一种NADP中有关物质的检测方法与流程

一种nadp中有关物质的检测方法
技术领域：
1.本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种nadp有关物质的检测方法。


背景技术：

2.氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(简称：辅酶ⅱ，英文名：nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，nadp)是一种极为重要的核苷酸类辅酶，结构如式i所示。它是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)与一个磷酸分子以酯键结合的物质，参与多种合成代谢反应，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成，辅酶ⅱ在生物体内除了作为氢转移的载体，还作为磷酸转移的媒介参与各种合成反应。
[0003][0004]
另外，nadp作为食品、化妆品等的添加剂，在科研、食品、化妆品等领域具有广泛应用。nadp的生产是由nad生产制得的，在反应过程中会有反应不完全的nad等，另外，在反应过程中，nadp也有可能会降解成nmn、nr、na、nam等。目前，nadp的分析方法尚无文献报道。为了保证nadp后续的研发和生产质量，需要对nadp的质量进行控制。因此，研究获得一种nadp的有关物质的检测方法，这对医药生产企业来说显得尤为迫切。
[0005]
表1 nadp及其原料、降解产物的基本信息
[0006]


技术实现要素：

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本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种快速、简便、高效的检测nadp中有关物质的检测方法。
[0008]
本发明采用的技术方案如下：选用色谱柱为反相c18色谱柱，以离子对水溶液与甲醇的混合溶液为流动相，流动相的体积比为离子对水溶液：甲醇＝65～75：35～25，流速为0.6～1.2ml/min进行等度洗脱。
[0009]
进一步，所述反相c18色谱柱的固定相采用超高纯球形硅胶基质键合c18基团，优选安谱c18色谱柱(cnw athena c18-wp)。
[0010]
更进一步，所述色谱柱的柱温箱温度为20～35℃，优选28℃。
[0011]
进一步，所述流动相为离子对水溶液与甲醇的混合溶液。
[0012]
更进一步，所述流动相的体积比为离子对水溶液：甲醇＝65～75：35～25，优选体积比为离子对水溶液：甲醇＝70：30。
[0013]
更进一步，所述离子对水溶液为添加离子对试剂四丁基硫酸氢铵的磷酸二氢钾水溶液。
[0014]
更进一步，所述流动相流速为0.6～1.2ml/min，优选1.0ml/min。
[0015]
进一步，所述供试液浓度为0.5～2mg/ml，优选1mg/ml。
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进一步，进样量为5～20ul，优选10ul。
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进一步，所述检测波长为260nm。
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进一步，所述运行时间不少于12min，优选16min。
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本发明的有益效果在于，本发明选用反相c18色谱柱和特殊的流动相，实现了nadp及其合成中的初始主原料、降解产物的有效分离，进而准确测试其有关物质，该方法快速、简便、高效、实用。
附图说明
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附图1实施例1的高效液相色谱图(主分nadp紫外吸收图)
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附图2实施例1的高效液相色谱图(主原料nad紫外吸收图)
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附图3实施例1的高效液相色谱图(降解产物nmn紫外吸收图)
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附图4实施例1的高效液相色谱图(降解产物nr紫外吸收图)
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附图5实施例1的高效液相色谱图(降解产物na紫外吸收图)
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附图6实施例1的高效液相色谱图(降解产物nam紫外吸收图)
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附图7实施例1的高效液相色谱图(方法分离度谱图)
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附图8实施例1的高效液相色谱图(方法灵敏度谱图)
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附图9实施例1的高效液相色谱图(供试品检测谱图)
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附图10实施例2的高效液相色谱图
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附图11实施例3的高效液相色谱图
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附图12实施例4的高效液相色谱图
[0032]
