一种不同乙酰化位点壳寡糖异构体的色谱分离方法

1.本发明属于生物化学分析检测领域，涉及一种不同乙酰化位点壳寡糖异构体的色谱分离方法。
技术背景
2.甲壳素，一种仅次于纤维素的第二大生物质资源，广泛存在于虾、蟹的壳中。甲壳素是一种天然的线性多糖，其化学结构为β-1,4糖苷键连接的n-乙酰氨基葡萄糖。甲壳素因分子量太大(》1000kda)，溶解性极差(难溶于水、酸、碱)，而难以被吸收利用。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰产物，其糖单元主要为氨基葡萄糖和少量的n-乙酰氨基葡萄糖。壳聚糖因分子量较甲壳素小(》100kda)，能溶于酸性水溶液，具有一定的吸收率已有很多应用，但其溶液的高粘度和不溶于水的性质在一定程度上限制了其应用范围。
3.壳寡糖是壳聚糖的降解产物，聚合度在2～20之间，它是由n-乙酰氨基葡萄糖和/或氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键脱水缩合而成。壳寡糖因分子量低，水溶性好，吸收率高，而表现出比壳聚糖更优越的生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、促进伤口愈合等。壳寡糖的这些生物活性与其聚合度、乙酰化程度和乙酰化位点密切相关。然而，文献报道的壳寡糖生物活性的研究多是建立在其混合体系的基础上，因此，为进一步阐明其生物活性与物质基础的关系，单一聚合度、乙酰化程度和乙酰化位点的壳寡糖的研究备受关注。然而目前报道的单一壳寡糖的研究主要集中在单一乙酰化程度上，且聚合度比较低。单一乙酰化位点的壳寡糖的研究报道较少且其分离是一个难题。本发明则提供了一种不同乙酰化位点的壳寡糖异构体的色谱分离方法，以期为单一壳寡糖的色谱定性定量分析、分离纯化及其生物活性研究提供科学依据。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种不同乙酰化位点壳寡糖异构体的色谱分离方法。
5.为实现上述目标，本发明采用的技术方案为：在ph为8～12、柱温为40～90℃条件下，采用亲水色谱柱对不同乙酰化位点的壳寡糖异构体进行分离。
6.所述壳寡糖具有不同的乙酰化位点。壳寡糖(andm)的结构式如下：
[0007][0008]
其中，乙酰化位点表示a在andm中的排列位置。如壳寡糖a1d2，它包括三种不同乙酰化位点的壳寡糖，分别为add,dad和dda。
[0009]
所述ph为9～11，通过在流动相中添加碱性添加剂中的一种或二种以上进行调节；
[0010]
所述流动相为有机相和水相；有机相为乙腈、乙醇、甲醇等中的一种或多种组合。
[0011]
所述碱性添加剂的添加方式为在有机相和水相的两相中分别添加或在任意一相
中添加。
[0012]
所述碱性添加剂的种类、浓度及其ph为如下中的一种或二种以上：
[0013]
a)氨水，体积分数0.0001～100％；
[0014]
b)三乙胺，体积分数0.0001～100％；
[0015]
c)磷酸铵缓冲盐，浓度1-200mm，ph 8-12；
[0016]
d)磷酸三乙胺缓冲盐，浓度1-200mm，ph 8-12；
[0017]
e)甲酸铵缓冲盐，浓度1-200mm，ph 8-12；
[0018]
f)乙酸铵缓冲盐，浓度1-200mm，ph 8-12；
[0019]
g)碳酸氢铵缓冲盐，浓度1-200mm，ph 8-12。
[0020]
所述柱温为50～70℃。
[0021]
所述亲水色谱柱为硅胶色谱柱或键合有极性官能团的硅胶色谱柱；极性键合基团为酰胺、氨基酸、氨基、氰基、二醇、羧基、糖基和两性离子等中的一种或多种组合；
[0022]
所述亲水色谱柱柱内径为2.1～200mm；亲水色谱柱柱长为50～250mm；填料粒径为1.7～30μm；填料孔径为填料比表面积为180～350m2/g。
[0023]
所述硅胶基质色谱柱上极性基团的键合量为0.1～20μmol/m2。
[0024]
