也可以称为突变体il-15蛋白(例如，il-15变体、il-15突变体、il-15功能片段、il-15衍生物或其任何组合，例如，融合蛋白、嵌合蛋白等等)，只要il-15蛋白含有il-15的一种或多种生物活性即可，例如，能够与il-15r结合，例如诱导早期t细胞分化、促进t细胞稳态。222.本文公开了抗cd47抗体与天然和/或经修饰的il-7蛋白的组合及所述组合的用途。223.本文还公开了免疫效应细胞(例如，携带car的免疫效应细胞，如car-t细胞、car-inkt细胞或car-nk细胞)与天然和/或经修饰的il-15蛋白的组合以及所述组合的用途。此类组合刺激car-t细胞和其他携带car的免疫效应细胞在接受过继细胞转移疗法的患者中的扩增。224.在一些实施方案中，本公开文本提供了包含氨基酸取代的经修饰的白介素(il)蛋白。“经修饰的白介素”如“经修饰的il-15”在本文中也可以称为突变体白介素，如突变体il-15，并且所述经修饰的或突变体白介素蛋白可以具有至少一个氨基酸取代。所述经修饰的或突变体白介素蛋白保留了天然、未修饰的白介素蛋白的活性，使得所述经修饰的白介素激活细胞中的信号传导途径。225.如本文所述，根据本公开文本可用的氨基酸取代可以是任何氨基酸取代。在一些实施方案中，经修饰的il-15可以具有单个氨基酸取代，或可以具有2、3、4或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，特定氨基酸可以被取代为具有相似特性的另一氨基酸，即极性氨基酸被取代为另一极性氨基酸，或非极性氨基酸被取代为另一非极性氨基酸。在一些实施方案中，可用于本公开文本的氨基酸取代可以如表7中列出的取代。226.il-15与其受体结合，所述受体由il-15rα链、il-15rβ链(cd122)以及与il-7r共享的共同γ链构成。与所有其他细胞因子受体相比，il-15rα对il-15具有特别高的亲和力，这是由于il-15rα链的不寻常的结构具有称为寿司(sushi)结构域的另外的区域。对寿司结构域受体(il-15rα)的作用经由jak1和jak3激酶转导至细胞中，所述激酶使stat-3、stat-5和stat-6核因子磷酸化，并且在一些丝裂原激活激酶(mapk)的帮助下导致细胞核中il-15依赖性基因的转录增强。227.在一些实施方案中，所述经修饰的il-15蛋白可能能够与所述il蛋白的天然受体结合。例如，如本文所述的经修饰的il-15蛋白将与天然il-15受体结合以激活细胞中的il-15信号传导。228.il-15诱导t和nk细胞的增殖和细胞因子产生，以及效应记忆t细胞分化和对细胞凋亡的敏感性。il-15rα广泛表达，例如由淋巴样细胞、树突状细胞(dc)、成纤维细胞以及上皮细胞、肝细胞、肠细胞和其他细胞表达，并且被认为将il-15反式呈递给表达il-15β和γ链的细胞。229.在一些实施方案中，如本文所述的经修饰的il-15保留了与天然il-15相似或基本相似的活性或功能。例如，在一些实施方案中，如本文所述的经修饰的il-15能够在细胞中启动内部信号传导。在一些实施方案中，细胞中的内部信号传导导致所述细胞的扩增或激活。230.在一些实施方案中，所述il-15蛋白包括包含seqidno:31-45中任一个所述的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述il-15蛋白包含与seqidno:17-31的序列具有约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％或更高序列同一性的氨基酸序列。231.在一些实施方案中，所述il-15蛋白包括经修饰的il-15或其片段，其中所述经修饰的il-15或其片段保留了野生型il-15的一种或多种生物活性。在一些实施方案中，所述il-15蛋白可以源自人、大鼠、小鼠、猴、牛或羊。232.在一些实施方案中，所述人il-15可以具有由seqidno:29(genbank登录号p40933)表示的氨基酸序列。233.根据本发明，还提供了编码如本文所述的经修饰的il-15的核酸。这种核酸可以能够被引入任何适当的宿主中、由任何适当的宿主繁殖以及在任何适当的宿主中表达，所述任何适当的宿主如细菌(即，大肠杆菌细胞)或真核宿主细胞(即，哺乳动物细胞)。编码经修饰的il-15的核酸可以提供于载体中以供在宿主细胞中产生。视情况而定，这种载体可以具有在宿主细胞中表达和复制所需的任何元件。此类元件以及用于其使用的方法是熟知的并且可以在本领域中获得。234.在一些实施方案中，经修饰的il-15蛋白可以进一步通过添加蛋白质标签进行修饰。蛋白质标记和相关方法是本领域熟知的。在一些实施方案中，经修饰的il-15可以被工程化为在c末端或n末端或两个末端同时含有组氨酸标签。在一些实施方案中，如本文所述的经修饰的il-15蛋白可以被修饰为具有n末端组氨酸标签。235.在一些实施方案中，il-15或其变体可以包含特定氨基酸位置中的突变。在一些实施方案中，突变体il-15可以在氨基酸位置3、4、11、72、79和112中的一个或多个位置中具有氨基酸取代。在一些实施方案中，突变体il-15可以在氨基酸位置3、4、11、72、79和112中的多于一个位置中具有氨基酸取代。例如，在一些实施方案中，il-15变体或突变体可以具有如表7所列出的氨基酸取代。236.在一些实施方案中，如本文所述的经修饰的il-15蛋白中的氨基酸取代包括在选自氨基酸位置3、4、11、72、79和112的氨基酸位置中的取代，其中所述氨基酸位置是相对于seqidno:30。在一些实施方案中，氨基酸位置3处的氨基酸取代可以是v3i、v3m或v3r。在一些实施方案中，氨基酸位置4处的氨基酸取代可以是n4h。在一些实施方案中，氨基酸位置11处的氨基酸取代可以是k11l、k11m或k11r。在一些实施方案中，氨基酸位置72处的氨基酸取代可以是n72d、n72r或n72y。在一些实施方案中，氨基酸位置79处的氨基酸取代可以是n79e或n79s。在一些实施方案中，氨基酸位置112处的氨基酸取代是n112h、n112m或n112y。本领域技术人员将能够鉴定根据本公开文本的可能有益的氨基酸取代。237.在一些实施方案中，il-15可以具有如下结构，所述结构包括具有il-15的生物活性的多肽和由1至10个氨基酸组成的寡肽。在一些实施方案中，il-15可以具有选自seqidno:31-45的氨基酸序列。另外，il-15蛋白可以包含与seqidno:31-45的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％和至少约99％的同源性的氨基酸序列。238.在一些实施方案中，il-15蛋白由编码il-15蛋白的核酸分子编码。所述核酸分子可以是编码具有选自seqidno:31-45的氨基酸序列的多肽的核酸分子，或与那些序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源性的核酸分子。所述核酸分子可以包括选自seqidno:31-45的多核苷酸序列，或与那些序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的多核苷酸序列。所述核酸分子还可以包含信号序列或前导序列。239.在一些实施方案中，中央疏水区包括4至12个疏水残基，其在未成熟多肽的易位期间通过膜脂双层将信号序列固定。在启动之后，通过称为信号肽酶的细胞酶可以频繁地在er的内腔内切断信号序列。特别地，所述信号序列可以是用于组织纤溶酶原激活(tpa)的分泌信号序列、单纯疱疹病毒糖蛋白d的信号序列(hsvgds)或生长激素。优选地，可以使用在高等真核细胞(包括哺乳动物等)中所用的分泌信号序列。另外，在一些实施方案中，作为分泌信号序列，可以使用包含在野生型il-15中的信号序列，或者其可以在用宿主细胞中具有高表达频率的密码子取代之后进行使用。240.在一些实施方案中，可用于本公开文本的il-15蛋白可以通过包含编码il-15蛋白的核酸分子的表达载体来编码。所述表达载体可以是rccmv(invitrogen，卡尔斯巴德)或其变体。所述表达载体可以包括用于促进靶基因在哺乳动物细胞中连续转录的人巨细胞病毒(cmv)，以及用于增加转录后rna的稳定状态的牛生长激素的多腺苷酸化信号序列。在一些实施方案中，所述表达载体是pad15，其是rccmv的经修饰的形式。241.在一些实施方案中，可用于本公开文本的il-15蛋白可以由包含表达载体的宿主细胞表达。适当的宿主细胞可以通过dna序列的转导或转染用于靶蛋白的表达和/或分泌。242.在一些实施方案中，待使用的适当的宿主细胞可以包括永生杂交瘤细胞、ns/0骨髓瘤细胞、293细胞，中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞、人羊水来源的细胞(capt细胞)或cos细胞。243.在一些实施方案中，可用于本公开文本的il-15蛋白可以通过以下方式制备：培养由表达载体转化的细胞；并且从培养物或从获得自培养过程的细胞收获il-15蛋白。244.在一些实施方案中，可用于本公开文本的il-15蛋白可以从培养基或细胞提取物纯化。例如，在获得其中分泌重组蛋白的培养基的上清液之后，可以通过市场上可获得的蛋白质浓度过滤器(例如，amicon或milliporepellicon超滤单元)浓缩上清液。然后，可以通过本领域已知的方法纯化浓缩液。例如，所述纯化可以使用与蛋白质a偶联的基质进行。245.在一些实施方案中，可以通过以下方式制备可用于本公开文本的il-15蛋白：在具有il-15活性或其类似活性的多肽的n末端包含具有由甲硫氨酸、甘氨酸或其组合组成的1至10个氨基酸残基的氨基酸序列的连接寡核苷酸。246.当所述接头是肽接头时，在一些实施方案中，所述连接可以发生在任何连接区。它们可以使用本领域已知的交联剂偶联。在一些实施方案中，所述交联剂的例子可以包括n-羟基琥珀酰亚胺酯，如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛和4-叠氮基水杨酸；酰亚胺酯，包括二琥珀酰亚胺酯，如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)；以及双官能马来酰亚胺，如双-n-马来酰亚胺基-1,8-辛烷，但不限于此。247.另外，在一些实施方案中，所述接头可以是白蛋白接头。248.当所述接头由化学键形成时，所述化学键可以是二硫键、二胺键、硫胺键、羧胺键、酯键和共价键。249.上述制备方法还可以包括将编码由异质序列组成的多肽的多核苷酸与il-15蛋白连接的步骤。具体地，由异质序列组成的多肽可以是选自以下的任一种：免疫球蛋白的fc区或其部分、白蛋白、白蛋白结合多肽、pas、人绒毛膜促性腺激素β亚基的ctp、peg、xten、hes、白蛋白结合小分子以及它们的组合。250.所述il-15蛋白是与抗cd47抗体或其抗原结合片段组合施用。251.可以施用所述il-15蛋白以促进免疫效应细胞的增殖或存活，所述免疫效应细胞例如携带嵌合抗原受体(car)的免疫效应细胞，特别是工程化car-t细胞、car-inkt细胞或car-nk细胞。252.在一些实施方案中，可用于本公开文本的il-15蛋白还包含药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以是适合于递送至患者中的任何无毒材料。所述载体可以是蒸馏水、醇、脂肪、蜡或惰性固体。另外，其中还可以含有任何药学上可接受的佐剂(缓冲剂、分散剂)。253.另外，可以通过多种方法将含有所述il-15蛋白的药物组合物施用至受试者。此外，可以通过多种方法将含有所述il-15蛋白和抗cd47单克隆抗体及其抗原结合片段的药物组合物施用至受试者。例如，所述组合物可以是肠胃外施用，例如皮下、肌内或静脉内例如肌内施用。可以通过常规的无菌方法对所述组合物进行灭菌。所述组合物可以含有药学上可接受的辅助材料和调节生理条件如ph调节所需的佐剂、毒性调节剂及其类似物。具体例子可以包括乙酸钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。待包含在配制品中的所述il-15蛋白的浓度可以广泛变化。例如，根据重量，所述il-15蛋白的浓度可以小于约0.5％，并且通常或至少为约1％至多达15％至20％。可以基于所选择的特定施用方法、流体体积、粘度等来选择浓度。254.本发明方法包括将治疗有效量的所述il-15蛋白与抗cd47抗体或其抗原结合片段组合施用至具有与目标疾病相关或无关的健康状态的有需要的受试者。所述受试者可以是哺乳动物，并且优选地是人。255.可以通过适当的途径施用组合物。组合物可以通过直接施用(例如，通过经由注射、移植或局部施用至组织区域中局部施用)提供或系统地(例如，肠胃外或口服)提供。在一些实施方案中，所述il-15蛋白可以通过静脉内、皮下、眼内、腹膜内、肌内、口服、直肠内、眼眶内、大脑内、颅内、脊柱内、心室内、鞘内、脑内、囊内、鼻内或气溶胶施用。在其他实施方案中，所述组合物被配制为含有体液的水性或生理上适用的悬浮液或其溶液的一部分。因此，可以将所述生理上可接受的载体或转运体添加至所述组合物中并递送至患者，并且这不会对患者的电解质和/或体积平衡引起负面影响。因此，所述生理上可接受的载体或转运体可以是生理盐水。抗cd47抗体或其抗原结合片段将通过注射或输注施用，典型地通过静脉内施用。256.为了重构或补充所需蛋白质的功能，能够在特定细胞中表达融合蛋白的表达载体可以与任何生物学有效的载体一起施用。这可以是能够有效地将编码所需蛋白质或il-15融合蛋白的基因递送至体内细胞中的任何配制品或组合物。257.所述经修饰的il-15或il-15融合蛋白的单位剂量可以在0.001mg/kg至10mg/kg的范围内。在一个实施方案中，有待于与抗cd47抗体或其抗原结合片段组合用于组合疗法中的治疗有效量的所述il-15蛋白可以在0.01mg/kg至2mg/kg的范围内。在另一个实施方案中，对人的治疗有效量的所述蛋白质可以在0.02mg/kg至1mg/kg，例如20μg/kg至600μg/kg，例如60μg/kg至600μg/kg的范围内。在一些实施方案中，治疗有效量的il-15蛋白是约10mg/kg。在其他实施方案中，治疗有效量的il-15蛋白是约20μg/kg、约60μg/kg、约120μg/kg、约240μg/kg、约480μg/kg或约600μg/kg。在其他实施方案中，治疗有效量的il-15蛋白大约是约0.25mg、约1mg、约3mg、约6mg或约9mg的平剂量。在其他实施方案中，治疗有效量的il-15蛋白是平剂量。在一些实施方案中，治疗有效量的il-15蛋白是约0.25mg至约9mg，例如约0.25mg、约1mg、约3mg、约6mg或约9mg。在一些实施方案中，所述治疗有效量可以根据用于治疗的主题疾病和不利作用的存在而变化。在一些实施方案中，所述il-15蛋白的施用可以通过周期性推注或外部储库(例如，静脉输液袋)或通过来自内置装置(例如，生物腐蚀性植入物)的连续静脉内、皮下或腹膜内施用来进行。258.在某些实施方案中，所述il-15蛋白是以至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至少八周、至少九周或至少十周的给药间隔施用。259.在其他实施方案中，所述il-15蛋白可以重复施用。在其他实施方案中，所述il-15蛋白是施用至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。260.在某些实施方案中，可以配制所述il-15蛋白如下：例如，约3mg/ml至约100mg/mlil-15蛋白、约20mm柠檬酸钠、约5w/v％蔗糖、约1w/v％至2w/v％山梨糖醇或甘露糖醇以及约0.05w/v％tween80或泊洛沙姆(ph为约5.0)。