一种用于橡胶树白粉菌遗传转化的多菌灵抗性筛选载体

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种用于橡胶树白粉菌遗传转化的多菌灵抗性筛选载体。


背景技术：

2.白粉菌(erisiphales)是最常见的植物病原真菌之一。因其在寄生部位产生大量分生孢子所表现出的白粉病症是该病害名字的由来。白粉菌能够侵染植物的叶片、茎、花和果实等部位，寄主植物近10,000种。橡胶树白粉菌是危害橡胶树嫩叶和嫩芽的重要早春病害，研究表明中国橡胶树白粉的病原为橡胶树白粉菌(erysiphe quercicola)。尽管包括卵菌在内的很多植物病原菌都成功建立了遗传转化方法，但是白粉菌的转化困难目前只有在瓜类白粉(podosphaera xanthii)上实现了成功转化。建立橡胶树白粉菌的遗传转化方法是研究橡胶树白粉菌致病机理的基础，技术上亟待突破。
3.遗传转化方法的建立需要考虑转化方法的选择、筛选标记的应用、转化子的检测等多个环节。橡胶树白粉菌作为活体营养型寄生真菌转化子的筛选过程只能在橡胶树叶片上进行。因此在选用筛选药剂及标记时还需要考虑筛选药剂对橡胶树的影响。目前真菌遗传转化常用的抗生素筛选标记主要有潮霉素、遗传霉素(g418)、博来霉素和多菌灵等药剂。前期研究发现潮霉素容易对橡胶树叶片产生药害，瓜类白粉菌的应用中也出现了同样的问题。瓜类白粉菌的转化中成功将多菌灵做为筛选标记进行应用。多菌灵药剂作用的靶标为β-微管蛋白，因此多菌灵对大多数真菌都有抑菌活性。研究表明长期大剂量的应用多菌灵可以导致抗药性的产生，而抗药位点的突变在不同物种中都比较保守，其中β-tub蛋白e198a的突变在禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、灰霉菌(botrytis cinerea)、尾孢属(cercospora spp)和瓜类白粉菌(podosphaera xanthii)的抗性菌株中都鉴定到了。说明β-tub(e198a)抗药性突变为保守突变，在橡胶树白粉菌抗性筛选中具有开发价值。


