一种基于棉花叶片茸毛特性生理抗蚜虫的鉴定方法

1.本发明属于植物种植领域，具体是一种基于棉花叶片茸毛特性生理抗蚜虫的鉴定方法。


背景技术：

2.棉花受病虫危害后,对产量影响很大，据统计，我国每年因虫害造成棉花产量损失占棉花总产量的15％-20％之间。2020年新疆生产建设兵团棉花病虫害总体中等发生，发生面积为 128.08万公顷次,较2019年增加4.84万公顷次，占兵团农作物病虫害发生面积的51.24％。其中,棉花虫害发生面积为114.74万公顷次,较2019年增加8.30万公顷次；棉蚜偏重发生,棉铃虫轻度发生。观察表明，多茸毛棉花具有一定的抗蚜虫、叶蝉、灰飞虱、红铃虫、棉铃虫等害虫危害能力，茸毛生长的位置、长度、密度都会影响昆虫取食，产卵等。同时，多毛品种最微细的叶脉上还有较多的毛着生,而少毛品种在最微细的叶脉上则只有稀疏的毛着生。叶脉上有密毛着生，蚜虫的口器不易插入,就保护了输导组织中的养分和水分难以被蚜虫刺吸，大大降低了蚜虫的繁殖率，由此可见叶子茸毛密度与抗蚜性关系密切。
3.但也有部分反对意见表明，多茸毛性状虽具有抗棉蚜性，但茎叶多茸毛使棉铃虫卵易于附着，因而会虫害加重。也有研究指出棉铃虫卵的多少除了与茸毛性状有关外，还与棉株分泌物有关，且分泌物中含有引诱成虫产卵的气体，因而产卵量增大。这说明棉花材料不同，棉铃虫落卵和危害也不一致。为了验证上述猜想和观测结果的正确性，亟需一种基于棉花叶片茸毛特性生理抗蚜虫的鉴定方法，为多茸毛棉花在高产优质生理抗虫棉花育种的充分利用奠定理论和技术支撑。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种基于棉花叶片茸毛特性生理抗蚜虫的鉴定方法，为多茸毛棉花在高产优质生理抗虫棉花育种的充分利用奠定理论和技术支撑。
5.为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种基于棉花叶片茸毛特性生理抗蚜虫的鉴定方法，以不同品种的棉花为研究对象，区分不同棉花的茸毛特性、棉花的抗虫性鉴定和棉花的生理指标的测定方面研究抗虫性生理机制以及茸毛特性与抗虫性的关系。
6.进一步，包括以下步骤：
7.步骤一，抗蚜虫鉴定，将棉花种植于试验田间，采用不同品种交叉混播的方式，等待棉花成熟后通过随机采样进行蚜虫抗性分级；
8.步骤二，棉花抗蚜性分级标准与计算，步骤二，棉花抗蚜性分级标准与计算，
9.步骤三，形态学鉴定，苗期五叶一心时取各个材料第三片真叶，在蕾期取倒三叶测
定茸毛长度和数量；
10.步骤四，昆虫生态学鉴定，选用大田内种植的同类型种子，进行实验室内幼苗培育，随后进行棉蚜幼虫的接种，随后对照未接种的幼苗；
11.步骤五，蚜虫选择性试验，选取长势相同的不同种类植株的叶片，观测蚜虫的趋向性；
12.步骤六，营养物质与抗蚜性的关系试验，根据驱虫性的强弱关系将植株标定后取样进行测定，测定指标包括可溶性糖含量、过氧化物酶活性测定、多酚氧化酶活性测定和苯丙氨酸解氨酶活性测定。
13.进一步，所述步骤一中包括
14.调查部位为：危害最重的一叶；调查标准：共分为1、2和3级；1级：叶片完整无受害； 2级：有蚜虫，叶片微缩；3级：蚜虫多而叶片卷曲；计算观察蚜害指数，虫口密度以及蚜虫数；蚜虫数及蚜害指数调查方法和内容，一共调查3次，每隔10天调查一次。
15.进一步，所述步骤三包括，选择每个品系棉叶的相同部位切取面积为0.25平方厘米的叶片，在解剖镜下记数茸毛，算出每平方厘米的平均茸毛数和测量茸毛长度。
16.进一步，将供试材料切成5mm2大小的小块，在等渗缓冲液中洗净后放在2％戊二醛固定液中固定4h；在缓冲液中漂洗几次，直至无戊二醛气味为止；然后，将样品放在5％-6％高锰酸钾溶液中于4℃暗处固定48h，用磷酸盐缓冲液漂洗数次，用乙醇逐级脱水，每级30min，进行临界点干燥和喷涂金属膜；然后电镜观察。