261.在一些实施方案中，所述il-15蛋白和抗cd47抗体或其抗原结合片段可以与对于待预防或治疗的疾病具有预防或治疗作用的其他一种或多种药物或一种或多种生理上活性的物质组合施用，或者可以与其他一种或多种药物组合配制成组合制剂，例如，可以与免疫刺激剂(如造血生长因子、细胞因子、抗原和佐剂)组合施用。所述造血生长因子可以是干细胞因子(scf)、g-csf、gm-csf或flt-3配体。所述细胞因子可以是γ干扰素、il-2、il-15、il-21、il-12、rantes或b7-1。cd47抗体262.许多人类癌症上调cd47的细胞表面表达，并且表达最高水平的cd47的癌症显现出对患者最具侵袭性且最为致命。增加的cd47表达被认为通过经由sirpα(一种阻止携带cd47的细胞的吞噬作用的抑制性受体)向巨噬细胞发送“不要吃我”信号来保护癌细胞免于吞噬清除(oldenborg等人science288:2051-2054,2000；jaiswal等人(2009)cell138(2):271-85l；chao等人(2010)sciencetranslationalmedicine2(63):63ra94)。因此，许多癌症的cd47表达的增加为它们提供了“自我”隐藏，这减慢了通过巨噬细胞和树突状细胞对它们的吞噬清除。263.阻断cd47并防止其与sirpα结合的抗体已在鼠(异种移植物)肿瘤模型中对人肿瘤显示出功效。展现出这种特性的此类阻断性抗cd47mab增加了巨噬细胞对癌细胞的吞噬，这可以降低肿瘤负担(majeti等人(2009)cell138(2):286-99；us9,045,541；willingham等人(2012)procnatlacad.sci.usa109(17):6662-6667；xiao等人(2015)cancerletters360:302-309；chao等人(2012)cell142:699-713；kim等人(2012)leukemia26:2538-2545)，并且可以最终导致产生对所述肿瘤的适应性免疫应答(tseng等人(2013)procnatlacad.sci.usa110(27):11103-11108；soto-pantoja等人(2014)cancerres.74(23):6771-6783；liu等人(2015)nat.med.21(10):1209-1215)。264.然而，存在这样的机制，通过此机制抗cd47mab可以攻击尚未在癌症的治疗中利用的细胞。多个组已经表明，特定的抗人cd47mab诱导人肿瘤细胞的细胞死亡。抗cd47mabad22诱导多种人肿瘤细胞系的细胞死亡(pettersen等人j.immuno.166:4931-4942,2001；lamy等人j.biol.chem.278:23915-23921,2003)。显示出ad22可使用早期磷脂酰丝氨酸暴露和线粒体膜电位的下降诱导快速线粒体功能障碍和快速细胞死亡(lamy等人j.biol.chem.278:23915-23921,2003)。抗cd47mabmabl-2及其片段在体外诱导人白血病idno:63).275.》vx9humh14全长重链276.evqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgytftnywihwvrqmpgkglewmgytdprtdyteynqkfkdqvtisadksistaylqwsslkasdtamyycarggrvglgywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:64).277.》vx9humh15全长重链278.qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgytftnywihwvrqapgqglewmgytdprtdyteyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarggrvglgywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:65).279.》vx9humh16全长重链280.evqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgytftnywihwvrqmpgkglewmgytdprtdyteyspsfqgqvtisadksistaylqwsslkasdtamyycarggrvglgywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:66).281.》vx9huml02全长轻链282.divmtqspdslavslgeratincrssqnivqsngntylewyqqkpgqppklliykvfhrfsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycfqgshvpytfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:67).283.》vx9huml07全长轻链284.dvvmtqsplslpvtlgqpasiscrssqnivqsngntylewfqqrpgqsprrliykvfhrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycfqgshvpytfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:68).抗cd47-il-7融合蛋白285.本文公开的抗cd47-il-7融合蛋白包含分别与人κ或任何人fcig恒定结构域组合的人重链可变结构域和轻链可变结构域。轻或重抗体链的c或n末端的甘氨酸-丝氨酸接头(g4s)n被设计为将il-7(野生型或突变体)与抗体多肽连接。这些融合构建体被设计为掺入分泌信号并被克隆至哺乳动物表达系统中，并且将其转染至cho细胞中以产生抗体融合蛋白。所述蛋白质变体被表达、分泌至培养基中，并使用蛋白质a树脂纯化。286.人源化小鼠的模型可以用于确定抗cd47-il-7融合蛋白的功效。这种人源化小鼠模型表达cd47和人sirp，因此sirp/cd47联盟将被抗cd47抗体阻断。这种人源化小鼠模型是其中存在完整免疫系统的同基因模型，其允许评估il-7对肿瘤功效的贡献。287.在双人源化小鼠模型b-hsirpα/hcd47中，sirpα和cd47的人细胞外结构域替代它们各自的鼠对应物。纯合b-hsirpα/hcd47小鼠表达人源化sirpα和cd47而不表达野生型小鼠sirpα和cd47。使用这些小鼠允许评估人特异性cd47mab以及评估适应性免疫应答的作用。肿瘤模型的例子可以是mc38-hcd47细胞系，其在mc38结肠癌细胞中表达人cd47。在测试期间，抗人cd47和抗人sirpα抗体在b-hsirpα/hcd47小鼠中控制mc38-hcd47肿瘤生长是有效的。288.在另一个例子中，可以将人免疫系统移植在小鼠中。这将允许异种移植物肿瘤的植入并评估ao-176和il-7对抗肿瘤功效的贡献。289.在骨髓细胞清除治疗后，通过使用人脐带血来源的cd34 干细胞过继转移对nsg小鼠进行人源化。cd34 干细胞分化成在免疫缺陷型nsg小鼠内植入的人免疫细胞。植入了脐带血来源的造血干细胞(hsc)的模型开发多谱系植入并显示稳健的t细胞成熟和t细胞依赖性炎性应答。290.最后，可以开发同基因模型，其中测试可以利用鼠特异性cd47-il7融合物。携带嵌合抗原受体(car)的免疫效应细胞291.本文公开了经修饰的/突变体il-7或经修饰的/突变体il-15蛋白，以及与携带car的免疫效应细胞(如car-t细胞、car-inkt细胞或car-nk)的组合使用。以下章节描述了有待于与经修饰的/突变体il-7和il-15蛋白一起使用的携带car的免疫效应细胞的例子。292.car-t细胞是表达嵌合抗原受体的t细胞。如本文所用的短语“嵌合抗原受体(car)”是指重组融合蛋白，其具有与细胞内结构域偶联的抗原特异性细胞外结构域，所述细胞内结构域引导细胞在抗原结合至细胞外结构域时执行特化功能。术语“人工t细胞受体”、“嵌合t细胞受体”和“嵌合免疫受体”在本文中各自可以与术语“嵌合抗原受体”互换使用。嵌合抗原受体通过它们同时结合mhc依赖性抗原并经由它们的细胞内结构域转导激活信号的能力而区别于其他抗原结合剂。下面更详细地讨论了car的细胞外和细胞内部分。293.嵌合抗原受体的抗原特异性细胞外结构域识别并特异性地结合抗原，通常是恶性肿瘤的表面表达的抗原。当例如抗原特异性细胞外结构域以在约0.1pm至约10m，优选地约0.1pm至约1m，更优选地约0.1pm至约100nm之间的亲和力常数或相互作用亲和力(kd)结合抗原时，所述抗原特异性细胞外结构域特异性地结合所述抗原。用于确定相互作用亲和力的方法是本领域已知的。适用于本公开文本的car的抗原特异性细胞外结构域可以是任何抗原结合多肽，其众多种类是本领域已知的。适用于本公开文本的car的抗原特异性细胞外结构域可以是任何抗原结合多肽，其众多种类是本领域已知的。在一些情况下，所述抗原结合结构域是单链fv(scfv)。其他基于抗体的识别结构域(cabvhh(骆驼抗体可变结构域)及其人源化形式、ignarvh(鲨鱼抗体可变结构域)及其人源化形式、sdabvh(单链结构域抗体可变结构域)和“驼源化”抗体可变结构域适合使用。在一些情况下，基于t细胞受体(tcr)的识别结构域如单链tcr(sctv，含有vαvβ的单链双结构域tcr)也适合使用。294.合适的抗原可以包括t细胞特有的抗原和/或非t细胞特有的抗原。在一个优选的实施方案中，由car-t细胞的嵌合抗原受体特异性地结合的抗原以及car-t细胞所缺乏的抗原是在恶性t细胞上表达的抗原，更优选地是与非恶性t细胞相比在恶性t细胞上过表达的抗原。“恶性t细胞”是源自t细胞恶性肿瘤的t细胞。术语“t细胞恶性肿瘤”是指源自t细胞前体、成熟t细胞或天然杀伤细胞的广泛、高度异质的恶性肿瘤分组。t细胞恶性肿瘤的非限制性例子包括t细胞急性淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤(t-all)、t细胞大颗粒淋巴细胞(lgl)白血病、人t细胞白血病病毒1型阳性(htlv-1 )、成人t细胞白血病/淋巴瘤(atl)、t细胞前淋巴细胞性白血病(t-pll)和各种外周t细胞淋巴瘤(ptcl)，包括但不限于血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤(aitl)、alk阳性间变性大细胞淋巴瘤和alk阴性间变性大细胞淋巴瘤。295.合适的car抗原还可以包括在多发性骨髓瘤细胞即恶性浆细胞的表面上发现的抗原，如bcma、cs1、cd38和cd19。296.可替代地，car可以被设计成表达april蛋白(即bcma和taci的配体)的细胞外部分，有效地共靶向bcma和taci二者以治疗多发性骨髓瘤。297.例如，举非限制性例子，cd2、cd3ε、cd4、cd5、cd7、trac、tcrβ、bcma、cs1、cd38和cd19可以是在恶性t细胞上表达的抗原。在一些实施方案中，本公开文本的car-t细胞包含嵌合抗原受体的与cd2特异性结合的细胞外结构域。在一些实施方案中，本公开文本的car-t细胞包含嵌合抗原受体的与cd3ε特异性结合的细胞外结构域。在一些实施方案中，本公开文本的car-t细胞包含嵌合抗原受体的与cd4特异性结合的细胞外结构域。在一些实施方案中，本公开文本的car-t细胞包含与cd5特异性结合的嵌合抗原受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，本公开文本的car-t细胞包含嵌合抗原受体的与cd7特异性结合的细胞外结构域。在又一些实施方案中，本公开文本的car-t细胞包含嵌合抗原受体的与trac特异性结合的细胞外结构域。在又一些实施方案中，本公开文本的car-t细胞包含与tcrβ特异性结合的嵌合抗原受体的细胞外结构域。在仍一些实施方案中，本公开文本的car-t细胞包含嵌合抗原受体的与bcma特异性结合的细胞外结构域。在仍一些实施方案中，本公开文本的car-t细胞包含嵌合抗原受体的与cs1特异性结合的细胞外结构域。在仍一些实施方案中，本公开文本的car-t细胞包含嵌合抗原受体的与cd38特异性结合的细胞外结构域。在仍一些实施方案中，本公开文本的car-t细胞包含嵌合抗原受体的与cd19特异性结合的细胞外结构域。298.本公开文本的嵌合抗原受体还包含细胞内结构域，其在抗原与抗原特异性细胞外结构域结合后向t细胞提供细胞内信号。本公开文本的嵌合抗原受体的细胞内信号传导结构域负责激活表达嵌合受体的t细胞的至少一种效应子功能。299.术语“细胞内结构域”是指car的一部分，其在抗原与细胞外结构域结合后转导效应子功能并引导t细胞执行特化功能。合适的细胞内结构域的非限制性例子包括t细胞受体的ζ链或其任何同源物(例如，η、δ、γ或ε)、mb1链、829、fcriii、fcri以及信号传导分子的组合(如cd3.ζ和cd28、cd27、4-1bb、dap-10、ox40及其组合)以及其他类似的分子和片段。可以使用激活蛋白家族的其他成员的细胞内信号传导部分，如fcγriii和fcεri。虽然通常将使用整个细胞内结构域，但在许多情况下，不需要使用整个细胞内多肽。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这样的截短部分可以用于代替整条链，只要它转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内结构域意在包括细胞内结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。通常，抗原特异性细胞外结构域通过跨膜结构域与嵌合抗原受体的细胞内结构域连接。跨膜结构域穿过细胞膜，将car锚定至t细胞表面，并将细胞外结构域与细胞内信号传导结构域连接，从而影响car在t细胞表面上的表达。嵌合抗原受体还可以进一步包含一个或多个共刺激结构域和/或一个或多个间隔子。共刺激结构域源自共刺激蛋白的细胞内信号传导结构域，其增强体内细胞因子产生、增殖、细胞毒性和/或持久性。“肽铰链”使抗原特异性细胞外结构域与跨膜结构域连接。将跨膜结构域与共刺激结构域融合，任选地将共刺激结构域与第二共刺激结构域融合，并且将共刺激结构域与信号传导结构域(不限于cd3ζ)融合。例如，在抗原特异性细胞外结构域与跨膜结构域之间以及在串联car的情况下在多个scfv之间包含间隔子结构域可以影响一个或多个抗原结合结构域的柔性从而影响car功能。合适的跨膜结构域、共刺激结构域和间隔子是本领域已知的。以类似的方式，可以构建其他单一car-t细胞。300.由本公开文本涵盖的car-t细胞缺乏嵌合抗原受体特异性地结合的一种或多种抗原，并因此是抵抗自相残杀的。在一些实施方案中，t细胞的一种或多种抗原被修饰为使得嵌合抗原受体不再特异性地结合所述一种或多种经修饰的抗原。例如，由嵌合抗原受体识别的一种或多种抗原的表位可以通过一个或多个氨基酸改变(例如，取代或缺失)进行修饰或者可以从抗原缺失所述表位。在一些实施方案中，所述一种或多种抗原的表达在t细胞中降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。用于减少蛋白质表达的方法是本领域已知的并且包括但不限于修饰或替代与编码所述蛋白质的核酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，t细胞被修饰为使得不表达所述一种或多种抗原，例如，通过缺失或破坏编码所述一种或多种抗原的基因。