培美曲塞多谷氨酸化代谢物及其制备方法

1.本发明属于寡肽药物合成领域，具体涉及一种抗肿瘤药物培美曲塞的多谷氨酸化代谢物及其制备方法。


背景技术：

2.培美曲塞(力比泰)于2004年2月获得美国食品与药品管理局(fda)批准与顺铂联合，用于不宜手术切除的恶性胸膜间皮瘤(mpm)住院患者的治疗，其是首个获得fda批准的用于治疗mpm的药物。2004年8月，其获得fda批准作为治疗局部或转移性非小细胞肺癌(nsclc)的二线治疗药物。该药是一类以嘧啶并吡咯为母核的抗叶酸小分子化合物。与之前的经典的抗代谢类药物例如甲氨蝶呤不同的是，培美曲塞不是针对胞内某一单一靶点的特异性抑制剂，它可以同时抑制多个与叶酸代谢相关的酶活性，胸苷合成酶(ts)、甘氨酰胺核苷酸转甲酰酶(graft)、5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸转甲酰酶(aicarft)和二氢叶酸还原酶(dhfr)等都是它的作用靶点。临床研究表明培美曲塞单药可以对非小细胞肺癌、恶性胸膜间皮瘤、头颈部肿瘤、胰腺癌、胃癌、膀胱癌及宫颈癌等肿瘤有比较好的治疗效果，是一类效果显著、副作用小的广谱抗肿瘤药。
3.培美曲塞在体内代谢后主要是以多聚谷氨酸的形式存在。培美曲塞主要经由膜上的还原性叶酸载体(rfc)和叶酸受体-α(fr-α)被转运进胞内。一旦培美曲塞进入到细胞内，它就会在多聚谷氨酸合成酶(fpgs)的催化作用下变成具有生物活性的多谷氨酸形式。培美曲塞多谷氨酸代谢物的形成对这类药物在细胞内的聚集和保留起到了关键作用。多谷氨酸代谢物的形成除了能延长培美曲塞在细胞内的保留时间外，还能大幅度(呈数量级)的提高其与相应靶点的亲和力。培美曲塞五谷氨酸对ts的ki甚至可以达到1.3nm。
4.培美曲塞多谷氨酸代谢物的结构式为：
5.其中n为1～10的正整数。
6.经文献检索发现国内基本没有对培美曲塞多谷氨酸代谢物制备方法的报道，国外也鲜有相关方面的报道。
7.培美曲塞多谷氨酸代谢物属于一种多肽衍生物。目前主要依靠化学合成方法来制备多肽及其衍生物，而液相合成法和固相合成法又是其中最主要的两种方法。其中液相合成法需要不断地对中间体进行纯化，操作步骤繁琐，需要耗费大量劳动力和时间；而固相合成法可以有效避免液相合成中反复的中间体纯化分离步骤，具有明显的优越性。
8.本发明采用fmoc/t-bu正交保护策略来进行固相法合成多肽，其中fmoc基团(芴甲氧羰基)是α-氨基的保护基，对酸稳定而在较为温和的碱性条件下就可以被脱除，常见的是使用哌啶来脱去fmoc保护基，同时我们选择t-bu(叔丁基)来保护ser、thr的侧链羟基或者ot-bu(叔丁氧基)来保护asp、glu的侧链羰基，该类保护基对酸不稳定，可以用tfa(三氟乙
酸)脱除。


技术实现要素：

9.目前培美曲塞多谷氨酸代谢物的制备方法鲜有报道，本发明的目的在于提供一种培美曲塞多谷氨酸代谢物的制备方法。
10.为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：本发明提供了一种培美曲塞多谷氨酸代谢物的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：(1)先将树脂活化，然后用碱性溶液除去树脂上的保护基，洗去脱保护剂，用茚三酮溶液检测反应是否完全，得到脱去保护基的活化树脂；(2)将步骤(1)中所得的树脂与pybop(1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐)、6-cl-hobt(6-氯-1-羟基苯并三氮唑)、fmoc-o-叔丁基-l-谷氨酸、dipea(n，n-二异丙基乙胺)和溶剂dmf(n，n-二甲基甲酰胺)混合进行缩合反应，反应完毕抽滤除去反应液，洗涤固相，用茚三酮溶液检测反应是否完全，再用碱性溶液脱去谷氨酸上的fmoc保护基，洗去脱保护剂，茚三酮溶液检测反应是否完全，得到可供继续缩合的末端α-氨基，本步骤可以重复进行以延长谷氨酸肽链；(3)将步骤(2)中所得的连接上谷氨酸肽链的树脂与pybop(1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐)、6-cl-hobt(6-氯-1-羟基苯并三氮唑)、4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸、dipea(n，n-二异丙基乙胺)和溶剂dmf(n，n-二甲基甲酰胺)混合进行缩合反应，反应完毕抽滤除去反应液，洗涤固相，然后直接用切割液切割，将培美曲塞多谷氨酸代谢物从树脂上分离下来；(4)将步骤(3)中所得的切割液加入到沉淀剂中，得到蓝色沉淀，重复洗涤与离心，干燥后得到培美曲塞多谷氨酸代谢物粗品，通过柱层析或制备高效液相纯化获得纯品。