17.进一步，所述步骤四中昆虫形态学的鉴定方法包括：将种子分别用70％乙醇溶液处理60 s,30％过氧化氢溶液处理1.5h，用无菌水冲洗3-4次，28℃黑暗条件下浸泡1-2d；待棉种露白后，将幼苗移栽入盛满营养土的塑料钵子中；培养室中培养，培养条件为25℃，光周期为白光16h和8h暗室培养，植株长出4-6片真叶的棉花植株将用于接虫实验。
18.进一步，接虫实验包括随机选取大小一致的棉蚜幼虫，将棉蚜幼虫用柔软的小型毛笔一个一个转接到具有4-6片真叶的棉植株叶片上,每叶接种20头；然后将双面胶带绑在叶柄端部以防止棉蚜从叶片上逃逸；在棉蚜取食后48h后，将棉蚜用柔软的毛笔去除；48h后采集棉蚜诱导处理的叶片和未处理的对照叶片，分别用锡箔纸包裹，在液氮中短暂冷漫后做好标记保存到-70℃冰箱中备用。
19.进一步，所述步骤四和步骤一中还包括对比步骤，将蚜虫进食后的植株放入暗箱，随后在植株后方钉上日照纸，在植株前方进行强光照射，随后取下日照纸带入暗室，对比日照纸生成的轮廓观测蚜虫对不同植株的侵蚀程度。
20.进一步，步骤五，蚜虫选择性试验中包括选取三种试验材料幼苗期长势一样的植株，分别剪取第三片真叶，均匀排列在半径为25cm的圆形试验板边缘上，在圆心处放置50只蚜虫成虫，每隔10min统计叶片上蚜虫的数量，共统计五次，重复三次；
21.选取三种试验材料长势一样的幼苗,均匀排列在半径为25cm的圆形试验板边缘上,保持正常生长状态，在圆心出放置50只蚜虫(成虫)，并罩上120目的防虫网，每隔1h统计叶片上蚜虫(成虫)的数量，共统计六次，重复三次。
22.采用上述方案后实现了以下有益效果：1、本技术方案挖掘和提高棉花自身抗虫性对减少环境污染，增强绿色生态，通过抗虫性鉴定，生理指标的测定，茸毛特性的分析，本研究通过前期筛选，选出具有代表性的材料，通过抗虫性鉴定，生理指标的测定，茸毛特性的
分析，为多茸毛棉花在高产优质生理抗虫棉花育种的充分利用奠定理论和技术支撑，对于实现棉花安全高效可持续生产具有重要意义。
23.2、本技术方案中利用光源快速分选蚜虫啃食的植株形体，同时将光透的植株素描于日照纸表面，便于细节处对比。
附图说明
24.图1为本发明实施例一的示意图；
25.图2为本发明实施例三中不同棉花品种茸毛密度与蚜害指数的关系；
26.图3为本发明实施例三中不同棉花品种茸毛长度与蚜害指数的关系；
27.图4为本发明实施例三中不同棉花品种苗期、蕾期、铃期茸毛密度变化；
28.图5为本发明实施例三中不同品种棉花叶片接虫前后叶片中可溶性糖含量变化；
29.图6为本发明实施例三中不同品种棉花叶片接虫前后叶片中过氧化物酶(pod)活性变化；
30.图7为本发明实施例三中不同品种棉花叶片接虫前后叶片中多酚氧化酶(ppo)活性变化；
31.图8为本发明实施例三中不同品种棉花叶片接虫前后叶片中苯丙氨酸解氨酶(pal)活性变化；
32.图9为本发明实施例三中叶片中生物碱含量占比(sws-1/无毛)。
具体实施方式
33.下面通过具体实施方式进一步详细说明：
34.实施例一基本如附图1所示：一种基于棉花叶片茸毛特性生理抗蚜虫的鉴定方法
35.1.研究目标
36.以多个材料56绿叶多毛、多毛973、无毛2611、171、179为研究对象，主要从材料的茸毛特性，抗虫性鉴定，生理指标的测定方面研究抗虫性生理机制以及茸毛特性与抗虫性的关系。
37.2.研究内容
38.2.1材料茸毛特性
39.植物的毛状体有不同的形态、长短、密度等，功能也有所不同，这种差异不仅表现在植物的不同种类，还表现在种内的品种间，甚至同一植物的不同部位间，从而对昆虫产生不同的影响。通过分析五种材料不同生育期的茸毛特性，找到其茸毛的生长规律以及不同密度茸毛的抗虫性特点。
40.2.2抗虫性鉴定
41.毛状体构造的演变常可见到与防御昆虫有关的种种迹象。植物的外部形态和内部的组织构造与所提供的生境性质有密切的关系，由此影响昆虫的行为、生长发育和繁殖，通过对田间观测和实验室接虫实验找到茸毛与抗虫性的关系。
42.2.3生理指标测定
43.可溶性糖是植食性昆虫生长发育和繁殖必不可少的，它们不但为昆虫活动提供能量，而且也是主要的助食因素。过氧化物酶(pod)和多酚氧化酶(ppo)同属氧化酶系，主要参