在上述每个实施方案中，car-t细胞可以缺乏嵌合抗原受体特异性地结合的一种或优选所有抗原。用于基因修饰t细胞以缺乏一种或多种抗原的方法是本领域熟知的。在示例性实施方案中，crispr/cas9基因编辑可以用于修饰t细胞以缺乏一种或多种抗原。301.由本公开文本涵盖的car-t细胞可以由于缺失t细胞受体(tcr)-cd3复合物的一部分而进一步缺乏内源性t细胞受体(tcr)信号传导。在各个实施方案中，可能需要消除或抑制本文公开的car-t细胞中的内源性tcr信号传导。例如，当使用同种异体t细胞产生car-t细胞时，减少或消除car-t细胞中的内源性tcr信号传导可以预防或减轻移植物抗宿主病(gvhd)。用于消除或抑制内源性tcr信号传导的方法是本领域已知的并且包括但不限于缺失tcr-cd3受体复合物的一部分，例如tcr受体α链(trac)、tcr受体β链(trbc)、cd3.ε、cd3.γ、cd3.δ和/或cd3.γ。缺失tcr受体复合物的一部分可以阻断tcr介导的信号传导，因此可以允许同种异体t细胞安全地用作car-t细胞的来源，而不会诱导危及生命的gvhd。302.可替代地或另外地，由本公开文本涵盖的car-t细胞还可以包含一种或多种自杀基因。如本文所用，“自杀基因”是指通过本领域已知的标准方法引入car-t细胞的核酸序列，当被激活时其导致car-t细胞的死亡。如果需要的话，自杀基因可以促进在体内有效跟踪和消除car-t细胞。通过激活自杀基因所促进的杀伤可以通过本领域已知的方法发生。本领域已知的合适的自杀基因治疗系统包括但不限于各种单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsvtk)/更昔洛韦(gcv)自杀基因治疗系统或可诱导的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9蛋白。在示例性实施方案中，自杀基因是cd34/胸苷激酶嵌合自杀基因。303.基因组编辑的双car-t细胞即cd2*cd3e-dcartδcd2δcd3ε可以通过以下方式产生：将商业合成的抗cd2单链可变片段克隆至含有具有cd28和4-1bb内部信号传导结构域的第3代car骨架的慢病毒载体中，并将商业合成的抗cd3e单链可变克隆至含有具有cd28和4-1bb内部信号传导结构域的另外的第3代car骨架的同一慢病毒载体中，从而从同一载体产生表达两种car构建体的质粒。304.在一些实施方案中，本公开文本提供了一种包含双嵌合抗原受体(dcar)(即从单一慢病毒构建体表达的两种car)的工程化t细胞，所述双嵌合抗原受体特异性地结合cd5和tcr受体α链(trac)，其中所述t细胞缺乏cd5和trac(例如，cd5*trac-dcartδcd5δtrac细胞)。在非限制性例子中，cd5和tcr受体α链(trac)的缺乏是通过以下方式导致：(a)对由t细胞表达的cd5和tcr受体α链(trac)进行修饰使得嵌合抗原受体不再特异性地结合经修饰的cd5和tcr受体α链(trac)，(b)对t细胞进行修饰使得t细胞中cd5和tcr受体α链(trac)的表达降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对t细胞进行修饰使得不表达cd5和tcr受体α链(trac)(例如，通过缺失或破坏编码cd5和/或tcr受体α链(trac)的基因)。在其他实施方案中，t细胞包含自杀基因。在非限制性例子中，cd5*trac-cartδcd5δtrac细胞中表达的自杀基因编码与人cd34edna的细胞外和跨膜结构域在框内融合的经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(tk)基因。305.在第二实施方案中，本公开文本提供了一种对特异性地结合cd7和tcr受体α链(trac)的dcar进行折衷的工程化t细胞，其中所述t细胞缺乏cd7和trac(例如，cd7*trac-dcartδcd7δtrac细胞)。在非限制性例子中，cd7和tcr受体α链(trac)的缺乏是通过以下方式导致：(a)对由t细胞表达的cd5和tcr受体α链(trac)进行修饰使得嵌合抗原受体不再特异性地结合经修饰的cd7和tcr受体α链(trac)，(b)对t细胞进行修饰使得t细胞中cd7和tcr受体α链(trac)的表达降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对t细胞进行修饰使得不表达cd7和tcr受体α链(trac)(例如，通过缺失或破坏编码cd7和/或tcr受体α链(trac)的基因)。在其他实施方案中，t细胞包含自杀基因。在非限制性例子中，cd7*trac-dcartδcd7δtrac细胞中表达的自杀基因编码与人cd34edna的细胞外和跨膜结构域在框内融合的经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(tk)基因。306.在第三实施方案中，本公开文本提供了一种对特异性地结合cd2和tcr受体α链(trac)的dcar进行折衷的工程化t细胞，其中所述t细胞缺乏cd2和trac(例如，cd2*trac-dcartδcd2δtrac细胞)。在非限制性例子中，cd2和tcr受体α链(trac)的缺乏是通过以下方式导致：(a)对由t细胞表达的cd2和tcr受体α链(trac)进行修饰使得嵌合抗原受体不再特异性地结合经修饰的cd2和tcr受体α链(trac)，(b)对t细胞进行修饰使得t细胞中cd7和tcr受体α链(trac)的表达降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对t细胞进行修饰使得不表达cd2和tcr受体α链(trac)(例如，通过缺失或破坏编码cd2和/或tcr受体α链(trac)的基因)。在其他实施方案中，t细胞包含自杀基因。在非限制性例子中，cd2*trac-dcartδcd2δtrac细胞中表达的自杀基因编码与人cd34edna的细胞外和跨膜结构域在框内融合的经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(tk)基因。307.以类似的方式，可以构建其他双car-t细胞。308.串联car-t细胞(等同地，tcar-t)是具有单个嵌合抗原多肽的t细胞，所述单个嵌合抗原多肽含有对不同靶标具有亲和力的两个不同的抗原识别结构域，其中所述抗原识别结构域通过肽接头连接并共享共同的一个或多个共刺激结构域，其中抗原识别结构域的结合将通过共同的一个或多个共刺激结构域和信号传导结构域发出信号。309.在一些实施方案中，本公开文本提供了一种包含串联嵌合抗原受体(tcar)(即共享单个细胞内结构域的两个scfv)的工程化t细胞，所述双嵌合抗原受体特异性地结合cd5和tcr受体α链(trac)，其中所述t细胞缺乏cd5和trac(例如，cd5*trac-tcartδcd5δtrac细胞)。在非限制性例子中，cd5和tcr受体α链(trac)的缺乏是通过以下方式导致：(a)对由t细胞表达的cd5和tcr受体α链(trac)进行修饰使得嵌合抗原受体不再特异性地结合经修饰的cd5和tcr受体α链(trac)，(b)对t细胞进行修饰使得t细胞中cd5和tcr受体α链(trac)的表达降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对t细胞进行修饰使得不表达cd5和tcr受体α链(trac)(例如，通过缺失或破坏编码cd5和/或tcr受体α链(trac)的基因)。在其他实施方案中，t细胞包含自杀基因。在非限制性例子中，cd5*trac-tcartδcd5δtrac细胞中表达的自杀基因编码与人cd34edna的细胞外和跨膜结构域在框内融合的经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(tk)基因。310.在第二实施方案中，本公开文本提供了一种对特异性地结合cd7和tcr受体α链(trac)的tcar进行折衷的工程化t细胞，其中所述t细胞缺乏cd7和trac(例如，cd7*trac-tcartδcd7δtrac细胞)。在非限制性例子中，cd7和tcr受体α链(trac)的缺乏是通过以下方式导致：(a)对由t细胞表达的cd5和tcr受体α链(trac)进行修饰使得嵌合抗原受体不再特异性地结合经修饰的cd7和tcr受体α链(trac)，(b)对t细胞进行修饰使得t细胞中cd7和tcr受体α链(trac)的表达降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对t细胞进行修饰使得不表达cd7和tcr受体α链(trac)(例如，通过缺失或破坏编码cd7和/或tcr受体α链(trac)的基因)。在其他实施方案中，t细胞包含自杀基因。在非限制性例子中，cd7*trac-tcartδcd7δtrac细胞中表达的自杀基因编码与人cd34edna的细胞外和跨膜结构域在框内融合的经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(tk)基因。311.在第三实施方案中，本公开文本提供了一种对特异性地结合cd2和tcr受体α链(trac)的tcar进行折衷的工程化t细胞，其中所述t细胞缺乏cd2和trac(例如，cd2*trac-tcartδcd2δtrac细胞)。在非限制性例子中，cd2和tcr受体α链(trac)的缺乏是通过以下方式导致：(a)对由t细胞表达的cd2和tcr受体α链(trac)进行修饰使得嵌合抗原受体不再特异性地结合经修饰的cd2和tcr受体α链(trac)，(b)对t细胞进行修饰使得t细胞中cd7和tcr受体α链(trac)的表达降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对t细胞进行修饰使得不表达cd2和tcr受体α链(trac)(例如，通过缺失或破坏编码cd2和/或tcr受体α链(trac)的基因)。在其他实施方案中，t细胞包含自杀基因。在非限制性例子中，cd2*trac-tcartδcd2δtrac细胞中表达的自杀基因编码与人cd34edna的细胞外和跨膜结构域在框内融合的经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(tk)基因。312.以类似的方式，可以构建其他串联car-t细胞。313.在某些实施方案中，本公开文本提供了一种包含特异性地结合cd7的单个car的工程化inkt细胞，其中所述inkt细胞缺乏cd7(例如，cd7-inkt-carδcd7细胞)。在非限制性例子中，cd7的缺乏是通过以下方式导致：(a)对由inkt细胞表达的cd7进行修饰使得嵌合抗原受体不再特异性地结合所述经修饰的cd7，(b)对inkt细胞进行修饰使得inkt细胞中的cd7表达降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对inkt细胞进行修饰使得不表达cd7(例如，通过缺失或破坏编码cd7的基因)。在其他实施方案中，inkt细胞包含自杀基因。在非限制性例子中，cd7-inkt-carδcd7细胞中表达的自杀基因编码与人cd34cdna的细胞外和跨膜结构域在框内融合的经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(tk)基因。314.可以通过将商业合成的抗cd7单链可变片段(scfv)克隆至具有cd28和4-1bb内部信号传导结构域的第3代car骨架中来产生cd7特异性inkt-car细胞的car。在p2a肽之后可以添加细胞外hcd34结构域，从而使得在病毒转导以及使用抗hcd34磁珠纯化后均能够检测car。可以遵循类似的方法来制备对其他恶性t细胞抗原具有特异性的car。315.以类似的方式，可以构建其他单一car-inkt细胞。316.在某些实施方案中，本公开文本提供了一种包含双car(dcar)(即由单个慢病毒构建体表达的两个car)的工程化inkt细胞，所述双car特异性地结合cd7和cd2，其中所述inkt细胞缺乏cd7和cd2(例如，cd7xcd2-inkt-dcarδcd7δcd2细胞)。在非限制性例子中，cd7和cd2的缺乏是通过以下方式导致：(a)对由inkt细胞表达的cd7和cd2进行修饰使得嵌合抗原受体不再特异性地结合所述经修饰的cd7或cd2，(b)对inkt细胞进行修饰使得inkt细胞中的cd7和cd2表达降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对inkt细胞进行修饰使得不表达cd7和cd2(例如，通过缺失或破坏编码cd7和/或cd2的基因)。在其他实施方案中，inkt细胞包含自杀基因。在非限制性例子中，cd7*cd2-inkt-dcarδcd7δcd2细胞中表达的自杀基因编码与人cd34cdna的细胞外和跨膜结构域在框内融合的经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(tk)基因。以类似的方式，可以构建其他双car-inkt细胞。317.在某些实施方案中，本公开文本提供了一种包含串联car(tcar)(即共享单个细胞内结构域的两个scfv)的工程化inkt细胞，所述串联car特异性地结合cd7和cd2，其中所述inkt细胞缺乏cd7和cd2(例如，cd7xcd2-inkt-tcarδcd7δcd2细胞)。在非限制性例子中，cd7和cd2的缺乏是通过以下方式导致：(a)对由inkt细胞表达的cd7和cd2进行修饰使得嵌合抗原受体不再特异性地结合所述经修饰的cd7或cd2，(b)对inkt细胞进行修饰使得inkt细胞中的cd7和cd2表达降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对inkt细胞进行修饰使得不表达cd7和cd2(例如，通过缺失或破坏编码cd7和/或cd2的基因)。在其他实施方案中，inkt细胞包含自杀基因。在非限制性例子中，cd7*cd2-inkt-tcarδcd7δcd2细胞中表达的自杀基因编码与人cd34cdna的细胞外和跨膜结构域在框内融合的经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(tk)基因。318.可以通过将商业合成的抗cd7单链可变片段(scfv)和抗cd2单链可变片段(scfv)克隆至具有cd28和4-1bb内部信号传导结构域的第3代car骨架中来产生基因组编辑的串联inkt-car细胞(即cd7*cd2-inkt-tcarδcd7δcd2)的tcar。在p2a肽之后可以添加细胞外hcd34结构域，从而使得在病毒转导以及使用抗hcd34磁珠纯化后均能够检测car。可以遵循类似的方法来制备对其他恶性t细胞抗原具有特异性的tcar。319.以类似的方式，可以构建其他串联inkt-car。320.car可以如wo2018027036a1中所披露的进行设计，任选地采用本领域技术人员所知的变化。可以如其中所披露的以及通过本领域已知的方法以及从商业来源获得慢病毒载体和细胞系，并对指导rna进行设计、验证以及合成。321.可以使用逆转录病毒将工程化car引入t细胞、inkt细胞或nk细胞，所述逆转录病毒有效且稳定地将编码嵌合抗原受体的核酸序列整合至靶细胞基因组中。