[0011]
本发明中，步骤(1)中的树脂活化和脱保护反应可在20～40℃条件下进行，脱保护反应在振荡器中进行，其反应温度优选为25～37℃，茚三酮反应可在90～100℃条件下进行。
[0012]
树脂活化所用的溶剂可以为二氯甲烷(dcm)、n，n-二甲基甲酰胺(dmf)和n-甲基吡咯烷酮(nmp)，优选二氯甲烷，脱保护反应所用的试剂为20％(v/v)的哌啶/dmf溶液，茚三酮溶液为0.5％茚三酮溶液，溶剂可以为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇，优选乙醇。
[0013]
树脂的用量为0.5g，活化用的溶剂用量为5～8ml，脱保护剂的用量为5～8ml，所用的洗涤剂为dmf(3
×
5ml)、二氯甲烷(3
×
5ml)和甲醇(3
×
5ml)，茚三酮溶液的用量为1ml。
[0014]
树脂的活化时间可以为0.5～1h，脱保护反应的时间可以为0.5～1h，茚三酮检测反应时间可以为3～5min。
[0015]
本发明中，步骤(2)中的偶联缩合反应和脱保护反应可在20～40℃条件下进行，优选25～37℃条件下反应，茚三酮反应可在90～100℃条件下进行。
[0016]
偶联缩合反应和脱保护反应在振荡器中进行，偶联反应中各种试剂的摩尔比为树脂∶fmoc-o-叔丁基-l-谷氨酸∶6-cl-hobt∶pybop∶dipea＝1∶(2～3)∶(2～3)∶(2～3)∶(2～2.5)，所用溶剂可以为甲醇、乙醇、异丙醇、n，n-二甲基甲酰胺(dmf)和n-甲基吡咯烷酮(nmp)或其中两种溶剂的混合溶剂，优选n，n-二甲基甲酰胺(dmf)，脱保护反应所用试剂为
20％(v/v)的哌啶/dmf溶液，茚三酮溶液为0.5％茚三酮溶液，溶剂可以为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇，优选乙醇。
[0017]
偶联反应所需的溶剂量为8～12ml，脱保护剂的用量为5～8ml，所用的洗涤剂为dmf(3
×
5ml)、二氯甲烷(3
×
5ml)和甲醇(3
×
5ml)，茚三酮溶液的用量为1ml。
[0018]
偶联反应的时间为1～3h，当肽链逐步延长时，则相应的反应时间也要延长，脱保护反应的时间可以为0.5～1h，茚三酮检测反应时间可以为3～5min。
[0019]
本发明中，步骤(3)中的偶联缩合反应可在20～40℃条件下进行，优选25～37℃条件下反应，使用切割液进行切割反应时，需要先在冰浴条件下进行，再转移至室温进行反应。
[0020]
偶联缩合反应在振荡器中进行，偶联反应中各种试剂的摩尔比为树脂∶fmoc-o-叔丁基-l-谷氨酸∶6-cl-hobt∶pybop∶dipea∶4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸＝1∶(2～3)∶(2～3)∶(2～3)∶(2～2.5)∶(1～2)，所用溶剂可以为甲醇、乙醇、异丙醇、n，n-二甲基甲酰胺(dmf)和n-甲基吡咯烷酮(nmp)或其中两种溶剂的混合溶剂，优选n，n-二甲基甲酰胺(dmf)，切割液为三氟乙酸(tfa)、1，2-乙二硫醇(edt)和苯甲醚按照体积比为3.8∶0.1∶0.1的比列混合配制而成。
[0021]
偶联反应所需的溶剂量为8～12ml，所用的洗涤剂为dmf(3
×
5ml)、二氯甲烷(3
×
5ml)和甲醇(3
×
5ml)，切割液的用量为4～6ml。
[0022]
偶联反应的时间为2～3h，冰浴条件下切割反应进行0.5～1h，室温条件下切割反应进行2～3h。
[0023]
