一种蛋白分布及尺寸可控的蛋白-无机纳米花、制备方法及其应用

1.本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种蛋白分布及尺寸可控的蛋白-无机纳米花、制备方法及其作为检测试剂在吡虫啉免疫分析中的应用。


背景技术：

2.目前许多疾病标志物的含量水平远远低于现有方法的监测能力，因此建立超灵敏生物分析技术对于保障人类健康尤其重要。酶联免疫吸附方法具有良好的选择性和特异性，被认为是临床诊断和食品质量控制领域最受欢迎的生物分析方法。该方法依据抗原-抗体之间的特异性识别原理，其性能与生物酶的活性和含量有关。然而，生物酶易受到外部环境的影响，这极大地限制了传统酶联免疫吸附方法在低含量目标物检测中的应用，成为构建高灵敏度生物传感器的一大障碍。
3.近年来，研究人员不断探索新材料来固定生物酶，从而增强传感器的敏感性。纳米容器由于具有比表面积大、多孔性、易功能化等优点，可以有效地固载生物大分子(如蛋白等)，引起了广泛关注。与游离酶相比，它们能同等地实现信号放大的功能，并且能够显著提高酶的稳定性。例如，选择磁珠作为纳米容器来固定乙酰胆碱酯酶(信号放大单元)和抗体(识别单元)来建立免疫分析策略，其灵敏度比传统酶联免疫吸附方法提高了81倍(angew.chem.,int.ed.2013,52,14065-14069)。由于多孔性质，金属有机框架可以嵌入或吸附生物酶，尽管负载能力不高，但能极大地增强酶的稳定性。此外，通过自组装形成的多功能蛋白球形微室，将生物酶及抗体作为组成单元，性能比传统酶联免疫吸附方法提高了150倍(small 2019,1900350)。尽管纳米容器具有许多显著的优点，但复杂的制备及共价偶联技术、非生物表面较低的生物相容性(如有机溶剂)、在某些特定参数下(如酸性条件)下生物酶易变性等因素限制了纳米容器的性能。另外，一些纳米结构相对封闭，降低了特定功能生物大分子的负载能力。
4.与生物矿化过程类似，蛋白被原位捕获到磷酸铜晶体支架中，形成蛋白-无机纳米花(pihn)。它具有制备简便、分等级结构、表面积大、高效稳定等优点，可应用于生物修复、生物医学和生物传感器等领域。pihn可以较大程度地保持生物酶的活性和增强生物酶的稳定性，是构建蛋白固定化纳米载体的理想材料。其超大的表面积为生物酶和抗体的共同固定化提供了有利条件，同时，在多酶级联催化反应中获得了较高的灵敏度。与以往的纳米容器相比，由于其固有的分等级结构，可以将更多的抗体或生物酶固定到蛋白-无机纳米花中，使之具有靶标特异性识别和信号放大的双重功能。
5.目前研究的pihn主要是通过蛋白或生物大分子共混合的方法制备，分析结果的重复性较差。在研究基础上，我们制备了一种蛋白分布及尺寸可控的pihn，以提高对免疫分析性能的灵敏度及稳定性。同时，以吡虫啉为目标检测物，实现了农药的高通量、高选择性、高灵敏度分析，为基于酶联免疫方法的食品、环境及公共安全的监测提供了新的视角。


技术实现要素：

6.本发明针对现有技术的不足，提供了一种蛋白分布及尺寸可控的蛋白-无机纳米花、制备方法及其作为检测试剂在吡虫啉免疫分析中的应用。本发明实现了吡虫啉的高通量分析，在吡虫啉传感应用中具有较高的灵敏度及选择性。
7.本发明所述的一种蛋白分布及尺寸可控的蛋白-无机纳米花的制备方法，其步骤如下：
8.(1)将1ml辣根过氧化物酶(hrp)的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)加入到30μl硫酸铜水溶液(200mmol-1
)中，涡旋振荡5～10分钟，然后静置于4℃反应10～15小时；辣根过氧化物酶(hrp)的磷酸盐缓冲溶液中，辣根过氧化物酶(hrp)的浓度为0.1～5.0mg ml-1
；
9.(2)将步骤(1)的反应产物在800～1200r min-1
下离心1～5分钟，用去离子水定容至1ml，再在800～1200r min-1
下离心1～5分钟，去除上清液；然后，加入1ml含有山羊抗小鼠igg(ab2)的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为5.0～10.0)，涡旋振荡5～10分钟，再静置于4℃反应20～30小时；山羊抗小鼠igg(ab2)的磷酸盐缓冲溶液中，山羊抗小鼠igg(ab2)的浓度为0.2～0.3mg ml-1
；最后，将反应产物在800～1200r min-1