本领域已知的其他方法包括但不限于慢病毒转导、基于转座子的系统、直接rna转染和crispr/cas系统(例如，使用合适的cas蛋白(如cas3、cas4、cas5、cas5e(或casd)、cas6、cas6e、cas6f、cas7、cas8a1、cas8a2、cas8b、cas8c、cas9、cas10、caslod、casf、casg、cash、csy1、csy2、csy3、cse1(或casa)、cse2(或casb)、cse3(或case)、cse4(或casc)、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3,csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csz1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cu1966等)的i型、ii型或iii型系统)。还可以使用锌指核酸酶(zfn)和转录激活子样效应子核酸酶(talen)。参见例如，shearerrf和saundersdn,“experimentaldesignforstablegeneticmanipulationinmammaliancelllines:lentivirusandalternatives,”genescells2015年1月；20(1):1-10。定义322.如本文所用，以下术语具有指示的含义。在整个说明书中可以出现其他定义。323.当公开了值的范围并且使用“从n1…至n2”或“在n1…与n2之间”的记法时，其中n1和n2是数字，那么除非另有规定，否则这种记法旨在包括数字本身以及它们之间的范围。这种范围可以是完整的或连续的并且包括端值。举例来说，“从2至6个碳”的范围旨在包括两个、三个、四个、五个和六个碳，因为碳是整数单位。相比之下，举例来说，“从1至3μm(微摩尔)”的范围旨在包括1μm、3μm以及其间至任何有效数字的一切值(例如，1.255μm、2.1μm、2.9999μm等等)。324.如本文所用的术语“约”旨在限定它修饰的数值，表示这种值在误差界限内可变。当未列出特定的误差界限如数据图表或表中给出的平均值的标准偏差时，应理解术语“约”意味着涵盖所列值的范围以及通过对该值向上或向下舍入也被包含在内的范围(有效数字考虑在内)。325.如本文所用，术语“cd47”、“整合素相关蛋白(iap)”、“卵巢癌抗原oa3”、“rh相关抗原”和“merg”是同义的，并且可以互换使用。326.术语“抗cd47抗体”是指本公开文本的抗体，其旨在用作治疗剂，并且将具有对于用作治疗剂所需的结合亲和力。327.如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(ig)分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原(与抗原免疫反应)的抗原结合位点的分子。与或针对……“特异性结合”或“免疫反应”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原性决定簇反应，并且不与其他多肽反应或以低得多的亲和力(kd》10-6)结合。抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、单链fv片段和单臂抗体。328.如本文所用，如应用于本发明抗体化合物的术语“单克隆抗体”(mab)是指源自单个拷贝或克隆(包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，而不是产生它的方法。本公开文本的mab优选地存在于均质或基本上均质的群体中。完整的mab含有2条重链和2条轻链。[0329]“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于fv、fab、fab'、fab’‑sh、f(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scfv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。[0330]如本文所公开的，“抗体化合物”是指mab及其抗原结合片段。可以通过常规方法产生展现出根据本公开文本的类似功能特性的另外的抗体化合物。例如，可以用人cd47或其片段免疫小鼠，所得抗体可以进行回收和纯化，并且可以通过在本领域中已知的方法评估确定它们是否具有与本文公开的抗体化合物具有类似/相同的结合和功能特性。抗原结合片段也可以通过常规方法来制备。用于产生和纯化抗体和抗原结合片段的方法是本领域熟知的，并且可以发现于例如harlow和lane(1988)antibodies,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,第5-8章和第15章。[0331]如本文所用，术语“fc区”、“fc片段”或“fc”是指如下蛋白质，其包含免疫球蛋白的重链恒定区2(ch2)和重链恒定区3(ch3)但不包含其重链和轻链可变区以及轻链恒定区(cl1)，并且其可以进一步包含重链恒定区的铰链区。杂合体fc或杂合体fc片段可以称为“hfc”或“hyfc”概念。[0332]如本文所用，术语“人源化的”和/或“人源化”是指将本文公开的鼠单克隆抗体cdr移植至人框架(fr)和恒定区。这些术语还涵盖了通过kashmiri等人(2005)methods36(1):25-34以及hou等人(2008)j.biochem.144(1):115-120中公开的方法对鼠cdr以及人fr的可能的进一步修饰以改善多种抗体特性。[0333]如本文所用，术语“人源化抗体”是指mab及其抗原结合片段(包括本文公开的抗cd47抗体化合物)，所述mab及其抗原结合片段具有根据本公开文本的结合和功能特性，并且在源自非人抗体的cdr周围具有基本上人或完全人的fr和恒定区。[0334]如本文所用，术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，其细胞尚未移行至受试者体内除了初始恶性肿瘤或肿瘤的部位以外的部位的那些)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如，因转移产生的那些，转移即恶性细胞或肿瘤细胞移行至不同于初始肿瘤部位的继发性部位)。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、骨髓瘤和白血病。[0335]这些癌症或恶性肿瘤的更特别的例子如下所示并且包括：急性儿童淋巴母细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、艾滋病相关淋巴瘤、艾滋病相关恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌症、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性淋巴母细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞瘤、儿童霍奇金病、儿童霍奇金淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童淋巴母细胞性白血病、儿童髓母细胞瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、儿童松果体和幕上原发性神经外胚层肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠癌、皮肤t细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇氏病、胆囊癌、胃部癌症、胃肠类癌肿瘤、胃肠肿瘤、生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金病、霍奇金淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性障碍、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、原发灶不明转移性鳞状颈癌(metastaticoccultprimarysquamousneckcancer)、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、髓细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性障碍、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、妊娠期非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、原发灶不明转移性鳞状颈癌(occultprimarymetastaticsquamousneckcancer)、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维性组织细胞瘤、骨肉瘤/骨的恶性纤维性组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、副蛋白血症、紫癜、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌症、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节病肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原发性神经外胚层和松果体肿瘤、t细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行性肾盂和输尿管癌症、滋养细胞肿瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、肾母细胞瘤以及位于上文所列器官系统中的任何其他过度增生性疾病。[0336]术语“组合疗法”意指施用两种或更多种治疗剂以治疗本公开文本中描述的治疗性病症或障碍。这种施用涵盖以基本上同时的方式共施用这些治疗剂，如在具有固定比率的活性成分的单个胶囊中或在多个对于每种活性成分的单独胶囊中。另外，这种施用还涵盖以顺序方式使用每种类型的治疗剂。在任一种情况下，治疗方案在治疗本文所述的病症或障碍中将提供药物组合的有益效果。[0337]如本文所用的术语“组合物”是指免疫治疗细胞群与一种或多种治疗上可接受的载体的组合。[0338]本文所用的术语“疾病”旨在一般与术语“障碍”、“综合征”和“病症”(如在医学病症中)同义，并且与其可互换使用，因为所有这些都反映了人体或动物身体或其部位之一的损害正常功能的异常状况，所述异常状况通常体现为有区别的体征和症状并且使人或动物具有降低的寿命或生活质量。[0339]术语“效应子功能”是指分化细胞的特化功能。t细胞的效应子功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。在初始、记忆或记忆型t细胞中的效应子功能还可以包括抗原依赖性增殖。[0340]如本文所用的术语“自相残杀”意指当car-t细胞、inkt-car细胞或nk-car细胞成为另一个car-t细胞、inkt-car细胞或nk-car细胞(其与car-t细胞、inkt-car细胞或nk-car细胞的靶标包含相同的嵌合抗原受体)的靶标并且被其杀伤时发生的过程，因为靶向的细胞表达由两个细胞上的嵌合抗原受体特异性识别的抗原。包含嵌合抗原受体且缺乏嵌合抗原受体所特异性结合的抗原的car-t细胞、inkt-car细胞或nk-car细胞将是“抵抗自相残杀的”。[0341]如本文所用，il-15蛋白的术语“基因表达”或“表达”应理解为是指dna序列的转录、mrna转录物的翻译以及蛋白质产物或抗体或其抗体片段的分泌。[0342]如本文所用，il-15蛋白的术语“基因表达”或“表达”应理解为是指dna序列的转录、mrna转录物的翻译以及蛋白质产物或抗体或其抗体片段的分泌。[0343]本文所用的术语“基因组编辑”意指添加、缺失或修饰基因以使其为非功能性的。因此，在某些实施方案中，“基因编辑的t细胞”或“基因编辑的t细胞、nk细胞或inkt细胞”是如下t细胞、nk细胞或inkt细胞，其添加基因(如识别至少一种抗原的car)；和/或缺失基因(针对如由car识别的一种或多种抗原的基因)。[0344]如本文所用的“健康供体”是没有血液恶性肿瘤(例如，t细胞恶性肿瘤)的供体。[0345]如本文所用，术语“宿主细胞”是指其中可以引入重组表达载体的原核细胞和/或真核细胞。[0346]如本文所用，术语“过度增生性疾病”和“过度增生性障碍”是指所有肿瘤细胞(包括所有转化的细胞和组织以及所有癌细胞和癌组织)生长和增殖，无论是恶性还是良性。过度增生性疾病或障碍包括但不限于癌前病变、异常细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤和“癌症”。过度增生性疾病、障碍和/或病症的另外的例子包括但不限于位于身体的任何组织、系统或器官中的肿瘤，无论是良性还是恶性。[0347]术语“免疫检查点抑制剂”是指一种类型的药物，其阻断由一些类型的免疫系统细胞(如t细胞)和一些癌细胞产生的某些蛋白质。[0348]如本文所用的术语“免疫效应细胞”是主动参与肿瘤细胞的破坏(例如，具有抗肿瘤活性)的细胞。这些细胞可以包括但不限于天然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t细胞和记忆t细胞。[0349]术语“携带嵌合抗原受体(car)的免疫效应细胞”是表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞。这些细胞可以包括但不限于car-t细胞、携带car的inkt细胞(inkt-car)或携带car的nk细胞(nk-car)。[0350]术语“car-t细胞”意指表达嵌合抗原受体的car-t细胞。[0351]“双car-t细胞”(等同地，dcar-t)是car-t细胞，其表达对在同一效应细胞内表达的不同靶抗原具有亲和力的两种不同的嵌合抗原受体多肽，其中每种car独立地起作用。car可以由单个多核苷酸序列或多个核苷酸序列表达。[0352]串联“car-t”细胞(等同地，tcar-t)是具有单个嵌合抗原多肽的car-t细胞，所述单个嵌合抗原多肽含有对不同靶标具有亲和力的两个不同的抗原识别结构域，其中所述抗原识别结构域通过肽接头连接并共享共同的一个或多个共刺激结构域，并且其中抗原识别结构域的结合将通过共同的一个或多个共刺激结构域和信号传导结构域发出信号。[0353]术语“car-inkt细胞”(等同地，inkt-car)意指表达嵌合抗原受体的inkt细胞。[0354]“双inkt-car细胞”(等同地，inkt-dcar)是inkt-car细胞，其表达对在同一效应细胞内表达的不同靶抗原具有亲和力的两种不同的嵌合抗原受体多肽，其中每种car独立地起作用。car可以由单个多核苷酸序列或多个核苷酸序列表达。[0355]“串联inkt-car-t细胞”(等同地，inkt-tcar)是具有单个嵌合抗原多肽的inkt-car细胞，所述单个嵌合抗原多肽含有对不同靶标具有亲和力的两个不同的抗原识别结构域，其中所述抗原识别结构域通过肽接头连接并共享共同的一个或多个共刺激结构域，并且其中抗原识别结构域的结合将通过共同的一个或多个共刺激结构域和信号传导结构域发出信号。[0356]术语“car-nk细胞”(等同地，car-nk)意指表达嵌合抗原受体的nk细胞。[0357]“双nk-car细胞”(等同地，nk-dcar)是nk-car细胞，其表达对在同一效应细胞内表达的不同靶抗原具有亲和力的两种不同的嵌合抗原受体多肽，其中每种car独立地起作用。car可以由单个多核苷酸序列或多个核苷酸序列表达。