一株具有木材防腐生防功能的木霉菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及一株具有抑制木材腐朽降解的生防菌绿木霉菌株及其应用。


背景技术：

2.木材是一种可再生、节能、可生物降解、对环境友好的产品。随着人们的环保和可持续发展意识的不断增强，木材等生物质材料的可再生性和环境友好性的优势日益受到关注。
3.但木材容易在各种生物因子作用下发生败坏，白腐菌和褐腐菌引起的木材降解是木材利用中的主要败坏类型。腐朽菌可直接分泌酶来消化木材，褐腐是由褐腐菌首先攻击细胞壁的碳水化合物造成的腐朽。而白腐则是由白腐菌同时攻击细胞壁的碳水化合物和木质素形成。白腐菌和褐腐菌主要是担子菌的一些种。所有腐朽在后期都造成了木材强度和其他加工利用性能的剧烈破坏。
4.木材的败坏往往是采用化学防治方法，过去国内防腐剂主要使用砷化铬酸铜(cca)，由于铬和砷都是有害重金属，会对人体及环境造成伤害，目前美国、欧盟及日本等国家相继禁止和限制使用cca处理木材。氨溶烷基胺铜(acq)处理木材具有较好的防腐和防白蚁性能，同时抗流失性能优良，但应用成本高是限制其使用的重要原因。铜唑防腐剂是一种环保型高效防腐剂，广泛应用在木竹材、胶合板和重组木等材料上，已在国内多家企业进行生产应用，但是作为铜系防腐剂，与cca和acq同样具有较深的颜色，处理后的木材不能保持其本色，且对木结构的金属连接件具有腐蚀作用，这在一定程度上限制了此类防腐剂的使用范围，寻求更环保和更生态的保护方法显得尤为重要。
5.木霉属trichoderma pers.(有性阶段曾称为“肉座菌属”hypocrea fr.)隶属于粪壳菌纲sordariomycetes，子囊菌门ascomycota，肉座菌科hypocreaceae，肉座目hypocreales。该属真菌种类繁多，分布广泛，是一类重要的可再生自然资源，具有较高经济价值和应用前景。木霉菌(trichoderma spp.)是一类重要的多功能益生真菌，广泛存在于自然界。其资源丰富，种类众多，不仅能通过多种机制来控制病原菌的侵染和病害发生，还具有促进作物生长、提高作物抗生物和非生物胁迫的能力，是一种公认的环境友好型真菌。其应用于农业、工业、环境保护等领域，其中部分种类对植物病原真菌具有较强的杀伤能力，自1950年代以来，木霉属真菌作为生物防治制剂被广泛使用。以木霉菌这种对人畜无害、多功能、活力强、容易繁殖的微生物为研究对象，具有很强的实践应用意义。而且，木霉菌在自然界广泛分布、生长力旺盛，是理想的生物防治菌类。
6.生物防治微生物在预防木材变色和腐朽时最可能的作用机制是竞争和拮抗。生防菌必须在生长速率上与腐朽菌进行竞赛，在生长及定殖空间上与危害菌进行竞争，或者其对木材危害菌产生毒性，发挥拮抗作用使其不能在木材上正常生长。