本方法能够分离不同乙酰化位点的壳寡糖异构体，这对单一壳寡糖的色谱定性定量分析、分离纯化及其生物活性研究具有十分重要的意义。
[0025]
本发明具有如下优点：
[0026]
1.能够分离不同乙酰化位点的壳寡糖异构体。不同乙酰化位点的壳寡糖异构体的分离是一个难题，且尚未见报道。本发明在ph为8～12、柱温为40～90℃条件下，采用亲水色谱柱能够分离不同乙酰化位点的壳寡糖异构体。
[0027]
2.不产生差向异构峰。本发明在高ph、高柱温条件下进行，这使得还原糖的α型和β型差向异构体一直处于快速变换之中，色谱柱无法分辨，不产生分叉的差向异构峰。
附图说明
[0028]
图1为本发明实施例1所述的壳寡糖a及其馏分的色谱图。
[0029]
图2为本发明实施例1所述的amac标记的a1和a2的二级质谱图。
[0030]
图3为本发明实施例2所述的壳寡糖b及其馏分的色谱图。
[0031]
图4为本发明实施例2所述的amac标记的b1和b2的二级质谱图。
具体实施方式
[0032]
下面结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
[0033]
实施例1
[0034]
壳寡糖a(a2d4)及其馏分的分离，采用如下色谱条件：
[0035]
色谱柱：xbridge amide(waters,4.6
×
150mm,3.5μm,键合量6.74μmol/m2)；
[0036]
柱温：50℃；
[0037]
流动相：a,0.02％氨水(ph＝10.3)；b,acn(含0.02％氨水，即每100ml乙腈中含有质量浓度28～30％氨水0.02ml)；
[0038]
流速：1ml/min；
[0039]
洗脱条件：0～25min,75％～61％b，线性；
[0040]
样品：a(5mg/ml,溶剂:acn/h2o(含10mm ph＝3.2的nh4fa)＝1/1(v/v))；
[0041]
a1(a的馏分,约3mg/ml,溶剂:acn/h2o＝1/1(v/v))
[0042]
a2(a的馏分,约3mg/ml,溶剂:acn/h2o＝1/1(v/v))
[0043]
进样量：2μl；
[0044]
紫外检测波长：195nm；
[0045]
如图1c所示，壳寡糖a被有效分离，并得到两个主峰a1和a2。lc-ms分析表明两者的组成均为a2d4(由2个n-乙酰氨基葡萄糖(a)和4个氨基葡萄糖(d)缩合而成)，因此a1和a2可能为一组差向异构峰或是具有不同乙酰化位点的壳寡糖异构体。收集这两个馏分(主峰)再次进样分析(图1a和1b)，发现每个馏分并未分裂成两个峰，这表明两者不是差向异构峰而是具有不同乙酰化位点的壳寡糖异构体。因此，高ph、高柱温条件下，采用亲水色谱柱能够分离不同乙酰化位点的壳寡糖异构体。
[0046]
通过amac标记的二级质谱技术(biomacromolecules 2002,3,696-704.)测定了两者的乙酰化位点(图2)，其结果也进一步证实了上述观点。a1和a2乙酰化位点的测定结果如下：a1有且仅有一种乙酰化位点，为ddadda；a2最多有五种乙酰化位点，为ddaadd,dadadd,daaddd,addadd和adaddd。
[0047]
实施例2
[0048]
壳寡糖b(a3d2)及其馏分的分离，过程和条件同实施例1，与实施例1不同之处在于采用如下色谱条件：
[0049]
洗脱条件：0～20min,75％～64％b，线性；
[0050]
样品：b(5mg/ml,溶剂:acn/h2o(含10mm ph＝3.2的nh4fa)＝1/1(v/v))；
[0051]
b1(b的馏分,约3mg/ml,溶剂:acn/h2o＝1/1(v/v))
[0052]
b2(b的馏分,约2mg/ml,溶剂:acn/h2o＝1/1(v/v))
[0053]
如图3所示，当选择另一样品壳寡糖b(a3d2)时，同样证明高ph、高柱温条件下，采用亲水色谱柱能够分离不同乙酰化位点的壳寡糖异构体。b1和b2乙酰化位点的测定(图4)结果如下：b1有且仅有一种乙酰化位点，为ddadda；b2有两种乙酰化位点，为adaad和aadad。