[0358]“串联nk-car细胞”(等同地，nk-tcar)是具有单个嵌合抗原多肽的nk-car细胞，所述单个嵌合抗原多肽含有对不同靶标具有亲和力的两个不同的抗原识别结构域，其中所述抗原识别结构域通过肽接头连接并共享共同的一个或多个共刺激结构域，并且其中抗原识别结构域的结合将通过共同的一个或多个共刺激结构域和信号传导结构域发出信号。[0359]如本文所用，术语“恶性肿瘤”是指非良性肿瘤或癌症。[0360]术语“恶性t细胞”是指源自t细胞恶性肿瘤的t细胞。术语“t细胞恶性肿瘤”是指源自t细胞前体、成熟t细胞或天然杀伤细胞的广泛、异质的恶性肿瘤分组。t细胞恶性肿瘤的非限制性例子包括t细胞急性淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤(t-all)、t细胞大颗粒淋巴细胞(lgl)白血病、人t细胞白血病病毒1型阳性(htlv-1 )、成人t细胞白血病/淋巴瘤(atl)、t细胞前淋巴细胞性白血病(t-pll)和各种外周t细胞淋巴瘤(ptcl)，包括但不限于血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤(aitl)、alk阳性间变性大细胞淋巴瘤和alk阴性间变性大细胞淋巴瘤。[0361]如本文所用，术语“经修饰的”是指与il-7或il-15具有相同或相似的序列和活性的多肽或蛋白质。如本文所用，“经修饰的il-7”也可以与“突变体il-7”互换使用。如本文所用，“经修饰的il-15”也可以与“突变体il-15”互换使用。[0362]如本文所用的术语“受试者”描述了可以采用根据本发明的组合物进行治疗的生物体，包括哺乳动物，如灵长类动物。可以从所公开的治疗方法受益的哺乳动物物种包括但不限于人；猿；黑猩猩；猩猩；猴；驯养动物，如狗和猫；牲畜，如马、牛、猪、羊。[0363]术语“患者”一般与术语“受试者”同义，并且包括所有哺乳动物，包括人。[0364]除非另有规定，否则术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”可以用作可互换的概念。[0365]如本文所用，术语“信号序列”或等同地“信号肽”是指引导生物活性分子药物和融合蛋白的分泌的片段，并且其在宿主细胞中翻译后被切断。如本文所用的信号序列是编码启动蛋白质运动穿透内质网(er)膜的氨基酸序列的多核苷酸。有用的信号序列包括抗体轻链信号序列，例如抗体14.18(gillies等人,j.immunol.meth.1989.125:191-202)；抗体重链信号序列，例如mopc141，一种抗体重链信号序列(sakano等人,nature,1980.286:676-683)；以及本领域已知的其他信号序列(例如参见，watson等人,nucleicacidresearch,1984.12:5145-5164)。信号肽的特征是本领域中熟知的，并且信号肽通常具有16至30个氨基酸，但它们可以包含更多或更少数量的氨基酸残基。常规信号肽由碱性n末端区、中央疏水区和更极性的c末端区的三个区域组成。[0366]术语“治疗上可接受的”是指这样的物质，其适合于与患者的组织接触而没有过度毒性、刺激和过敏反应，与合理的益处/风险比相称，和/或对其预期用途有效。[0367][0368][0369]本文所用的术语“有效量”是指能够治疗或改善疾病或病症或以其他方式能够产生预期治疗效果的量。[0370]术语“治疗有效的”旨在限制用于治疗疾病或障碍或实现临床终点的活性成分的量。[0371]如本文所述，可以通过单次施用来实现施用治疗有效量的所公开的组合物，例如像单次注射足够量的所公开的白介素、抗cd47抗体或其片段、cd47-il-7融合抗体和/或car-t细胞，以向正在进行这种治疗的患者提供治疗益处。可替代地，在一些情况下，可能需要在相对较短的或相对延长的时间段内提供多次或连续施用，如可由监督施用此类组合物的医学从业者来决定。[0372]如本文所用，术语“部分”是指某种东西被分成或可以被分成的两部分中的每一个，或者大分子的一部分或一份(尤其是较小份额)或独特部分。[0373]如本文所用，术语“转导的”、“转化的”和“转染的”是指使用本领域已知的技术将核酸(例如，载体)引入细胞中。[0374]如本文所用，术语“肿瘤”或“肿瘤组织”是指由过度细胞分裂产生的异常组织块。肿瘤或肿瘤组织包含“肿瘤细胞”，其是具有异常生长特性并且没有有用的身体功能的肿瘤细胞。肿瘤、肿瘤组织和肿瘤细胞可以是良性的或恶性的。肿瘤或肿瘤组织还可以包含“肿瘤相关的非肿瘤细胞”，例如，形成血管以供应肿瘤或肿瘤组织的血管细胞。非肿瘤细胞可以被诱导以通过肿瘤细胞复制和分化，例如，肿瘤或肿瘤组织中的血管生成诱导。[0375]如本文所用，术语“载体”应理解为核酸手段，其包括可被引入宿主细胞中以重组并插入宿主细胞的基因组中或者作为附加体自发复制的核苷酸序列。所述载体可以包括线性核酸、质粒、噬菌体、粘粒、rna载体、病毒载体及其类似物。所述病毒载体的例子可以包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒，但不限于此。实施例[0376]在以下实施例中提供本公开文本的实施方案的示例。以下实施例仅以说明的方式给出，以帮助本领域普通技术人员使用本公开。实施例无意以任何方式另外限制本公开文本的范围。实施例1-il-7构建体的设计[0377]以下实施例的目的是产生并在结构上/在功能上表征人il-7的点突变体。[0378]如下所述，产生了九种il-7突变体(表1)，并测试它们的活性并与野生型(wt)il-7进行比较，二者均是商业来源并在内部产生。[0379]针对il-7/il-7rα晶体结构设计il-7构建体并将其设计为包含c末端标签。il-7野生型或突变体的基因序列是通过genscript自定义合成的，其中ncoi位点在n末端处且在起始密码子之前。在c末端处，在终止密码子和xhoi位点之前添加tev(烟草蚀纹病毒)蛋白酶切割位点enlyfqg和6xhis序列。然后使用标准分子生物学程序通过genscript将所述序列克隆至表达载体pet-28a( )-tev中。使用制造商提供的方案在rosetta2(de3)singles感受态细胞(milliporesigma,71400)中进行转化和小规模表达。该表达系统可以用于产生本文公开的il-7和il-7突变体。[0380]表达il-7突变体s1至s5，并获得从突变体s1和s5纯化的蛋白质。对于il-7突变体s6至s9，在小规模诱导中证实表达，其可以被放大以产生用于蛋白质纯化的材料。在cho细胞中产生il-7商业来源(genscript)的蛋白质。[0381]下表总结了表达的突变体及其在下面列出的测定中的活性。[0382]表1.il-7点突变体总结4x106个细胞/ml(第-1天)，之后进行转染。在转染当天(第0天)，细胞密度达到7×106-1×107个活细胞/ml，并且活力为95％-99％。用预热新鲜expichotm表达培养基将细胞稀释至最终密度为6×106个活细胞/ml，并轻轻地旋转烧瓶以混合细胞。为了制备expifectaminetmcho/质粒dna复合物，将80μl1mg/mlil-7表达质粒添加至1.5ml无菌microfuge管中的4mloptipro培养基中并通过转化混合。将640μlexpifectaminecho试剂添加至另一个无菌microfuge管中的7.36mloptipro培养基中，并通过倒置混合。然后将4ml稀释的expifectaminecho试剂添加至稀释的il-7并通过倒置混合。将expifectaminecho试剂/质粒dna复合物在室温下孵育1-5分钟，然后将2ml复合物缓慢转移至振荡烧瓶中，并且在转移期间轻轻地旋转烧瓶。将烧瓶返回至在具有130rpm振荡速冻的定轨振荡平台上具有≥80％相对湿度和8％co2的37℃培养箱。在转染后第一天(第1天)，将expifectaminetmcho增强剂和expichotm进料立即预混合，并添加至用于标准方案的烧瓶。在此期间轻轻地旋转烧瓶，然后将其返回至在具有130rpm振荡速度的定轨振荡平台上具有≥80％相对湿度和8％co2的37℃培养箱。将细胞培养8-10天，并监测细胞活力，并在蛋白质收获时其大于75％。对于收获，将细胞培养物上清液在冷藏离心机中以4000-5000xg离心30分钟，然后通过0.22μm过滤器过滤上清液。将上清液送去纯化，并通过考马斯蓝染色和蛋白质印迹测定表达。该表达系统可以用于产生本文公开的其他il-7突变体。证明了在expicho表达系统中的il-7表达，但未纯化和测试il-7蛋白。在大肠杆菌系统中产生并纯化本文公开的所有il-7突变体构建体，并在例如pstat、增殖和结合测定中对其进行测试。实施例5-cos7细胞瞬时转染[0387]在转染之前18-24小时将1.0x104个cos7猴肾细胞铺板于96孔板的每个孔中的100μlrpmi1640培养基中，所述培养基含有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100mg/ml链霉素、30mg/ml谷氨酰胺以及50mm2-巯基乙醇(完全培养基)。在转染当天，细胞为约75％汇合度。对于il-7受体α亚基和γ亚基的瞬时共转染，将90ml无血清mem培养基添加至96孔v型底板的孔中。向培养基中添加500ngil-7受体α表达质粒(genscript)和500ngil-7受体γ表达质粒(genscript)并混合。对于6:1的viafect转染试剂(promega#e4981):dna比率，添加6.0μlviafect以得到总共100μl体积并立即混合。在室温下孵育viafect:dna混合物5-20分钟后，以每孔10μlviafect:dna混合物添加至含有100μl生长培养基中的细胞的96孔板中。通过移液将板轻轻地混合并返回至培养箱，持续24-72小时。通过流式细胞术和蛋白质印迹监测共转染效率。实施例6-il-7rα和il-2rγ在cos-7细胞中过表达以用于结合测定[0388]进行转染优化，并通过荧光激活细胞分选(facs)验证转染效率。优化参数包括使用的质粒的量、质粒与转染试剂的比率以及蛋白质表达时间过程。[0389]使用viafect转染试剂(promega#4981)进行优化。转染viafect试剂与dna的比率为6:1。96孔板每孔中五十(50)ngdna用于单一il-7rα、il-2rγ或il-2rβ转染，而(1)12.5ng 12.5ng；(2)25ng 25ng；以及(3)50ng 50ngdna用于il-7rα/il-2rγ或il-2rβ/il-2rγ的共转染实验。在转染后1、2和3天进行facs监测。如图1所示，cos-7细胞中il-7rα和il-2rγ的共表达产生22％至27％双阳性细胞。实施例7-il-7变体的重折叠和纯化[0390]将来自约3l振荡烧瓶培养物的含有his6标记的il-7的冷冻大肠杆菌细胞糊状物解冻并使用组织匀浆器以15-20ml/g细胞沉淀物的比率悬浮于裂解缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0)中。在细胞悬浮之后，从1mmgcl2储备液添加1mmmgcl2，并添加500单位benzonasetm(sigmae1014)。使用avestinc3仪器在15-20,000psi下进行两次细胞裂解。在室温下将裂解物以12,000xg离心30-50min。将上清液倾析并丢弃。用水洗涤细胞碎片和包涵体沉淀物，以从更稠密的包涵体沉淀物去除顶层。[0391]使用组织匀浆器将沉淀物悬浮于150-200ml的6m盐酸胍、20mmtris(ph8.0)、5mmdtt中。向该溶解的蛋白质溶液中添加足以产生1ml沉降床体积的ni 琼脂糖(goldbioh-350)。将蛋白质置于摇摆平台上过夜，以用于与ni 琼脂糖的分批结合。第二天早上，将琼脂糖珠粒以1000xg沉淀15min。丢弃上清液，并将珠粒倒入1.5cm直径的滴柱(pierce#89898)中。使用15-20ml缓冲液用8m尿素、20mmtris(ph8.0)、1mmdtt洗涤珠粒。使用3.5ml8m尿素缓冲液 200mm咪唑(goldbioi-902)从柱洗脱il-7蛋白。洗脱液中的蛋白质浓度通过来自uv吸收光谱的a280使用4.30的e1％来计算。使用总蛋白质的该值，计算可产生0.1mg/mlil-7蛋白浓度的重折叠缓冲液(0.1mtris-hcl、0.5m精氨酸-hcl、2mmedta、0.09mm氧化谷胱甘肽，ph9.0，4℃)体积。将ni 琼脂糖池缓慢添加至快速搅拌的重折叠缓冲液中。将溶液用纸巾覆盖并置于4℃下65-90小时。使用5kd或10kd截断值的旋转浓缩器(vivacell100或amiconultracel)将完成的重折叠反应浓缩至4-9ml。将浓缩的蛋白质以1ml/min施加至在无ca 、mg 的dulbecco’spbs中平衡并运行的superdex75尺寸排阻柱(1.6cmx90cm)。收集2ml的级分。通过uv吸光度检测器鉴定il-7的峰，并通常集中在105ml洗脱体积。将该池浓缩至1-2mg/ml，如由a280吸光度所测定，并在4℃下储存。这些方法可以用于纯化本文公开的其他il-7突变体。实施例8-细胞功能分析[0392]评价il-7突变体的jak1,3/stat5信号传导。特别地，在所研究的细胞系(包括人外周血单个核细胞(pbmc))中评价pstat5磷酸化。另外，在2e8细胞中对il-7进行增殖研究(下文所述)。[0393]用于评价jak1,3/stat5信号传导的方案如下并且如上所述：[0394]将冷冻的pbmc快速解冻并将细胞在测定培养基中稀释至10ml并以125xg离心5分钟。[0395]将测定培养基中的细胞重悬并以135μl/孔铺板于96孔板(每孔约200,000个细胞)v型底板。[0396]将一个或多个细胞板在37℃下放置，同时制备细胞因子。[0397]在冰上，稀释il-7构建体。使用50,000pg/ml的最终il-7稀释液。使用11点曲线，其中稀释度为1:3且不加细胞因子对照。[0398]将15μl细胞因子稀释至细胞。置于振荡器上在37℃培养箱中持续10min。[0399]在10min，通过离心5min使细胞沉淀，共15min。吸出培养基并在75μl冷msd裂解缓冲液中裂解细胞，并在4℃下置于振荡器上持续30分钟。[0400]裂解完成后，根据对于pstat5的mds方案使用未稀释的裂解物进行分析。[0401]测定读数：msd多点测定系统/磷酸-stat5a,b(tyr694)[0402]对照/板，il-7：来自r&dsystems的rhil-7，运行两次2-巯基乙醇和20％胎牛血清)中，其仅使用板的最里面的60个孔并且将其余孔填充200μldbps以降低组织与蒸发有关的边缘效应。然后将il-7以100μl的2倍工作储备液的形式添加(制备为测定培养基中的三倍稀释系列至12点(不包括il-7对照)以给出在0.0006至100ng/ml范围内的最终浓度)。在37℃下孵育72小时后，每孔添加25μlalamar蓝试剂(thermofisher#dal1025)，并使其在37℃下孵育另外20小时。然后使用ljlanalyst测量荧光(530ex/590em)，并使用grafit软件确定ec50。[0407]将内部产生的il-7的结合与商业获得的il-7的结合进行比较。当独立地分析样品时，初始分析不会产生可比较的换算因数。通过具有两个不同kd值的参数来合并来自一个分析的数据。“kd供应商”参数为约4倍高，这表明ril-7的效力实际上是供应商ril-7的活性的4倍。实施例11-tr-fret配体-受体结合测定[0408]通过测量一系列重组il-7和il-7受体-α(il-7rα)浓度下的tr-fret荧光信号来确定il-7结合亲和力。