本发明中，步骤(4)中的沉淀剂为冰乙醚与正己烷按照1∶1的体积比混合而成，通过离心的方法得到沉淀，离心的条件为3000rpm，5～10min，沉淀需要用冰乙醚洗涤3次，每次洗涤后离心并弃去上清液，最终将所得沉淀在室温下过夜干燥，得培美曲塞多谷氨酸代谢物粗品，通过柱层析或制备高效液相纯化获得纯品。
具体实施方式
[0024]
为了更好地说明本发明，便于理解所述的制备方法，下面将结合数个实施例对本发明的制备方法进一步非限制性的详细说明。
[0025]
实施例1本实施例提供了一种培美曲塞单谷氨酸代谢物的制备方法，具体如下：
(1)称取0.5g树脂(树脂的载氮量为0.365mmol/g，即每g树脂可以提供0.365mmol fmoc保护的氨基)加入到接肽瓶中，加入6ml的二氯甲烷溶胀30min，抽滤除去二氯甲烷，加入6ml脱保护剂，在36℃条件下振摇反应30min，抽滤除去脱保护剂，用dmf(3
×
5ml)、二氯甲烷(3
×
5ml)和甲醇(3
×
5ml)各洗涤三次树脂，取少量树脂加入到1.5mlep管中，加入1ml茚三酮溶液，99℃条件下金属浴加热3min，树脂呈蓝黑色，则脱保护反应完全，树脂上氨基的fmoc保护基被全部脱下；(2)将237mg的pybop(1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐)、77mg的6-cl-hobt(6-氯-1-羟基苯并三氮唑)、194mg的fmoc-o-叔丁基-l-谷氨酸混合、69μl的dipea(n，n-二异丙基乙胺)和10ml dmf(n，n-二甲基甲酰胺)加入到步骤(1)所得的树脂中，在36℃条件下振摇反应1h，抽滤除去液相，用dmf(3
×
5ml)、二氯甲烷(3
×
5ml)和甲醇(3
×
5ml)各洗涤三次树脂，取少量树脂加入到1.5mlep管中，加入1ml茚三酮溶液，99℃条件下金属浴加热3min，树脂没有明显变色，仍呈半透明的淡黄色，则缩合反应完全，加入6ml脱保护剂，在36℃条件下振摇反应30min，抽滤除去脱保护剂，用dmf(3
×
5ml)、二氯甲烷(3
×
5ml)和甲醇(3
×
5ml)各洗涤三次树脂，取少量树脂加入到1.5mlep管中，加入1ml茚三酮溶液，99℃条件下金属浴加热3min，树脂呈蓝黑色，则脱保护反应完全，第一个谷氨酸α-氨基上的fmoc保护基被全部脱下；(3)重复步骤(2)中的操作；(4)将237mg的pybop(1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐)、77mg的6-cl-hobt(6-氯-1-羟基苯并三氮唑)、81.6mg的4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸、69μl的dipea(n，n-二异丙基乙胺)和10ml dmf(n，n-二甲基甲酰胺)加入到步骤(3)所得的树脂中，在36℃条件下振摇反应2h，抽滤除去液相，用dmf
(3
×
5ml)、二氯甲烷(3
×
5ml)和甲醇(3
×
5ml)各洗涤三次树脂，向容器中加入5ml切割液(将培美曲塞-1谷氨酸代谢物从树脂上分离下来并且去除掉谷氨酸残基侧链上的酸不稳定的叔丁氧基)，先在冰浴条件下切割反应0.5h，再转移至室温切割反应2h，抽滤获得切割液；(5)将步骤(4)所得的切割液缓慢地逐滴加入到30ml沉淀剂中，然后迅速将混悬液转移到50ml离心管中，于3000rpm条件下离心5min，然后弃去上清液，加入25ml冰乙醚，充分震荡，于3000rpm条件下离心5min，弃去上清液，重复上述的冰乙醚洗涤操作两次，将最后得到的固体在室温下过夜干燥，得到106mg培美曲塞单谷氨酸代谢物粗品，通过柱层析或制备高效液相纯化获得纯品。
[0026]
实施例2本实施例提供了一种培美曲塞二谷氨酸代谢物的制备方法，具体如下：(1)称取0.5g树脂(树脂的载氮量为0.365mmol/g，即每g树脂可以提供0.365mmol fmoc保护的氨基)加入到接肽瓶中，加入6ml的二氯甲烷溶胀30min，抽滤除去二氯甲烷，加入6ml脱保护剂，在36℃条件下振摇反应30min，抽滤除去脱保护剂，用dmf(3
×
5ml)、二氯甲烷(3
×
5ml)和甲醇(3
×