与酚类氧化为醒以及木质素前体的聚合作用。苯丙氨酸解氨酶(pal)是植物次生性物质代谢中比较关键的一种酶，它活性的高低直接决定着以后一系列次生物质合成步骤中酶活性的高低，研究表明这三种酶活性高低对抗蚜性有一定关系，本项研究主要对这一结论加以验证。
44.3.实验方法
45.3.1抗蚜虫鉴定
46.3.1.1大田自然鉴定
47.2021年7月15日田间鉴定棉蚜抗性，调查部位为；危害最重的一叶；请参考表1调查标准：共分为1、2、3级。1级：叶片完整无受害；2级：有蚜虫，叶片微缩；3级：蚜虫多而叶片卷曲。计算观察蚜害指数，虫口密度以及蚜虫数。蚜虫数及蚜害指数调查方法和内容，一共调查3次，每隔10天调查一次，从2021年6月15日开始，至2021年7月15日结束。
48.表1棉花对蚜虫抗性分级标准
[0049][0050]
3.1.2棉花抗蚜性分级标准与计算：
[0051][0052][0053]
3.1.3形态学鉴定
[0054]
在苗期五叶一心时取各个材料第三片真叶，在蕾期取倒三叶测定其茸毛长度，数量。选择每个品系棉叶的相同部位切取面积为0.25平方厘米的叶片，在解剖镜下记数茸毛，算出每平方厘米的平均茸毛数，测量茸毛长度。具体方法是:将供试材料切成5mm2大小的小块，在等渗缓冲液中洗净后放在2％戊二醛固定液(用0.1moll，ph7.2磷酸盐缓冲液配制)中固定4h；在缓冲液中漂洗几次，直至无戊二醛气味为止。然后，将样品放在5％-6％高锰酸钾溶液(用0.1moll，ph7.2磷酸缓冲液配制)中于4℃暗处固定48h(24h换一次固定液)，用磷酸盐缓冲液漂洗数次，用乙醇(30％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、100％)逐级脱水，每级30min，进行临界点干燥和喷涂金属膜；然后电镜观察。
[0055]
3.1.4昆虫生态学鉴定
[0056]
通过室内饲养材料多毛973、56绿叶多毛、无毛2611、171、179，种子分别用70％乙醇溶液处理60s,30％过氧化氢溶液处理1.5h，用无菌水冲洗3-4次，28℃黑暗条件下浸泡1-2d。待棉种露白后，将幼苗移栽入盛满营养土(草木灰:蛭石:土＝1:1:2)的塑料钵子中。培养室中培养，培养条件为25℃，光周期为16h light/8h dark，长出4-6片真叶的棉花植株将用于接虫实验。
[0057]
随机选取大小一致的棉蚜幼虫将其用柔软的小型毛笔一个一个转接到具有4-6片
30min.再测一次，以两次的od值之差换算成每min单位鲜重的od值(以od值变化0.01 为一个酶活力单位)。
[0072]
实施例二
[0073]
本实施例与上述实施例的区别在于，在抗蚜虫鉴定和昆虫生态学鉴定过程中将将蚜虫进食后的植株放入暗箱，随后在植株后方钉上日照纸，在植株前方进行强光照射，随后取下日照纸带入暗室，对比日照纸生成的轮廓观测蚜虫对不同植株的侵蚀程度。
[0074]
实施例三
[0075]
本实施例为基于实施例一步骤后得到的数据汇总：
[0076]
1、不同棉花品种叶片茸毛密度、长度对抗蚜性的影响
[0077]
表2不同棉花品种叶片茸毛密度、长度和抗蚜性等级
[0078][0079]
注：不同小写字母代表差异达0.05显著水平
[0080]
请参考图2，将各供试品种的蚜害指数(y)与茸毛密度(x)进行直线回归分析，回归方程为y＝60.947-0.016x，相关系数r＝0.949，f＝27.173，p＝0.014＜0.05，回归效果显著。得到的回归方程表明蚜害指数与茸毛密度呈负相关关系，即茸毛密度越大相对应的蚜害指数越小，对蚜虫的抵抗能力越强。
[0081]
请参考图3，通过对五个供试品种的茸毛密度测量发现，不同品种间茸毛密度差异显著，从表2可以看出品种171和无毛的茸毛密度和173、绿叶多毛、sws-1存在显著性差异，显著小于其它品种，茸毛密度分别为100根
·
cm-2、40根
·