在pbs(ph7.4) 0.05％bsa和0.005％tween-20的缓冲液中，制备160nm连接α6-hisigg的tr-fret接受者(perkinelmer#trf0105-m)、80nm连接链霉亲和素的tr-fret供体(perkinelmer#ad0062)、重组6-his标记的il-7野生型或突变体变体(浓度高达160nm)以及重组生物素标记的il-7rα(acrobiosystems#il-7-h82f8)(浓度高达80nm)的4倍储备液。对于待测试的每种样品，将5μl的α6-hisigg连接的接受者的4倍储备液与5μl的il-7的4倍工作储备液混合。单独地，对于每种样品，将5μl的连接至链霉亲和素的4倍tr-fret供体与5μl的连接至生物素的重组il-7rα的4倍工作储备液混合。将混合物在室温下孵育30分钟，在此期间10μl的α6-his连接的接受者/il-7混合物被分布至384孔浅黑proxiplate(perkinelmer#6008260)中的指示孔中并保持避光。孵育30min后，将10μl的链霉亲和素连接的供体/il-7rα混合物置于含有指定浓度的il-7加接受者的指定孔中。使板立即以750rpm旋转30秒，然后立即置于pherastar读板器(bmglabtech)中以读取tr-fret信号。在接下来的30分钟内连续读取供体信号(337nm激发/620nm发射)和接受者信号(337nm激发/655nm发射)的荧光。通过取接受者信号与供体信号的比率并乘以10,000来确定tr-fret结合信号。将平衡定义为在荧光活性开始衰变之前读数趋于平稳的时间点处。然后，使用绘图程序grafit(erithacussoftware)，将平衡值拟合至在假设单位点结合的情况下的标准平衡方程。下的标准平衡方程。[0409]如图3所示，分析中的“内部”il-7的kd为5.44nm，其与早期分析中所观察到的值(6.6nm)是可比较的。内部il-7活性仅被10倍过量的未标记的il-7(r&dbiosystems)部分地竞争淘汰。然而，供应商活性被完全竞争淘汰。类似于用于测量结合的biolegendsil-7，内部产生的il-7可能比未标记的il-7更有效。[0410]另外，测试il-7突变体s1与il-7rα的结合并与wt进行比较。wt和il-7突变体s1的kd值分别为20.2nm和34.8nm(图4)。s1突变体显现出对受体具有较低的亲和力，并且拟合看起来不干净。值得注意的是，该分析是在仅呈现α受体的情况下进行的。为了观察是否存在对受体γ的影响，需要使用该受体链进行分析。在20倍过量的未标记的il-7的情况下未观察到完全竞争。实施例12-在具有和不具有受体γ的情况下il-7与il-7rα的结合，[0411]将内部制备的ril-7的结合与商业获得的il-7的结合进行比较。比较了两组条件：(1)具有( )20nm受体γ，(2)不具有(-)受体γ。如图5所示，在γ受体的存在下观察到表观亲和力的5倍增加。在不具有γ受体的情况下测量的kd为12.13nm，其高于先前的分析(6nm)。预期在存在γ受体的情况下亲和力增加。用于拟合数据的模型假设了更简化的结合模型，其中γ和β充当一个组合单元。[0412]表3和图5提供了il-7受体结合效率的总结。表3.il-7受体结合效率[0413]在本技术中引用的美国或外国的所有参考文献、专利或申请均通过引用特此并入，如同将其整体写入本文。在出现任何不一致的情况下，以本文照字面意思公开的材料为准。[0414]根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用途和条件。实施例13-il-15构建体的设计[0415]以下实施例的目的是产生并在结构上/在功能上表征人il-15的点突变体。[0416]如下所述，产生了十五种il-15突变体(表4)，并测试它们的活性并与野生型(wt)il-15进行比较，二者均是商业来源并在内部产生。[0417]针对il-15/il-15rα/il-15rβ/γc晶体结构设计il-15构建体并将其设计为具有n末端标签。il-15野生型或突变体的基因序列是通过genscript自定义合成的，其中在n末端处具有ndei位点且在c末端处具有xhoi位点。然后使用标准分子生物学程序通过genscript将所述序列克隆至表达载体pet-28a( )-tev中，因此il-15具有6xhis标签和n末端tev蛋白酶切割位点。使用制造商提供的方案在oneshottmbl21startm(de3)化学感受态大肠杆菌(thermofisherscientific,c601003)中进行转化和小规模表达。该表达系统可以用于产生本文公开的il-15和il-15突变体。[0418]突变体在il-15rβ和/或γc界面处，因为il-15rα亲和力已经非常高。对于突变m3和m4分别发现低回收至无回收，但其他突变体在0.65-3.1mg范围内纯化并回收。[0419]下表总结了表达的突变体及其在下面列出的测定中的活性。[0420]表4.il-15点突变体总结1受体结合数据来自tr-fret测定。实施例14-在大肠杆菌中产生il-15突变体[0421]鉴定了十五种il-15突变体并选择其用于合成。[0422]对于il-15突变体m6至m15，与200μlbugbuster主混合物缓冲液以及用于裂解后不溶性部分的35μllds样品缓冲液和5μl还原剂一起使用，在使用来自1ml由iptg诱导的培养物的沉淀物的小规模培养物中证明在大肠杆菌中的il-15表达。然后在使用来自1ml由iptg诱导的培养物的沉淀物的放大培养中使用用于裂解的200μlbugbuster主混合物缓冲液以及用于裂解后不溶性部分的45μllds样品缓冲液和5μl还原剂测试il-15突变体的表达。实施例15-预优化的放大il-15表达[0423]从新转化的板将单个大肠杆菌菌落接种至具有适当的抗生素的100mltb(terrificbroth)中，并将培养物置于250rpm和37℃下的振荡培养箱中过夜。第二天早上，将培养物添加至在4l烧瓶中的900ml新鲜tb中，并在37℃下生长直至600nm处的吸光度(a600)达到0.6-0.8。然后添加iptg(异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.5mm，并将其继续孵育3-5h。通过在4℃下以9,000xg离心10min收获细胞。将上清液丢弃，并在纯化之前将沉淀物在-80℃下保持。该表达系统可以用于产生本文公开的其他il-15突变体。实施例16-人il-15的expicho表达[0424]使用expicho表达系统试剂盒(thermofisher#a29133)表达人il-15蛋白(il-15wt(内部his6))。将一小瓶的expicho-s细胞解冻并添加至含有30ml预热expicho表达培养基的125ml通气盖振荡烧瓶中。将细胞在具有130rpm(振荡直径为19mm)振荡速度的定轨振荡器平台上在具有≥80％相对湿度和8％co2的37℃培养箱中孵育3天。监测细胞密度和活力，并在第3天或第4天它们达到4x106-6x106个活细胞/ml时，将细胞传代培养。在传代培养3次后，细胞被分成3x106-4x106个细胞/ml(第-1天)，之后进行转染。在转染当天(第0天)，细胞密度达到7×106-1×107个活细胞/ml，并且活力为95％-99％。用预热新鲜expichotm表达培养基将细胞稀释至最终密度为6×106个活细胞/ml，并轻轻地旋转烧瓶以混合细胞。为了制备expifectaminetmcho/质粒dna复合物，将80μl1mg/mlil-15表达质粒(genscript，pcdna3.4topo载体)添加至1.5ml无菌microfuge管中的4mloptipro培养基中并通过转化混合。将640μlexpifectaminecho试剂添加至另一个无菌microfuge管中的7.36mloptipro培养基中，并通过倒置混合。然后将4ml稀释的expifectaminecho试剂添加至稀释的il-15并通过倒置混合。将expifectaminecho试剂/质粒dna复合物在室温下孵育1-5分钟，然后将2ml复合物缓慢转移至振荡烧瓶中，并且在转移期间轻轻地旋转烧瓶。将烧瓶返回至在具有130rpm振荡速冻的定轨振荡平台上具有≥80％相对湿度和8％co2的37℃培养箱。在转染后第一天(第1天)，将expifectaminetmcho增强剂和expichotm进料立即预混合，并添加至用于标准方案的烧瓶。在此期间轻轻地旋转烧瓶，然后将其返回至在具有130rpm振荡速度的定轨振荡平台上具有≥80％相对湿度和8％co2的37℃培养箱。将细胞培养8-10天，并监测细胞活力，并在蛋白质收获时其大于75％。对于收获，将细胞培养物上清液在冷藏离心机中以4000-5000xg离心30分钟，然后通过0.22μm过滤器过滤上清液。将上清液送去纯化，并通过考马斯蓝染色和蛋白质印迹测定表达。证明了在expicho表达系统中的il-15表达，但未纯化和测试il-15蛋白。在大肠杆菌系统中产生并纯化本文公开的所有il-15突变体构建体，并在例如pstat、增殖和结合测定中对其进行测试。实施例17-在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中产生il-15[0425]当合成某些蛋白质时，糖基化和正确的二硫键形成对于配偶体构建体可能是重要的，其还需要在哺乳动物表达系统(cho)中表达所鉴定的突变体。使用expichotm表达系统(thermofisher)在cho中进行突变体蛋白的评价。转染的样品包含wtil-15(genscript)和expichotm表达系统提供的对照(表达抗体的阳性对照载体)。[0426]为此所选择的方案是使用所选择的表达系统的标准方案，其需要每种细胞因子在三个单独的烧瓶中培养。还包括另外的抗体对照，总共7个样品。在250ml烧瓶中的约35ml体积中进行测定，持续10天，其中在第8、9和10天收获。[0427]为了收获蛋白质进行分析，将样品在4℃下以4000rpm离心30分钟。过滤上清液并在4℃下储存，并丢弃沉淀物。[0428]选择用于合成的样品包括在第8天收获的wtil-15(genscript)；在第9天收获的wtil-15(genscript)；以及在第10天收获的wtil-15(genscript)。还对来自第8天的样品以及 抗体对照进行蛋白质印迹分析。确认了对于在expichotm培养基中的样品的良好il-7表达；在第8天收获的培养物展现出较亮的条带，因此在cho细胞中表达更多。还确认了il-15的表达，但il-15条带强度低且尺寸大于预期。该表达系统和分析方案可以用于产生本文公开的其他il-15突变体。实施例18-cos-7细胞瞬时转染[0429]在转染之前18-24小时将1.0x104个cos7猴肾细胞铺板于96孔板的每个孔中的100μlrpmi1640培养基中，所述培养基含有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100mg/ml链霉素、30mg/ml谷氨酰胺以及50mm2-巯基乙醇(完全培养基)。在转染当天，细胞为约75％汇合度。对于il-15受体β亚基和γ亚基的瞬时共转染，将90ml无血清mem培养基添加至96孔v型底板的孔中。向培养基中添加500ngil-15受体β表达质粒(genscript)和500ngil-15受体γ表达质粒(genscript)并混合。对于6:1的viafect转染试剂(promega#e4981):dna比率，添加6.0μlviafect以得到总共100μl体积并立即混合。在室温下孵育viafect:dna混合物5-20分钟后，以每孔10μlviafect:dna混合物添加至含有100μl生长培养基中的细胞的96孔板中。通过移液将板轻轻地混合并返回至培养箱，持续24-72小时。通过流式细胞术和蛋白质印迹监测共转染效率。实施例19-il-rα和il-2rγ在cos-7细胞中过表达以用于结合测定[0430]进行转染优化，并通过荧光激活细胞分选(facs)验证转染效率。优化参数包括使用的质粒的量、质粒与转染试剂的比率以及蛋白质表达时间过程。[0431]使用viafect转染试剂(promega#4981)进行优化。转染viafect试剂与dna的比率为6:1。96孔板每孔中五十(50)ngdna用于单一il-7rα、il-2rγ或il-2rβ转染，而(1)12.5ng 12.5ng；(2)25ng 25ng；以及(3)50ng 50ngdna用于il-7rα/il-2rγ或il-2rβ/il-2rγ的共转染实验。在转染后1、2和3天进行facs监测。如图6所示，cos-7细胞中il-7rα和il-2rγ的共表达产生22％至27％双阳性细胞。实施例20-il-15变体的重折叠和纯化[0432]将来自约3l振荡烧瓶培养物的含有his6标记的il-15的冷冻大肠杆菌细胞糊状物解冻并使用组织匀浆器以15-20ml/g细胞沉淀物的比率悬浮于裂解缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0)中。在细胞悬浮之后，从1mmgcl2储备液添加1mmmgcl2，并添加500单位benzonasetm(sigmae1014)。使用avestinc3仪器在15-20,000psi下进行两次细胞裂解。在室温下将裂解物以12,000xg离心30-50min。将上清液倾析并丢弃。用水洗涤细胞碎片和包涵体沉淀物，以从更稠密的包涵体沉淀物去除顶层。[0433]使用组织匀浆器将沉淀物悬浮于150-200ml的6m盐酸胍、20mmtris(ph8.0)、5mmdtt中。向该溶解的蛋白质溶液中添加足以产生1ml沉降床体积的ni 琼脂糖(goldbioh-350)。将蛋白质置于摇摆平台上过夜，以用于与ni 琼脂糖的分批结合。第二天早上，将琼脂糖珠粒以1000xg沉淀15min。丢弃上清液，并将珠粒倒入1.5cm直径的滴柱(pierce#89898)中。使用15-20ml缓冲液用8m尿素、20mmtris(ph8.0)、1mmdtt洗涤珠粒。使用3.5ml8m尿素缓冲液 200mm咪唑(goldbioi-902)从柱洗脱il-15蛋白。洗脱液中的蛋白质浓度通过来自uv吸收光谱的a280使用5.77的e1％来计算。使用总蛋白质的该值，计算可产生0.1mg/mlil-15蛋白浓度的重折叠缓冲液(0.1mtris-hcl、0.5m甘氨酸、1mm氧化谷胱甘肽、10mm还原谷胱甘肽，ph8.0，4℃)体积。将ni 琼脂糖池缓慢添加至快速搅拌的重折叠缓冲液中。将溶液用纸巾覆盖并置于4℃下65-90小时。使用5kd或10kd截断值的旋转浓缩器(vivacell100或amiconultracel)将完成的重折叠反应浓缩至4-9ml。将浓缩的蛋白质以1ml/min施加至在无ca 、mg 的dulbecco’spbs中平衡并运行的superdex75尺寸排阻柱(1.6cmx90cm)。收集2ml的级分。通过uv吸光度检测器鉴定il-15的峰，并通常集中在105ml洗脱体积。将该池浓缩至1-2mg/ml，如由a280吸光度所测定，并在4℃下储存。这些方法可以用于纯化本文公开的其他il-15突变体。实施例21-il-15的活性及其在人外周血单个核细胞(pbmc)pstat5(tyr694)测定中的突变体[0434]将人外周血单个核细胞(内部产生的)以175,000个细胞/孔铺板于v型底96孔板中的135μl培养基(具有10％热灭活血清和47μm2-巯基乙醇和10μmhepes的rpmi1640)中。将细胞板置于37℃培养箱中，同时制作细胞因子曲线。使用先前描述的冷rpmi培养基在96孔板中系列稀释细胞因子。il-15(或突变体)样品从100,000pg/ml开始稀释，1:3稀释，11pt.加无细胞因子(未刺激)。在37℃下振荡的同时使用每孔15μl的稀释细胞因子对hpbmc进行刺激，持续10min。