5ml)各洗涤三次树脂，取少量树脂加入到1.5mlep管中，加入1ml茚三酮溶液，99℃条件下金属浴加热3min，树脂呈蓝黑色，则脱保护反应完全，树脂上氨基的fmoc保护基被全部脱下；(2)将237mg的pybop(1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐)、77mg的6-cl-hobt(6-氯-1-羟基苯并三氮唑)、194mg的fmoc-o-叔丁基-l-谷氨酸混合、69μl的dipea(n，n-二异丙基乙胺)和10ml dmf(n，n-二甲基甲酰胺)加入到步骤(1)所得的树脂中，在36℃条件下振摇反应1h，抽滤除去液相，用dmf(3
×
5ml)、二氯甲烷(3
×
5ml)和甲醇(3
×
5ml)各洗涤三次树脂，取少量树脂加入到1.5mlep管中，加入1ml茚三酮溶液，99℃条件下金属浴加热3min，树脂没有明显变色，仍呈半透明的淡黄色，则缩合反应完全，加入6ml脱保护剂，
fmoc保护的氨基)加入到接肽瓶中，加入6ml的二氯甲烷溶胀30min，抽滤除去二氯甲烷，加入6ml脱保护剂，在36℃条件下振摇反应30min，抽滤除去脱保护剂，用dmf(3
×
5ml)、二氯甲烷(3
×
5ml)和甲醇(3
×
5ml)各洗涤三次树脂，取少量树脂加入到1.5mlep管中，加入1ml茚三酮溶液，99℃条件下金属浴加热3min，树脂呈蓝黑色，则脱保护反应完全，树脂上氨基的fmoc保护基被全部脱下；(2)将237mg的pybop(1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐)、77mg的6-cl-hobt(6-氯-1-羟基苯并三氮唑)、194mg的fmoc-o-叔丁基-l-谷氨酸混合、69μl的dipea(n，n-二异丙基乙胺)和10ml dmf(n，n-二甲基甲酰胺)加入到步骤(1)所得的树脂中，在36℃条件下振摇反应1h，抽滤除去液相，用dmf(3
×
5ml)、二氯甲烷(3
×
5ml)和甲醇(3
×
5ml)各洗涤三次树脂，取少量树脂加入到1.5mlep管中，加入1ml茚三酮溶液，99℃条件下金属浴加热3min，树脂没有明显变色，仍呈半透明的淡黄色，则缩合反应完全，加入6ml脱保护剂，在36℃条件下振摇反应30min，抽滤除去脱保护剂，用dmf(3
×
5ml)、二氯甲烷(3
×
5ml)和甲醇(3
×
5ml)各洗涤三次树脂，取少量树脂加入到1.5mlep管中，加入1ml茚三酮溶液，99℃条件下金属浴加热3min，树脂呈蓝黑色，则脱保护反应完全，第一个谷氨酸α-氨基上的fmoc保护基被全部脱下；(3)重复步骤(2)中的操作；(4)重复步骤(2)中的操作；但需要将缩合反应的时间延长至2h；(5)重复步骤(2)中的操作；但需要将缩合反应的时间延长至2.5h；(6)将237mg的pybop(1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐)、77mg的6-cl-hobt(6-氯-1-羟基苯并三氮唑)、81.6mg的4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-3h-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酸、69μl的dipea(n，n-二异丙基乙胺)和10mldmf(n，n-二甲基甲酰胺)加入到步骤(3)所得的树脂中，在36℃条件下振摇反应2h，抽滤除去液相，用dmf(3
×
5ml)、二氯甲烷(3
×
5ml)和甲醇(3
×
5ml)各洗涤三次树脂，向容器中加入5ml切割液(将培美曲塞-1谷氨酸代谢物从树脂上分离下来并且去除掉谷氨酸残基侧链上的酸不稳定的叔丁氧基)，先在冰浴条件下切割反应0.5h，再转移至室温切割反应2h，抽滤获得切割液；(7)将步骤(4)所得的切割液缓慢地逐滴加入到30ml沉淀剂中，然后迅速将混悬液转移到50ml离心管中，于3000rpm条件下离心5min，然后弃去上清液，加入25ml冰乙醚，充分震荡，于3000rpm条件下离心5min，弃去上清液，重复上述的冰乙醚洗涤操作两次，将最后得到的固体在室温下过夜干燥，得到144mg培美曲塞三谷氨酸代谢物粗品，通过柱层析或制备高效液相纯化获得纯品。