附图13实施例5的高效液相色谱图
具体实施方式
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下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
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实施例1 nadp中有关物质高效液相色谱分析
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1、检测波长的选择
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本发明考察了nadp及其合成用初始主原料(nad)、降解产物(nmn、nr、nam、na)的紫外吸收，具体方法为：取nadp及其上述原料、降解产物适量，分别加水溶解成1mg/ml的溶液，进样10ul，使用两通管路，流速统一按照0.2ml/min，流动相统一采用用水/乙腈/三氟乙酸的混合溶液(30:70:0.1,v/v/v)，采用高效液相的二极管阵列检测器的全波长扫描功能确
定nadp及其原料、降解产物的最大吸收波长，紫外吸收图见附图1～6，结果见表2。
[0037]
表2 2-氨基吡咯烷盐酸盐及其特定杂质的最大吸收波长
[0038]
化合物简称(描述)最大吸收波长(nm)nadp(主分)259nad(原料)258nmn(降解产物)263nr(降解产物)265na(降解产物)261nam(降解产物)260
[0039]
综合附图1～6，所有化合物都在260nm处有紫外吸收，所以选定检测波长为260nm。
[0040]
2、其它色谱条件的选择
[0041]
本发明最终采用表3色谱条件。
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表3色谱条件
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[0044][0045]
实验步骤如下：
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(1)方法的分离度实验步骤
[0047]
取100mg nadp及nad、nr、nam、nmn、na各10mg至100ml容量瓶中，用上述稀释剂溶解稀释至刻度，摇匀后作为分离度实验溶液。将分离度实验溶液按照上述色谱条件进样，记录色谱图，见附图7，其中nadp保留时间rt为6.356min，原料nad的保留时间rt为9.504min，nmn的保留时间rt为4.975min，nr的保留时间rt为5.413min，na的保留时间rt为7.740min，nam的保留时间rt为10.691min，相邻化合物之间的分离度r均大于1.5，完全符合基线分离的要求(基线分离要求r≥1.5)。结果汇总如下表4。
[0048]
表4分离度试验结果
[0049]
化合物简称保留时间rt，min分离度nmn4.975—nr5.4131.622nadp6.3562.715na7.7403.835nad9.5044.495
nam10.6912.808
[0050]
(2)方法的灵敏度实验步骤
[0051]
称取原料nad及降解产物nmn、nr、na、nam各10mg至100ml容量瓶中，用水溶解混匀后，精密移取1ml至100ml容量瓶中，再称取100mg nadp加入其中，用水溶解过滤，配成含0.1％原料和降解产物的灵敏度试验溶液，按照以上色谱条件进样，记录色谱图，见附图8，色谱图里原料和降解产物所对应的色谱峰的信噪比s/n均大于3，达到检测限的信噪比要求(检测限要求信噪比≥3)。结果汇总如下表5。
[0052]
表5灵敏度试验结果汇总
[0053][0054][0055]
(3)供试品检测实验步骤
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称取100mg nadp至100ml容量瓶中，用水溶解混匀后过滤，按照以上色谱条件进样检测纯度，记录色谱图，见附图9，色谱图里降解产物杂质nr的检测结果为1.489％，降解产物杂质nr的检测结果为0.945％，初始主原料nad残留的检测结果为0.219％，其它未知结构的最大单个杂质为0.424％。该方法能实现nadp供试品里有关物质的检测。
[0057]
实施例2 nadp中有关物质高效液相色谱分析
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本实施例考察nadp及其原料、降解产物在常规流动相下的分离程度，使用实施例1相同的条件和方法，仅将流动相替换为水与乙腈及三氟乙酸的混合溶液(70/30/0.1,v/v/v)，进样分离度实验溶液，nadp及其原料、降解产物出峰都过早，也未能实现nadp及其原料、降解产物的基线分离，见附图10。
[0059]
实施例3 nadp中有关物质高效液相色谱分析
[0060]
本实施例考察了流动相中添加的离子对试剂对色谱行为的影响，使用实施例1相同的条件和方法，仅不加入四丁基硫酸氢铵到流动相中，进样分离度实验，nadp峰型差，也未实现nadp及其原料、降解产物的基线分离，见附图11。
[0061]
实施例4 nadp中有关物质高效液相色谱分析
[0062]
本实施例考察了流动相流速在超出范围的变动对方法分离度的影响，使用实施例1相同的条件和方法，仅将流速从1.0ml/min替换成1.3ml/min，进样分离度实验溶液，进样分离度实验，能分开nadp及其原料、降解产物，但其中nr与nmn之间的分离度仅为1.422，未能达到基线分离的要求1.5，见附图12。
[0063]
实施例5 nadp中有关物质中高效液相色谱分析
[0064]
本实施例考察了流动相组分体积比例超出范围的变动对方法分离度的影响，使用实施例1相同的条件和方法，仅将流动相中离子对水溶液与甲醇以70:30的比例混合改为离子对水溶液与甲醇以60:40的比例混合，进样分离度实验，能分开nadp及其原料、降解产物，但nadp与nr之间的分离度仅为0.553，未能达到基线分离的要求1.5，见附图13。