称为“未刺激的”的孔仅接受15μl培养基。将板立即用板密封件密封，并将细胞以400xg沉淀5分钟。使用多通道抽吸器从孔去除培养基。立即将75μl冷msd制备的裂解缓冲液添加至孔中。将板置于4℃下振荡至少30min。使msd试剂盒方向(目录号k150igd)进行pstat5检测。数据示于表4。实施例22-细胞功能分析[0435]评价il-15突变体的jak1,3/stat5信号传导。特别地，在所研究的细胞系(包括人外周血单个核细胞(pbmc))中评价pstat5磷酸化。[0436]用于评价jak1,3/stat5信号传导的方案如下并且如上所述：1.将冷冻的pbmc快速解冻并将细胞在测定培养基中稀释至10ml并以125xg离心5分钟。2.将测定培养基中的细胞重悬并以135μl/孔铺板于96孔板(每孔约200,000个细胞)v型底板。3.将一个或多个细胞板在37℃下放置，同时制备细胞因子。4.在冰上，稀释il-15构建体。使用100,000pg/ml的最终il-15稀释液。使用11点曲线，其中稀释度为1:3且不加细胞因子对照。5.将15μl细胞因子稀释至细胞。置于振荡器上在37℃培养箱中持续10min。6.在10min，通过离心5min使细胞沉淀，共15min。吸出培养基并在75μl冷msd裂解缓冲液中裂解细胞，并在4℃下置于振荡器上持续30分钟。7.裂解完成后，根据对于pstat5的mds方案使用未稀释的裂解物进行分析。8.测定读数：msd多点测定系统/磷酸-stat5a,b(tyr694)9.对照/板，il-15：来自r&dsystems的rhil-15，运行两次内部rhil-15wt，运行两次[0437]使用上述方案生成的数据的总结提供于表4和图7。wtil-15sec纯化的级分6显示了在人pbmc中pstat5测定中的活性，如图8中所示。另外，对于m2(n72r)和m5(n79s)的细胞因子活性的示例曲线分别提供于图9和图10以及下面的表5。从商业来源获得的野生型il-15以及在大肠杆菌中内部产生的il-15野生型和各种点突变体全部以浓度方式诱导stat5磷酸化，作为途径激活的读数，其中ec50值的范围为76-836pg/ml。[0438]表5.il-15信号传导数据*未his标记的实施例23-细胞增殖测定[0439]测试了两种不同的试剂(cck-8和alamar蓝)以确定测定响应于il-15刺激的鼠2e8细胞增殖的最佳条件。基于两种测定的敏感性，选择alamar蓝试剂进一步在m-07e细胞中开发测定。下面描述了响应于重组人il-15的m-07e细胞的增殖。[0440]用于在m-07e细胞中针对12点il-15剂量响应(比较了鼠il-15(mil-15)与人il-15(hil-15))的alamar蓝增殖测定的细胞增殖方案如下并在下文进一步描述：5.用适当的培养基(例如，dpbs)将m-07e细胞洗涤3次并以1x105个细胞/ml接种在96孔板中的100μl不含il-15的培养基中。仅使用了最里面的60孔；外部孔填充了200μldpbs以最小化边缘效应。6.一式两份地添加100μlmil-15或hil-15以得到0.0006至100ng/ml的浓度范围。7.孵育72小时后，添加25μl/孔的alamar蓝溶液，并在37℃下孵育板。8.20小时后读取荧光(530ex/590em)。实施例24-响应于重组人il-15的m-07e细胞增殖[0441]使用m-07e人急性巨核细胞白血病细胞在增殖测定中测量重组人il-15的活性。使m-07e细胞(dsmz目录号acc104)在rpmi1640加补充有青霉素/链霉素/谷氨酰胺(p/s/g)和10ng/ml下的重组人gm-csf(r&dsystems目录号215-gm-010)的10％热灭活fbs中生长并传代培养。对于增殖测定，将细胞以150xg离心5分钟以去除含有gm-csf的生长培养基。将细胞在含有rpmi1640加10％热灭活fbs和p/s/g(测定培养基)的培养基中洗涤三次，然后在测定培养基中饥饿4小时。在四个小时结束时，将细胞以45,000个细胞/孔铺板于96孔平底板中的150μl测定培养基中，并将重组人il-15(野生型或多种突变体)作为50μl的4倍工作储备溶液添加在测定培养基中。然后将细胞置于37℃、5％co2培养箱中，持续72小时。在72小时结束时，将细胞以400xg离心5分钟并去除100μl培养基。在100μl试剂(promega目录号g7570)中裂解细胞，持续5分钟。然后使板在室温下孵育5-10分钟以稳定发光信号。将50μl裂解物转移至具有不透明壁的96孔板以使用读板器记录发光。数据示于表4。实施例25-il-15tr-fret配体-受体结合测定[0442]通过测量一系列重组il-15和il-2受体-β(il-2rβ)浓度下的tr-fret荧光信号来确定il-15结合亲和力。在pbs(ph7.4) 0.05％bsa和0.005％tween-20的缓冲液中，制备200nm连接α6-hisigg的tr-fret接受者(perkinelmer#trf0105-m)、100nm连接α-人igg的tr-fret供体(perkinelmer#ad0074)、重组6-his标记的il-15野生型或突变体变体(浓度高达200nm)以及重组fc标记的il-2rβ(sinobiologicals#10696-h02h)(浓度高达100nm)的5倍储备液。对于待测试的每种样品，将4μl的α6-hisigg连接的接受者的5倍储备液与4μl的il-15的5倍工作储备液混合。单独地，对于每种样品，将4μl的连接至α-人igg的5倍tr-fret供体与4μl的连接至fc结构域的重组il-2rβ的5倍工作储备液混合。将混合物在室温下孵育30分钟。在孵育期间，制备3μg/mlfc嵌段(bdpharmingen#564220)的5倍储备液。在孵育30分钟后，将4μl5倍fc嵌段添加至il-2rβ/α-人igg的每个样品中，并在室温下孵育另外15分钟。在孵育期间，8μlα6-his连接的接受者/il-15混合物被分布至384孔浅黑proxiplate(perkinelmer#6008260)中的指示孔中。在孵育15min后，将12μlα-人igg连接的供体/il-2rβ/fc嵌段混合物置于含有适当浓度的il-15加接受者的指定孔中。使板立即以750rpm旋转30秒，然后立即置于pherastar读板器(bmglabtech)中以读取tr-fret信号。在接下来的30分钟内连续读取供体信号(337nm激发/620nm发射)和接受者信号(337nm激发/655nm发射)的荧光。通过取接受者信号与供体信号的比率并乘以10,000来确定tr-fret结合信号。将平衡定义为在荧光活性开始衰变之前读数趋于平稳的时间点处。然后，使用绘图程序grafit(erithacussoftware)，将平衡值拟合至在假设单位点结合的情况下的标准平衡方程。[0443]使用tr-fret(上文所述)评价突变体il-15蛋白与il-15rβ的结合。在同一测定中对商业获得的il-15和内部il-15的直接比较表明，从商业来源(sinobiologicals；供应商il-15)获得的重组il-15与内部产生的重组il-15具有相同的活性。如图11所示，“换算因数”显示了测定测量值(tr-fret比率)与配体:受体复合物浓度之间的线性关系。在该实验中，在独立分析时，两个样品组具有近似相同的换算因数。结合活性的最直接的量度是kd，并且这两个样品显示kd值在彼此的20％内(10.3nm与12.4nm)。还注意到，活性被12.5倍过量的未标记il-15竞争淘汰。[0444]测试il-15突变体m2(n72r)和m5(n72s)与il-2rβ的结合并与wt进行比较。wtkd被确定为0.95nm，而突变体m2和m5的kd值分别为31.36nm和2.63nm(图12)。这些数据表明，突变体m5具有与wtil-15相同的亲和力，而突变体m2比wt弱约3倍。值得注意的是，无法分辨较弱的结合亲和力或较不稳定的蛋白质之间的差异。值得注意的是，这是在仅呈现β受体的情况下进行的。[0445]m5突变体(n79s)旨在是完全无害阳性对照。n79s突变去除了糖基化位点，因此大肠杆菌能够产生与cho中产生的蛋白质相同的蛋白质，因为细胞因子糖基化不影响所得蛋白的活性。m5显现出与wt构建体大致均等，从而支持了设计假设。糖基化可以用于增加分子量(mw)以减少排泄，但在该区域需要另外的研究。[0446]虽然预测表明m2(n72r)突变体与wt应该是可比较的，但该突变体被报告为约1％wt活性。n72r突变显现出与wt构建体近似均等。然而，测试突变体的运行没有显示完整的曲线，特别是在顶部。n72r突变体显现出在最高剂量下给出完全反应(较小的活性，与部分激动剂形成对照)。报告的突变体是融合构建体，与此处不同。[0447]测试的其他三种突变体(n72y、n79e)展现出与ni柱结合不佳且回收不佳，虽然表达看起来很好。n72d突变体是altorbioscience“超兴奋剂”mutation(zhu等人,jimmunol183:3598-3607,2009；liu等人,jbiolchem291:23869-91,2016)。实施例26-在具有和不具有受体γ的情况下il-15与il-15rβ结合[0448]为了观察是否存在对受体γ的影响，使用内部制备的ril-15比较两组条件。所测试的两种条件是：(1)具有( )20nm受体γ，(2)不具有(-)受体γ。如图13所示，在γ受体的存在下观察到表观亲和力的8倍增加。在不具有γ受体的情况下测量的kd为28.5nm，其高于先前的分析(10nm)。预期在存在γ受体的情况下亲和力增加。对数据的拟合不是所期望的那么强，并且需要进一步的研究来验证这些结果。最高受体浓度下的拟合显现出不如较低浓度下的拟合那么稳健。用于拟合数据的模型假设了更简化的结合模型，其中γ和β充当一个组合单元。[0449]表6提供了il-15受体结合效率的总结。[0450]表6.il-15受体结合效率实施例27-il-15-125i标记的受体-配体结合测定[0451]通过定量未标记的重组il-15(wt或突变体)与125i标记的il-15竞争结合含有il-2rβ受体的膜提取物的能力来测定il-15结合。从细胞系m-07e(dsmz#acc104)获得膜提取物，所述细胞系已生长至在1.0x106与1.5106个细胞/ml之间的密度。旋转沉淀约7.5x106个总细胞以使用mem-pertmplus蛋白提取试剂盒(thermofisherscientific#89842)进行提取。使用piercetmbca蛋白质测定试剂盒(thermofisherscientific#23225)测定总蛋白质浓度。对于待测试的每个孔，将1.5μgm-07e膜提取物与0.25mgwgepvtspa珠粒(perkinelmer#rpnq0001)一起在20μlx#实验孔(过量体积是pbsph7.4 0.1％bsa)的最终体积中在4℃下孵育4小时，过夜。孵育后，用1mlpbs/bsa将膜结合的珠粒洗涤2次，并重悬于#实验孔x50μlpbs/bsa的最终体积中。向96孔白色optiplates(perkinelmer#6005290)中添加在4倍指定的浓度下的25μl在pbs/bsa中的未标记的il-15至板上的指定孔中。然后向每个孔中添加在4倍浓度3.6nm(5nci/μl)下的25μl125i标记的il-15(对于il-15-sinobiological#10360-h07e；对于125i标记—perkinelmer#cusreag1)。为了启动结合，将50μl与膜结合的珠粒添加至每个孔中，然后通过移液混合。在室温下孵育2小时后，将板以750rpm旋转5min。然后用topcount闪烁计数器(hewlattpackard)测量125i标记的il-15的结合。通过以下方式确定结合亲和力：使用曲线拟合作图程序grafit(erithacussoftware)利用4参数ic50曲线拟合方程来确定il-15重组蛋白变体的ic50值。[0452]前述方案及其变体可以用于评估il-15及其突变体的竞争受体结合。预期一些il-15突变体与受体结合的亲和力将等于或大于野生型。[0453]图14显示了m-07e膜提取物的蛋白质印迹。m-07e是响应于il-15的细胞系。该细胞系是用于125i标记的il-15结合的良好受体来源。测试受体的β和γ亚基二者，并再现了相同的印迹。如图所示，在两个图像上观察到预期尺寸的重组条带。α-γ抗体的图像显现出没有显示任何条带，而α-β探针在预期的mw处显示出模糊的条带。最低重组蛋白条带表示50fmol的蛋白质。使用125i，应当可检测到低至200fmol/mg。10倍低于受体蛋白质泳道中的模糊条带应仍表示1000fmol/mg。尽管受体浓度低，但它们可能足以在测定中检测125i结合。[0454]实施例28-公开的氨基酸序列[0455]表7.氨基酸序列实施例30-抗cd47融合蛋白[0456]本文公开的融合多肽包含分别与人κ或任何人fcigg恒定结构域组合的人重链可变结构域和轻链可变结构域。轻或重抗体链的c或n末端的甘氨酸-丝氨酸接头(g4s)n被设计为将il-7(野生型或突变体)与抗体多肽连接。这些融合构建体将被设计为掺入分泌信号并被克隆至哺乳动物表达系统中，并且将其转染至cho细胞中以产生抗体融合蛋白。所述蛋白质变体被表达、分泌至培养基中，并使用蛋白质a树脂纯化。[0457]一些抗cd47融合蛋白包含第一重多肽链和第二轻多肽链，所述第一多肽链包含：第一结构域，其含有免疫球蛋白的重链可变结构域(vh)的结合区、重链的恒定区(ch)、以及(ii)与重链的恒定区(ch)的c末端融合的经修饰的/突变体il-7或经修饰的/突变体il-15序列；并且第二多肽链包含：免疫球蛋白的轻链可变结构域(vl)的结合区以及(ii)轻链的恒定区(cl)。[0458]一些抗cd47融合蛋白包含第一重多肽链和第二轻多肽链，所述第一多肽链包含：第一结构域，其含有免疫球蛋白的重链可变结构域(vh)的结合区和重链的恒定区(ch)；并且第二多肽链包含：免疫球蛋白的轻链可变结构域(vl)的结合区、轻链的恒定区(cl)以及与轻链的恒定区(cl)的c末端融合的经修饰的/突变体il-7或经修饰的/突变体il-15序列。[0459]一些抗cd47融合蛋白包含第一重多肽链和第二轻多肽链，所述第一多肽链包含：第一结构域，其含有免疫球蛋白的重链可变结构域(vh)的结合区和重链的恒定区(ch)；并且第二多肽包含：与轻链可变区的结合区的n末端融合的经修饰的/突变体il-7或经修饰的/突变体il-15序列以及轻链的恒定区(cl)。[0460]一些抗cd47融合蛋白包含第一重多肽链和第二轻多肽链，所述第一多肽链包含：与免疫球蛋白的重链可变结构域(vh)的结合区的n末端融合的经修饰的/突变体il-7或经修饰的/突变体il-15序列以及重链的恒定区(ch)；并且第二多肽包含：免疫球蛋白的轻链可变结构域(vl)的结合区以及轻链的恒定区(cl)。[0461]在一个实施方案中，所述经修饰的/突变体il-7序列和抗cd47融合蛋白的vh或ch结构域可以通过具有ggggs重复序列的短接头隔开，其中所述短接头可以表示为(ggggs)n，其中n具有以下值：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。所述接头需要足够的长度以最小化每个结合结构域之间的空间位阻。在一些实施方案中，所述接头是甘氨酸和/或丝氨酸。[0462]在另一个实施方案中，所述经修饰的/突变体il-15序列和抗cd47融合蛋白的vh或ch结构域可以通过具有ggggs重复序列的短接头隔开，其中所述短接头可以表示为(ggggs)n，其中n具有以下值：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。所述接头需要足够的长度以最小化每个结合结构域之间的空间位阻。