下离心2～3次，每次1～5分钟；再用去离子水定容至1ml，得到蛋白分布及尺寸可控的蛋白-无机纳米花溶液，标记为hrp@ab
2 pihn，置于4℃下备用。在制备的hrp@ab
2 pihn中，hrp位于内层，ab2位于外层，实现了蛋白分布的可控组装。hrp@ab
2 pihn尺寸范围4.26μm～7.48μm，其尺寸与hrp的浓度的有关，随着hrp浓度的增加，其尺寸逐渐减小。当hrp的浓度为0.1mg ml-1
时，尺寸为7.48μm。当hrp的浓度为5.0mg ml-1
时，尺寸为4.26μm。
10.本发明所述的一种蛋白分布及尺寸可控的蛋白-无机纳米花，其是由上述方法制备得到。
11.本发明制备的蛋白分布及尺寸可控的蛋白-无机纳米花可以作为检测试剂在吡虫啉免疫分析中得到应用，具体步骤为：
12.(1)用ph 9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液配置浓度2.5μg ml-1
的吡虫啉半抗原(参照文献合成，anal.methods,2012,4,4053)溶液，添加至96孔板中，每孔100μl，在4℃下孵育过夜；使用含有0.05％(w/v)吐温20的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)洗板后，再用2％(w/v)的卵清白蛋白水溶液在37℃下封闭45～60分钟，每孔250μl；
13.(2)对步骤(1)得到的96孔板使用含有0.05％(w/v)吐温20的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)洗板，再将50μl、0.001～10000ng ml-1
的吡虫啉水溶液加入到96孔板中，然后加入50μl含有吡虫啉抗体(参照文献合成，anal.methods,2012,4,4053)的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为5.5)，在37℃下反应45～75分钟；吡虫啉抗体的磷酸盐缓冲溶液中，吡虫啉抗体的浓度为5.0μg ml-1
；
14.(3)对步骤(2)得到的96孔板使用含有0.05％(w/v)吐温20的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)洗板，再向其中加入100μl的hrp@ab
2 pihn溶液，反应45～75分钟；然后使用含有0.05％(w/v)吐温20的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)洗板，再向其中加入50μl含有3,3
′
,5,5
′‑
四甲基联苯胺(tmb)和过氧化氢(h2o2)的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液作为底物缓冲液，反应30～60分钟后加入2mol l-1
硫酸终止反应；底物缓冲液中tmb的浓度为5mg ml-1
，h2o2的浓度为100mmol l-1
；
15.(4)使用酶标仪(biotek-800ts)读取步骤(3)反应物溶液450nm处的吸光度值，以吡虫啉的浓度为横坐标、间接竞争效率(ie％，表示某一吡虫啉浓度下，吡虫啉与吡虫啉半抗原竞争吡虫啉抗体的效率；由公式1计算获得)为纵坐标来构筑吡虫啉免疫分析标准曲线；可以看到，随着吡虫啉浓度的增加，ie％逐渐升高；
16.ie％＝(a
1-a2)/(a
1-d)
×
100％
ꢀꢀ
(公式1)
17.其中，a1表示吡虫啉不存在时溶液的吸光度(此时体系中存在吡虫啉半抗原、吡虫啉抗体)，a1表示吡虫啉存在时溶液的吸光度，d表示吡虫啉和吡虫啉抗体都不存在时的吸光度(此时体系中仅存在吡虫啉半抗原)。
18.(5)在步骤(2)的操作中将已知浓度的吡虫啉水溶液替换为未知浓度的吡虫啉水溶液，其余操作相同，再经过步骤(3)得到反应物溶液；然后使用酶标仪(biotek-800ts)读取该反应物溶液450nm处的吸光度值，将由吸光度值换算得到的间接竞争效率(ie％)数据代入步骤(4)得到的吡虫啉免疫分析标准曲线，计算得到所加入的吡虫啉水溶液中吡虫啉的浓度，从而实现本发明制备的蛋白分布及尺寸可控的蛋白-无机纳米花作为检测试剂在吡虫啉免疫分析中的应用。
19.本发明机理如下：
20.本发明利用硫酸铜溶液、hrp、ab2及磷酸盐缓冲溶液合成了蛋白-无机纳米花。通过对蛋白组装顺序及蛋白浓度的调控，实现了对纳米花蛋白空间分布及尺寸的有效调控。基于竞争免疫分析方法，固定在96孔板上的吡虫啉半抗原可以与吡虫啉竞争性地识别吡虫啉抗体。基于抗原与抗体之间的特异性识别作用，引入的hrp@ab