技术实现要素：

4.为了解决橡胶树白粉菌转化过程中的筛选标记问题，本发明提供了一种用于橡胶树白粉菌遗传转化的多菌灵抗性筛选载体及抗性基因β-tub(e198a)的重组质粒，以及重组质粒作为橡胶树白粉菌转化筛选标记在进行橡胶树白粉菌转化时的应用。
5.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
6.一种重组质粒，所述重组质粒包含第一酶切位点、第二酶切位点、橡胶树白粉菌rp60基因启动子、β-tub(e198a)突变基因(β-tub(e198a)突变基因编码蛋白序列如序列2所示)、终止子和氨苄青霉素抗性基因，其中：所述橡胶树白粉菌rp60基因启动子位于β-tub(e198a)突变基因上游；所述终止子位于β-tub(e198a)突变基因下游；所述第一酶切位点位于橡胶树白粉菌rp60基因启动子上游；所述第二酶切位点位于终止子下游。
7.进一步的，所述第一酶切位点为ecori和hindiii，其中：ecori序列为5
‘‑
gaattc-3’，hindiii序列为5
‘‑
aagctt-3’。
8.进一步的，所述第二酶切位点为bamhi，其中：bamhi序列为5
‘‑
ggatcc-3’。
9.本发明还提出上述重组质粒在橡胶树白粉菌遗传转化的多菌灵抗性筛选标记中的应用。
10.本发明另外提出一种用于橡胶树白粉菌遗传转化的多菌灵抗性筛选载体，使用上述重组质粒转化至橡胶树白粉菌，转化成功的橡胶树白粉菌产生多菌灵抗性基因，即为多菌灵抗性筛选载体。
11.本发明另外提出一种橡胶树白粉菌遗传转化筛选方法，包括以下步骤：
12.步骤一、使用上述的重组质粒转化至橡胶树白粉菌，转化成功的橡胶树白粉菌产生多菌灵抗性基因，即为多菌灵抗性筛选载体，应用此多菌灵抗性基因作为橡胶树白粉菌遗传转化筛选标记；
13.步骤二、将转化后的橡胶树白粉菌分生孢子悬浮液接种于古铜期橡胶树叶片；
14.步骤三、待橡胶树叶片干后将橡胶树叶片放在苗房黑暗接种培养；具体的，将橡胶树叶片放在23～25℃苗房黑暗培养24小时；
15.步骤四、向橡胶树叶片喷施多菌灵盐酸溶液筛选转化后的分生孢子，具体的，喷施含0.5μg/ml的多菌灵盐酸溶液，其中hcl的浓度为0.1m，连续喷施3次，每次间隔24h。
16.相比于现有技术，本发明具有如下优点：
17.本发明提供了一种可用于橡胶树白粉菌等丝状真菌遗传转化的多菌灵抗性筛选载体，具体使用重组质粒转化橡胶树白粉菌，转化成功的橡胶树白粉菌产生多菌灵抗性基因，即为多菌灵抗性筛选载体，应用此多菌灵抗性基因作为橡胶树白粉菌遗传转化筛选标记。该重组质粒包含第一酶切位点、第二酶切位点、橡胶树白粉菌rp60基因启动子、β-tub(e198a)突变基因、终止子和抗性基因。使用此重组质粒转化橡胶树白粉菌时，可用多菌灵对转化后的转化子进行筛选，该筛选标记的开发应用解决了橡胶树白粉菌转化的筛选标记问题。
附图说明
18.图1为本发明提出的重组质粒的结构示意图。
具体实施方式
19.下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
20.本发明提出一种重组质粒，其构建方法为：通过pcr分别扩增序列1所示的橡胶树白粉菌rp60基因启动子和tub2基因序列，序列1为两个片段叠加的序列，通过酶切连接的方法将重组基因整合到载体第一酶切位点和第二酶切位点之间。
21.所述重组质粒包含第一酶切位点、第二酶切位点、橡胶树白粉菌rp60基因启动子、β-tub(e198a)突变基因(β-tub(e198a)突变基因编码蛋白序列如序列2所示)、终止子和氨苄青霉素抗性基因。其中：所述橡胶树白粉菌rp60基因启动子位于β-tub(e198a)突变基因上游；所述终止子位于β-tub(e198a)突变基因下游；所述第一酶切位点位于橡胶树白粉菌rp60基因启动子上游；所述第二酶切位点位于终止子下游。所述第一酶切位点为ecori和
hindiii，其中：ecori序列为5
‘‑
gaattc-3’，hindiii序列为5
‘‑
aagctt-3’。所述第二酶切位点为bamhi，其中：bamhi序列为5
‘‑
ggatcc-3’。该重组质粒的结构图如图1所示。
22.所述重组质粒验证方法：获得的阳性克隆载体分别通过pcr扩增和载体测序进行验证。pcr引物为tub/f(5
’‑
atgcgtgaaattgttcatct-3’),tub/r(5
’‑
gtaacgaggcccagaactga-3’)。测序引物为1f(5
’‑
gatatctcagtaccctttc-3’)，2f(5
’‑
gccatacaatgcaacact-3’)，3f(5
’‑
tcttgcattggtacaccg-3’)。
23.本发明还提出上述重组质粒在橡胶树白粉菌遗传转化的多菌灵抗性筛选标记中的应用。
24.本发明提出一种用于橡胶树白粉菌遗传转化的多菌灵抗性筛选载体，具体为，使用上述重组质粒转化橡胶树白粉菌，转化成功的橡胶树白粉菌产生多菌灵抗性基因，即为多菌灵抗性筛选载体，应用此多菌灵抗性基因作为橡胶树白粉菌遗传转化筛选标记。
25.该多菌灵抗性筛选载体应用于橡胶树白粉菌遗传转化筛选方法，包括以下步骤：
26.步骤一、通过现有技术的电击转化法将上述重组质粒转化至橡胶树白粉菌，转化方法为用电击缓冲液(10mm tris-cl ph 7.5，270mm蔗糖，1mm liac)将橡胶树白粉菌分生孢子配制成109个/ml孢子悬浮液；向0.2cm电击杯中加入150μl孢子悬浮液，10μg重组质粒，最终体积为200μl，冰上预冷15min；电转仪(bio-rad)参数设置为两次方波脉冲电压1.7kv,1ms,中间间隔5s，进行电击转化。转化成功的橡胶树白粉菌产生多菌灵抗性基因，应用此多菌灵抗性基因作为橡胶树白粉菌遗传转化筛选标记。
27.步骤二、将转化后的橡胶树白粉菌分生孢子悬浮液接种于古铜期橡胶树叶片；具体为：将电击转化后的孢子悬浮液离心，倒掉上清液后用蒸馏水将离心管底部孢子重悬浮。用10μl的移液器将孢子悬浮液滴到古铜期橡胶树叶片上。
28.步骤三、待橡胶树叶片干后将橡胶树叶片放在23～25℃苗房黑暗接种培养24小时。
29.步骤四、向橡胶树叶片喷施含0.5μg/ml的多菌灵盐酸溶液(hcl的浓度为0.1m)筛选转化后的分生孢子，连续喷施3次，每次间隔24h。