在一些实施方案中，所述接头是甘氨酸和/或丝氨酸。[0463]可以使用本文所述且本领域已知的非限制性方法采用表7中公开的经修饰的/突变体il-7或经修饰的/突变体il-15序列来构建包含第一重链融合多肽和第二轻链融合多肽的抗cd47融合蛋白。实施例31-抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白与重组人cd47结合[0464]将在体外测量抗cd47-il-7融合蛋白、抗cd47-il-15融合蛋白和抗cd47mab与细胞上表达的人cd47的结合。对于与重组cd47的体外结合，将his-cd47(acrobiosystems)在4℃下吸附至高结合微量滴定板过夜。将孔洗涤、封闭，并将渐增浓度的抗cd47-il-7融合蛋白、抗cd47-il-15融合蛋白、抗cd47抗体(对照)或对照igg抗体(对照)添加至孔中，持续1小时。将孔洗涤，然后与hrp标记的二抗一起孵育1小时，然后洗涤，并通过添加过氧化物酶底物显影。预期抗cd47-il-7融合蛋白将以浓度依赖性方式与his-cd47结合，且其亲和力与抗cd47抗体(对照)相似。预期阴性对照igg抗体不与his-cd47结合。预期与表7中公开的用经修饰的/突变体il-15构建的抗cd47-il-15融合蛋白将以浓度依赖性方式与his-cd47结合，其亲和力与抗cd47抗体以及在实施例30中描述的抗cd47-il-7融合蛋白相似。实施例32-抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白在t细胞中激活stat5磷酸化为了评估抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白在体外pbmc来源的t细胞中对pstat5活性的影响，将采用以下使用流式细胞术的方法。将通过人外周血的白细胞单采术获得人pbmc，并将其在具有10％胎牛血清(biowest；目录号s01520)和青霉素/链霉素(corning，目录号30-001-ci)的rpmi(corning,catalog#10-104-cv)中在组织培养级烧瓶中在37℃下孵育过夜。对于体外pstat5刺激测定，将每200μlrpmi培养基中的1-3x105个pbmc铺板于96孔经组织培养物处理的板中的每个孔中。将融合蛋白的11倍连续稀释系列(0.04-30μg/ml)添加至pbmc培养物中，并在37℃下孵育15分钟。将细胞用冰冷的pbs洗涤一次，然后用固定缓冲液1(bdphosflow，目录号557870)固定。用染色缓冲液(pbs 1％fbs)将pbmc洗涤两次，并用perm缓冲液iii(bdphosflow，目录号558050)透化处理。用染色缓冲液将细胞洗涤两次，用亮蓝515缀合的抗人cd3抗体(bdbiosciences，目录号564465)和抗pstat5-pe(bdbiosciences，目录号562077)染色，并使用attunenxt流式细胞仪(lifetechnologies)通过流式细胞术分析对于pstat5呈阳性的cd3阳性t细胞的百分比。预期抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白将以浓度依赖性方式增加在t细胞中的stat5磷酸化。预期用经修饰的/突变体il-7构建的抗cd47-il-7融合蛋白、用如表7中公开的经修饰的/突变体il-15构建的抗cd47-il-15融合蛋白、抗cd47mab与il-7、il-15或其经修饰的/突变体变体的组合将以浓度依赖性方式增加在t细胞中的stat5磷酸化。实施例33-通过抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白反式激活人t细胞中的pstat5为了评估在与肿瘤细胞结合后抗cd47-il-7和cd47-il-15融合蛋白在体外pbmc来源的t细胞中对pstat5活性的能力，将采用以下使用流式细胞术的方法。将过表达人cd47的ov10-315卵巢肿瘤细胞接种于96孔板中过夜。将通过人外周血的白细胞单采术获得人pbmc，并将其在具有10％胎牛血清(biowest；目录号s01520)和青霉素/链霉素(corning，目录号30-001-ci)的rpmi(corning，目录号10-104-cv)中在组织培养级烧瓶中在37℃下孵育过夜。将渐增浓度的抗cd47-il-7或抗cd47-il15融合蛋白与ov10-315细胞一起孵育1小时。将用含有1％fbs的pbs洗涤六次以去除所有未结合的蛋白质后，将每200μlrpmi培养基中的1-3x105个pbmc铺板于每个孔中并在37℃下孵育15分钟。将细胞用冰冷的pbs洗涤一次，然后用固定缓冲液1(bdphosflow，目录号557870)固定。用染色缓冲液(pbs 1％fbs)将pbmc洗涤两次，并用perm缓冲液iii(bdphosflow，目录号558050)透化处理。用染色缓冲液将细胞洗涤两次，用亮蓝515缀合的抗人cd3抗体(bdbiosciences，目录号564465)和抗pstat5-pe(bdbiosciences，目录号562077)染色，并使用attunenxt流式细胞仪(lifetechnologies)通过流式细胞术分析对于pstat5呈阳性的cd3阳性t细胞的百分比。预期融合蛋白将在与cd47表达肿瘤细胞结合之后以浓度依赖性方式增加t细胞中的stat5磷酸化。预期用分别如表7中公开的经修饰的/突变体il-7或经修饰的/突变体il-15构建的抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白以及抗cd47mab与il-7、il-15或其经修饰的/突变体变体的组合将在与肿瘤细胞结合后以浓度依赖性方式增加t细胞中的stat5磷酸化。实施例34-抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白有助于t细胞的存活为了评估抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白在体外对pbmc来源的t细胞存活的影响，将采用以下使用流式细胞术的方法。将通过人外周血的白细胞单采术获得人pbmc，并将其在具有10％胎牛血清(biowest；目录号s01520)和青霉素/链霉素(corning，目录号30-001-ci)的rpmi(corning,catalog#10-104-cv)中在组织培养级烧瓶中在37℃下孵育过夜。对于体外增殖测定，将每200μlrpmi培养基中的1x105个pbmc铺板于96孔经组织培养物处理的板中的每个孔中。将抗cd47-il-7或抗cd47-il-15融合蛋白的11倍连续稀释系列(0.04-30μg/ml)添加至pbmc培养物中，并在37℃下孵育4天。在培养完成之前将细胞与5-乙炔基-2-脱氧尿苷(edu，invitrogen，目录号c10634)一起孵育24小时。将使用alexafluor647皮考基叠氮化物试剂检测edu，用亮蓝515缀合的抗hcd3抗体(bdbiosciences，目录号564465)染色，并使用attunenxt流式细胞仪(lifetechnologies)通过流式细胞术分析。预期抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白将促成细胞核(其中dna已经在edu孵育期间合成)中的荧光信号积累，这表明存活和增殖的增加。预期用分别如表7中公开的经修饰的/突变体il-7或经修饰的/突变体il-15构建的抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白以及抗cd47mab与il-7、il-15或其经修饰的/突变体变体的组合将促成细胞核(其中dna已经在edu孵育期间合成)中的荧光信号积累，这表明存活和增殖的增加。实施例35-抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白的反式激活有助于t细胞的存活为了评估抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白在与肿瘤细胞结合后对在体外pbmc来源的t细胞存活的能力，将采用以下使用流式细胞术的方法。将过表达人cd47的经辐照或化学处理的ov10-315卵巢肿瘤细胞接种于96孔板中过夜。将通过人外周血的白细胞单采术获得人pbmc，并将其在具有10％胎牛血清(biowest；目录号s01520)和青霉素/链霉素(corning，目录号30-001-ci)的rpmi(corning，目录号10-104-cv)中在组织培养级烧瓶中在37℃下孵育过夜。将渐增浓度的抗cd47-il-7或抗cd47-il-15融合蛋白与ov10-315细胞一起孵育1小时。将用含有1％fbs的pbs洗涤六次以去除所有未结合的蛋白质后，将每200μlrpmi培养基中的1x105个pbmc铺板于每个孔中并在37℃下孵育4天。在培养完成之前将细胞与edu(invitrogen，目录号c10634)一起孵育24小时。使用alexafluor647皮考基叠氮化物试剂检测edu，用亮蓝515缀合的抗人cd3抗体(bdbiosciences，目录号564465)染色，并使用attunenxt流式细胞仪(lifetechnologies)通过流式细胞术分析。预期抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白将促成细胞核(其中dna已经在edu孵育期间合成)中的荧光信号积累，这表明存活和增殖的增加。预期用分别如表7中公开的经修饰的/突变体il-7或经修饰的/突变体il-15构建的抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白以及抗cd47mab与il-7、il-15或其经修饰的/突变体变体的组合将促成细胞核(其中dna已经在edu孵育期间合成)中的荧光信号积累，这表明存活和增殖的增加。实施例36-抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白在人源化nsg小鼠中的ov90卵巢异种移植物模型中的抗肿瘤活性将评价抗cd47-il-7和抗cd47_il-15融合蛋白以及抗cd47mab与il-7、il-15或其经修饰的/突变体变体的组合在人源化nsg小鼠中的ov90卵巢异种移植物模型中的抗肿瘤特性。在骨髓细胞清除治疗后，通过使用人脐带血来源的cd34 干细胞过继转移对nsg小鼠进行人源化。cd34 干细胞分化成在免疫缺陷型nsg小鼠内植入的人免疫细胞。植入了脐带血来源的造血干细胞(hsc)的模型开发多谱系植入并显示稳健的t细胞成熟和t细胞依赖性炎性应答。在人源化雌性nsg小鼠(nod-cg-prkdcscidi12rgtm1wjl/szj，jacksonlaboratories)的右侧腹部皮下植入含有5x106个ov90卵巢癌细胞悬浮液(atcc)的0.1ml30％rpmi/70％matrigeltm(bdbiosciences；贝德福德，马萨诸塞州)混合物。将使用数字卡尺测量肿瘤宽度和长度直径。将利用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(axb2/2)，其中“b”是最小的直径并且“a”是最大直径。具有50-100mm3的可触知肿瘤体积的小鼠被随机分为10只小鼠/组。使用1)人igg对照(10mg/kg)；2)选择的抗cd47-il-7融合蛋白(10mg/kg)；3)选择的抗cd47-il-15融合蛋白(10mg/kg)；4)抗cd47mab；5)抗cd47mab il-7；6)抗cd47mab il-15；7)抗cd47mab il-7经修饰的/突变体变体；以及8)抗cd47mab il-15经修饰的/突变体变体通过适当方案处理小鼠，即通过腹膜内注射(ip)每周五天共6周(qd5x6)，或通过静脉内注射(iv)每周一次共6周。将利用以下公式计算平均肿瘤生长抑制(tgi)。将从tgi计算中排除展现出肿瘤缩小(ts)的小鼠。将使用采用tukey多重比较检验的未配对、参数化的双因素方差分析确认肿瘤体积的显著差异。除非对照组之外，预期所有处理组：1)人igg对照(10mg/kg)；2)选择的抗cd47-il-7融合蛋白(10mg/kg)；3)选择的抗cd47-il-15融合蛋白(10mg/kg)；4)抗cd47mab；5)抗cd47mab il-7；6)抗cd47mab il-15；7)抗cd47mab il-7经修饰的/突变体变体；以及8)抗cd47mab il-15经修饰的/突变体变体以10mg/kg每日给药将在ov90人卵巢异种移植物模型中导致统计上显著的肿瘤生长抑制。实施例37-抗cd47-il-7和抗cd47-il-15融合蛋白在人源化nsg小鼠中的snu-1胃癌异种移植物模型中的抗肿瘤活性将评价抗cd47-il-7融合蛋白以及抗cd47mab与il-7、il-15或其经修饰的/突变体变体的组合在nsg小鼠中的snu-1胃癌异种移植物模型中的抗肿瘤特性。在骨髓细胞清除治疗后，通过使用人脐带血来源的cd34 干细胞过继转移对nsg小鼠进行人源化。cd34 干细胞分化成在免疫缺陷型nsg小鼠内植入的人免疫细胞。植入了脐带血来源的造血干细胞(hsc)的模型开发多谱系植入并显示稳健的t细胞成熟和t细胞依赖性炎性应答。在人源化雌性nsg小鼠(nod-cg-prkdcscidi12rgtm1wjl/szj，jacksonlaboratories)的右侧腹部皮下接种含有5x106个snu-1胃癌细胞悬浮液(atcc)的0.1ml30％rpmi/70％matrigeltm(bdbiosciences；贝德福德，马萨诸塞州)混合物。接种后八天，将使用数字卡尺测量肿瘤宽度和长度直径。将利用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(axb2/2)，其中“b”是最小的直径并且“a”是最大直径。具有50-100mm3的可触知肿瘤体积的小鼠被随机分为10只小鼠/组。使用1)人igg对照(10mg/kg)；2)选择的抗cd47-il-7融合蛋白(10mg/kg)；3)选择的抗cd47-il-15融合蛋白(10mg/kg)；4)抗cd47mab；5)抗cd47mab il-7；6)抗cd47mab il-15；7)抗cd47mab il-7经修饰的/突变体变体；以及8)抗cd47mab il-15经修饰的/突变体变体通过适当方案处理小鼠，即通过腹膜内注射(ip)每周五天共6周(qd5x6)，或通过静脉内注射(iv)每周一次共6周。将利用以下公式计算平均肿瘤生长抑制(tgi)。将从tgi计算中排除展现出肿瘤缩小(ts)的小鼠。将使用采用tukey多重比较检验的未配对、参数化的双因素方差分析确认肿瘤体积的显著差异。12.除非对照组之外，预期所有处理组：1)人igg对照(10mg/kg)；2)选择的抗cd47-il-7融合蛋白(10mg/kg)；3)选择的抗cd47-il-15融合蛋白(10mg/kg)；4)抗cd47mab；5)抗cd47mab il-7；6)抗cd47mab il-15；7)抗cd47mab il-7经修饰的/突变体变体；以及8)抗cd47mab il-15经修饰的/突变体变体将导致snu-1肿瘤生长抑制，从而在体内显示出抗肿瘤功效。在本技术中引用的美国或外国的所有参考文献、专利或申请均通过引用特此并入，如同将其整体写入本文。在出现任何不一致的情况下，以本文照字面意思公开的材料为准。根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用途和条件。当前第1页12当前第1页12