2 pihn可以与吡虫啉抗体结合，从而被固定在96孔板上。由于hrp可以催化h2o2产生羟基自由基，从而将tmb氧化为氧化型tmb(oxtmb)，该物质可以与硫酸反应而在450nm处产生一个较强的吸收峰。当向体系中引入tmb及h2o2后，可以触发显色反应。随着吡虫啉浓度的逐渐增加，反应溶液吸光度的强度逐渐降低。基于此，本发明可以实现对吡虫啉浓度的测定。
21.本发明所述的蛋白分布及尺寸可控的蛋白-无机纳米花具有易制备、表面积大、生物相容性好等特点，可以有效固定生物蛋白及其他功能分子，并增强其稳定性。采用生物酶及抗体作为有机组分制备蛋白-无机纳米花，可以同时实现特异性识别及信号放大，实现了对吡虫啉的高通量、高选择性以及高灵敏度分析，为食品、环境及公共安全的监测提供了新的视角。
22.基于所建立的标准曲线，当ie％在20％～80％范围内，得到吡虫啉的检测范围为0.005～430ng ml-1
，半抑制浓度为0.2ng ml-1
(半抑制浓度为ie％为50％时对应的吡虫啉浓度值)。
23.本发明具有以下特点：
24.(1)蛋白-无机纳米花具有制备简单、生物相容性好、比表面积大的特点，实现了对蛋白的有效固载，并增强了蛋白的稳定性。
25.(2)蛋白-无机纳米花具有蛋白分布及尺寸可调谐的特点，有效地提高了吡虫啉免疫分析的灵敏度。
附图说明
26.图1：实施例1获得的蛋白-无机纳米花的荧光共聚焦图像，其中，fitc表示使用绿
光染料异硫氰酸荧光素(fitc)标记hrp得到的荧光共聚焦图像，rhb表示使用红光染料异硫氰酸罗丹明b(rhb)标记ab2得到的荧光共聚焦图像，merge表示fitc和rhb荧光共聚焦图像合并后的图像；结果表明，两种蛋白(hrp与ab2)在蛋白-无机纳米花中hrp分布在内层，ab2分布在外层，实现了蛋白分布可控。
27.图2：实施例3制备的蛋白-无机纳米花的扫描电镜图；结果表明本发明产物为花状结构，粒径较为均匀，平均尺寸约为5.37μm。
28.图3：实施例5获得的吡虫啉免疫分析标准曲线；标准曲线方程为y＝92.32914-555.10863/{1 (x/8.88509
×
10-8
)
0.17101
}，其中x为吡虫啉的浓度，y为间接竞争效率(ie％)。
具体实施方式
29.实施例1：一种蛋白分布及尺寸可控的蛋白-无机纳米花的制备方法，包括以下步骤：
30.(1)fitc标记hrp(fitc-hrp)与rhb标记ab2(rhb-ab2)的制备方法参照文献chem.mater.2018,30,1069-1077。接下来，使用fitc-hrp和rhb-ab2合成了蛋白-无机纳米花。首先，将30μl、200mmol-1
的硫酸铜水溶液加入到离心管中，向其中加入1ml含1.0mg ml-1
fitc-hrp的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)。涡旋振荡5分钟后，将其静置于4℃反应12小时。
31.(2)取出后，在1000r min-1
下离心1分钟，用去离子水定容至1ml，在1000r min-1
转速下再次离心1分钟，去除上清液。然后，向其中加入1ml含0.25mg ml-1
rhb-ab2的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.0)。涡旋振荡5分钟后，将其静置于4℃反应24小时。再在1000r min-1
转速下离心两次，每次2分钟；然后用去离子水定容至1ml，得到蛋白-无机纳米花溶液，标记为hrp@ab2pihn。将所得样品使用荧光共聚焦显微镜测试，以确定两种蛋白(hrp与ab2)在蛋白-无机纳米花中的分布位置。
32.实施例2：一种蛋白分布及尺寸可控的蛋白-无机纳米花的制备方法，包括以下步骤：
33.(1)首先，将30μl、200mmol-1
的硫酸铜水溶液加入到离心管中，向其中加入1ml含0.1mg ml-1
hrp的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)。涡旋振荡5分钟后，将其静置于4℃反应12小时。
34.(2)取出后，在1000r min-1
下离心1分钟，用去离子水定容至1ml，在1000r min-1
转速下再次离心1分钟，去除上清液。然后，向其中加入1ml含0.25mg ml-1