cm-2，对应的蚜害指数也大，更招蚜虫的喜爱。173茸毛密度在供试品种中处于适中显著大于无毛品种，为1780根
·
cm-2，蚜害指数却和无毛品种仅相差5％，说明茸毛密度还未达到迫使蚜虫生长的条件。其中多毛品种绿叶多毛和sws-1茸毛密度之间没有显著性差异，茸毛密度显著大于其他品种分别为3347 根
·
cm-2和3513根
·
cm-2，茸毛密度大不利于蚜虫的取食和活动。通过对茸毛长度的测量表明五个供试品种茸毛长度之间不存在显著性差异，表明茸毛长度和抗蚜性之间没有直接的关系。
[0082]
2、不同棉花品种苗期、蕾期、铃期的茸毛变化情况
[0083]
请参考图4，通过对不同棉花品种苗期、蕾期、铃期茸毛测量发现，无毛和绿叶多毛苗期茸毛密度小于蕾期，其余品种171、173、sws-1茸毛密度皆表现为苗期＞蕾期＞铃期。
[0084]
3、不同棉花品种可溶性糖含量测定
[0085]
请参考图5，通过对供试品种的可溶性糖含量测定发现，所有品种在经蚜虫啃食后叶片中可溶性糖含量均提高，其中多毛品种sws-1与绿叶多毛显著高于其他品种。接虫前无毛与 173叶片中可溶性糖含量没有显著性差异，接虫后无毛叶片中可溶性糖含量显著低于其它品种，其中171和173叶片中可溶性糖含量差异不显著。
[0086]
4、不同棉花品种过氧化物酶(pod)活性
[0087]
请参考图6，通过对供试品种的可溶性糖含量测定发现，经蚜虫啃食后所有供试品种叶片中过氧化物酶活性均提高，说明过氧化物酶活性与抗蚜性有关，其中多茸毛品种绿叶多毛与sws-1显著高于其它品种，其中无毛品种接虫前后叶片中过氧化物活性均是最低的。
[0088]
5、不同棉花品种多酚氧化酶(ppo)活性
[0089]
请参考图7，对不同品种叶片中多酚氧化酶(ppo)活性测定发现品种无毛接虫前叶片中多酚氧化酶活性和171、sws-1叶片中多酚氧化酶活性差异不显著，接虫后品种sws-1活性最强显著高于其他品种。
[0090]
6、不同棉花品种苯丙氨酸解氨酶(pal)活性
[0091]
请参考图8，对不同品种叶片中苯丙氨酸解氨酶活性进行测量发现接虫后所有品种叶片中苯丙氨酸解氨酶活性均提高，其中接虫前无毛和171叶片中苯丙氨酸解氨酶活性不存在显著性差异，绿叶多毛和173、sws-1叶片中苯丙氨酸解氨酶活性存在差异，差异不显著，接虫后无毛品种和sws-1叶片中苯丙氨酸解氨酶活性不存在显著性差异，171和173叶片中苯丙氨酸解氨酶活性不存在显著性差异，苯丙氨酸解氨酶与抗虫性有关。
[0092]
7、多茸毛品种sws-1与无毛品种叶片中生物碱含量比值
[0093]
请参考图9，通过对品种sws-1和无毛叶片中挥发性物质含量比值测量发现其中生物碱含量占比最大为14％，其次是黄酮类和酚类，占比分别为12％和8％，对占比最大的生物碱进行分析将生物碱中比值大于2的整理发现比值最大的千里光宁，是植物本身产生的毒素，对食草动物有毒。在药用天然产物中，千里光宁被用于消炎和抗病毒等用途。其中邻氨基苯甲酸甲酯低毒有刺激性。因此多茸毛sws-1抗虫性可能与千里光宁、邻氨基苯甲酸甲酯含量多少有关。
[0094]
藜芦碱和降二氢辣椒碱查找资料发现藜芦碱被称为植物源杀虫剂，对昆虫具有触杀和胃毒作用。可用于防治家蝇、蜚蠊、虱等卫生害虫，也可用于防治菜青虫、蚜虫、叶蝉、蓟马和蝽象等农业害虫，因此藜芦碱是叶片中抗虫性有关的重要物质。
[0095]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0096]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本技术给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本技术的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具
体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。