ab2的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.0)。涡旋振荡5分钟后，将其静置于4℃反应24小时。再在1000r min-1
转速下离心两次，每次2分钟；然后用去离子水定容至1ml，得到尺寸为7.48μm的蛋白-无机纳米花溶液，标记为hrp@ab
2 pihn，放置4℃备用。
35.实施例3：一种蛋白分布及尺寸可控的蛋白-无机纳米花的制备方法，包括以下步骤：
36.(1)首先，将30μl、200mmol-1
的硫酸铜水溶液加入到离心管中，向其中加入1ml含1.0mg ml-1
hrp的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)。涡旋振荡5分钟后，将其静置于4℃反应12小时。
37.(2)取出后，在1000r min-1
下离心1分钟，用去离子水定容至1ml，在1000r min-1
转速下再次离心1分钟，去除上清液。然后，向其中加入1ml含0.25mg ml-1
ab2的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.0)。涡旋振荡5分钟后，将其静置于4℃反应24小时。再在1000r min-1
转速下离心两次，每次2分钟；然后用去离子水定容至1ml，得到尺寸为5.37μm的蛋白-无机纳米花溶液，标记为hrp@ab
2 pihn，放置4℃备用。
38.实施例4：一种蛋白分布及尺寸可控的蛋白-无机纳米花的制备方法，包括以下步骤：
39.(1)首先，将30μl、200mmol-1
的硫酸铜水溶液加入到离心管中，向其中加入1ml含5.0mg ml-1
hrp的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)。涡旋振荡5分钟后，将其静置于4℃反应12小时。
40.(2)取出后，在1000r min-1
下离心1分钟，用去离子水定容至1ml，在1000r min-1
转速下再次离心1分钟，去除上清液。然后，向其中加入1ml含0.25mg ml-1
ab2的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.0)。涡旋振荡5分钟后，将其静置于4℃反应24小时。再在1000r min-1
转速下离心两次，每次2分钟；然后用去离子水定容至1ml，得到尺寸为4.26μm的蛋白-无机纳米花溶液，标记为hrp@ab
2 pihn，放置4℃备用。
41.实施例5：蛋白-无机纳米花在吡虫啉免疫分析中的应用，包括以下步骤：
42.(1)用ph 9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液配置2.5μg ml-1
的吡虫啉半抗原溶液，添加至96孔板中，每孔100μl，在4℃下孵育过夜。使用含有0.05％(w/v)吐温20的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)洗板后，再用2％(w/v)的卵清白蛋白水溶液在37℃下封闭60分钟，每孔250μl。
43.(2)对步骤(1)得到的96孔板使用含有0.05％(w/v)吐温20的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)进行洗板，再将50μl不同浓度的吡虫啉水溶液(浓度分别为0.001、0.002、0.005、0.01、0.1、0.2、1、10、100、1000和10000ng ml-1
)加入到96孔板中，然后加入50μl、5.0μg ml-1
的吡虫啉抗体的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为5.5)，在37℃下反应60分钟；
44.(3)对步骤(2)得到的96孔板使用含有0.05％(w/v)吐温20的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)洗板，再向其中加入100μl、尺寸为5.37μm的hrp@ab
2 pihn溶液，反应40分钟；再次使用含有0.05％(w/v)吐温20的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)洗板，然后加入50μl含有3,3
′
,5,5
′‑
四甲基联苯胺(tmb)和过氧化氢(h2o2)的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液作为底物缓冲液(底物缓冲液中，tmb的浓度为5mg ml-1
，h2o2的浓度为100mmol l-1
)，反应45分钟后加入2mol l-1
硫酸终止反应。
45.(4)使用酶标仪(biotek-800ts)读取步骤(3)反应物溶液450nm处的吸光度值(结果见表1)。以吡虫啉的浓度为横坐标、间接竞争效率(ie％)为纵坐标来构建吡虫啉免疫分析标准曲线；可以看到，随着吡虫啉浓度的增加，ie％逐渐升高；
46.(5)在步骤(2)的操作中将已知浓度的吡虫啉水溶液替换为未知浓度的吡虫啉溶液，其余操作相同，再经过步骤(3)得到反应物溶液；使用酶标仪(biotek-800ts)读取该反应物溶液450nm处的吸光度值，将由吸光度值换算得到的间接竞争效率(ie％)数据代入步骤(4)得到的吡虫啉免疫分析标准曲线，从而计算得到所加入的吡虫啉溶液的浓度，实现本发明产物作为检测试剂在吡虫啉免疫分析中的应用。
47.表1：标准曲线中不同吡虫啉浓度对应的ie％值。
[0048][0049][0050]
实施例6：一种蛋白分布及尺寸可控的蛋白-无机纳米花的制备方法及其在吡虫啉免疫分析中的应用，探究其在实际样品中的应用性。
[0051]
表2：基于蛋白-无机纳米花的免疫分析策略在实际样品中的应用。
[0052][0053]
具体样品为梨汁和人血清(健康的人血样品从吉林大学附属医院获得，符合相关的法律标准和职业道德)。在样品处理前，采用标准加入法，向梨汁和人血清中分别添加吡虫啉，使吡虫啉的终浓度分别为0.01、1和100ng ml-1
。
[0054]
(1)用ph为9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液配置2.5μg ml-1
的吡虫啉半抗原溶液，添加至96孔板中，每孔100μl，在4℃下孵育过夜；使用含有0.05％(w/v)吐温20的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)洗板后，再使用2％(w/v)的卵清白蛋白水溶液在37℃下封闭60分钟，每孔为250μl。
[0055]
(2)对步骤(1)得到的96孔板使用含有0.05％(w/v)吐温20的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)洗板，再将50μl浓度为0.01、1和100ng ml-1
的吡虫啉的梨汁和人血
清溶液分别加入到96孔板中，然后加入50μl、5.0μg ml-1
的吡虫啉抗体的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为5.5)，在37℃下反应60分钟；
[0056]
(3)对步骤(2)得到的96孔板使用含有0.05％(w/v)吐温20的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)洗板，再向其中加入100μl、尺寸为5.37μm hrp@ab
2 pihn，反应40分钟；再次使用含有0.05％(w/v)吐温20的磷酸盐缓冲溶液(0.01mmol-1
，ph为7.4)洗板，然后加入50μl含有3,3
′
,5,5
′‑
四甲基联苯胺(tmb)和过氧化氢(h2o2)的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液作为底物缓冲液，底物缓冲液中tmb的浓度为5mg ml-1
，h2o2的浓度为100mmol l-1
；反应45分钟后加入2mol l-1
硫酸终止反应；
[0057]
(4)使用酶标仪(biotek-800ts)读取步骤(3)反应物溶液450nm处的吸光度值，将由吸光度值换算得到的间接竞争效率(ie％)数据代入实施例2得到吡虫啉免疫分析标准曲线，计算得到所加入的吡虫啉溶液的浓度，从而实现作为检测试剂在吡虫啉免疫分析中的应用。
[0058]
如表2所示，回收率为89.16～105.66％(回收量是指向梨汁和人血清溶液中加入定量的吡虫啉，然后使用本发明所建立的方法对吡虫啉浓度进行计算后得到吡虫啉浓度数值；回收率为回收量与加标量间的比值)，相对标准偏差为0.40～4.15％，在可允许误差范围之内，表明该本发明所述的检测策略在实际样品吡虫啉浓度检测中具有潜在的适用性。