技术实现要素：

7.木质文物出土后室内原位保存环境下，一般会定期进行防霉杀菌处理，在这种环
境下能够生存的菌株一般生长能力更强大，所以本研究的木霉菌株来源于广州南越国宫署遗址室内原位保存的木质水槽、木暗渠等木质文物中取得。
8.本发明的目的是提供一株能够抑制木材发生生物降解的菌株。
9.本发明所提供的来自热带地区的一株益生菌株为绿木霉(trichoderma virens)菌株，名称为绿木霉(trichoderma virens)ny45。本发明中采用通过its引物鉴定其种属。对峙生长实验表明，该木霉菌株具有拮抗木材白腐菌、褐腐菌。
10.所述绿木霉(trichoderma virens)ny45是从广州南越国宫署遗址室内原位保存的木质水槽上分离得到，分类名称为绿木霉(trichoderma virens)，已于2021年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为cgmcc no.40004。
11.以上述绿木霉菌ny45为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。
12.绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004在预防木材加工、储运过程中木材腐败和/或变色中的应用也属于本发明的保护范围。
13.绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004在抑制白腐菌和/或褐腐菌中的应用。
14.绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004在防治木材生物降解病害中的应用。所述木材生物降解病害为白腐菌和/或褐腐菌引起的病害。
15.所述白腐菌为彩绒革盖菌(trametes versicolor(l.)lloyd)，所述褐腐菌为密粘褶菌(gloeophylum trabeum(pers.)murrill)。
16.本发明还要求保护一种木材防腐菌剂，其活性成分为绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004。
17.本发明所得的菌株具有生长繁殖快、成本低、抑菌谱宽、对环境友好等优点。该菌株及其代谢产物具有广谱抑制病原真菌活性、能够产生具有抑制病原真菌的活性挥发性天然气体化合物，该菌株能够拮抗木材白腐菌和褐腐菌等生物败坏菌。
18.利用本发明所制得的孢子液处理木材，可使其免遭腐朽菌侵染引起木材腐朽败坏。
19.绿木霉(trichoderma virens)ny45制剂进行生物防治，可防治新鲜木桩上或木材发生腐朽降解。
附图说明
20.图1为绿木霉(trichoderma virens)ny45在pda培养计上的培养性状及显微特征，a为ny45在pda培养基上的菌丝菌落生长性态；b、c和d为显微拍摄其分生孢子和分生孢子梗。
21.图2为绿木霉(trichoderma virens)ny45在不同培养基上的生长性状。mea为麦芽汁琼脂培养基，cya为查氏酵母膏琼脂培养基，g25n为25％甘油硝酸盐琼脂培养基，crea为肌酸琼脂培养基。
22.图3为绿木霉(trichoderma virens)ny45对白腐菌对峙培养分别3d、4d和5d显示的抑制作用。cv为白腐菌彩绒革盖菌(trametes versicolor(l.)lloyd)。
23.图4为绿木霉(trichoderma virens)ny45对褐腐菌对峙培养分别3d、4d和5d显示的抑制作用。gt为密粘褶菌(gloeophylum trabeum(pers.)murrill)。
具体实施方式
24.下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
25.实施例1、绿木霉(trichoderma virens)ny45菌株的分离、纯化和鉴定
26.1)、木霉菌株的筛选
27.现场勘察南越国宫署遗址出土的木质水槽，对其疑似真菌生长症状一一记录拍摄，并用镊子夹取带有疑似组织的少量木材组织；在无菌操作台上挑取少量木材组织浸于浓度0.1％的升汞中表面消毒3～5min，再用无菌水漂洗3遍，然后转移到含50μg
·
ml-1氨苄青霉素的2％琼脂培养基中培养。待琼脂培养基长出菌落，沿菌落边缘挑取单根菌丝在pda培养基上培养以获得纯化菌株；如果发现菌株性状不纯，则重复挑取单根菌丝培养直至获得纯菌株。
28.得到的纯菌株中发现一株生长快速真菌，三天即可长满全皿，命名为ny45。
29.2)、绿木霉(trichoderma virens)ny45菌株的形态特征
30.将绿木霉(trichoderma virens)ny45纯化菌株在pda培养基上培养5～10天，用内径5mm的打孔器打出菌饼，接种在倒有pda培养基的培养皿中，置于温度28℃、相对湿度80％的培养箱内培养，观察各真菌在pda培养基上的菌落生长特性，测量观察各菌在不同培养基上的菌丝长势、菌落形态、菌丝和菌落颜色变化，量取并记录菌落直径，计算每天菌落生长速率(菌落生长速率＝总生长量/生长天数)。
31.绿木霉(trichoderma virens)ny45的基本培养形态特征为：在直径90mm的pda平板上，28℃培养3天后菌落即满皿，平均每天生长速率为3.46cm(表1)。其气生菌丝发达，外缘白色，内缘发浅绿，后期产孢量逐渐加大，孢子堆积，绿色加深。显微观察菌丝灰白色，具分枝，有隔，直或弯曲，光滑；分生孢子梗对称分枝或偶尔轮生分支，一般有2-3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形；分生孢子单孢，椭圆状或球状(图1)。
32.表1.ny45的基本生长性状
[0033][0034]
3)、菌株绿木霉(trichoderma virens)n45的分子鉴定
[0035]
利用通用引物its4、its5扩增木霉its1-5.8s-its2段序列，产物送上海生物工程技术服务有限公司测序，所得序列信息通过trichokey软件进行序列比对，鉴定菌株种类。
[0036]
a.绿木霉(trichoderma virens)ny45基因组dna的提取
[0037]
具体步骤如下：收集分离培养生长在pda培养基上的木霉菌株hb5p-3的菌丝，称取0.1g用液氮研磨，加入已经预热好的ctab提取液(100mmol/l tris-hcl，ph8.0，1.4mol/l nacl，20mmol/l edta,ph8.0，2％ctab)，并添加少许灭菌了的石英砂，在研钵中将菌丝充分研磨后移入离心管中，并在65℃下孵育15分钟，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:
1v/v/v)溶液，用力震荡上下颠倒混匀，12000r/min离心10min，将上清液移入到另一个新离心管中，再加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1v/v/v)溶液，用力震荡上下颠倒混匀，12000r/min离心10min；取上清液到另一个新离心管中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/lnaac溶液(ph5.2)，一20℃放置20min，12000r/min离心5min，弃上清、加70％无水乙醇漂洗两次dna沉淀，离心1min，弃上清，室温风干挥发乙醇，加入灭菌水溶解。放置4℃冰箱过夜溶解；-20℃保存。
[0038]
b.rdna一its区测序分析
[0039]
进一步对该菌株的18s rdna-its序列，its1，5.8s，its2和28s区域部分序列进行扩增鉴定：提取菌株的基因组dna作为模板,采用两条通用引物its5(5'-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3')和its4(5'-tcctccgcttattgatatgc-3')进行pcr扩增，pcr反应体系(25μl):taq酶0.20μl，10xbuffer 2.5μl、dntp 0.2μl、10μl的primer各0.5μl，ddh2o 21.1μl。dna模板25ng pcr扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性30秒，57℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。获得大小约0.6kb的扩增产物。扩增片段克隆后送由上海invitrogen biotechnology co.,ltd进行测序，测序获得643个碱基的its序列，序列如序列表中序列1所示，该序列与不同trichoderma属菌株的rdna-its区序列相似性为98～100％。
[0040]
通过上述表型特征和分子特征鉴定ny45为木霉(trichoderma virens)，名称为绿木霉(trichoderma virens)ny45，已于2021年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为cgmcc no.40004。
[0041]
实施例2、绿木霉(trichoderma virens)ny45菌株的生物学特性
[0042]
麦芽汁琼脂培养基(mea)：麦芽抽提粉20g/l、蛋白胨1g/l、葡萄糖20g/l、琼脂15g/l；查氏酵母膏琼脂培养基(cya)：k2hpo4 1g、查氏浓缩液(nano3 300g/l、kcl 50g/l、mgso4
·
7h2o 50g/l、feso4
·
7h2o 1g/l、znso4
·
7h2o 1g/l、cuso4
·
5h20 0.5g/l)10ml/l、酵母抽提物5g/l、蔗糖30g/l、琼脂15g/l；25％甘油硝酸盐琼脂培养基(g25n)：k2hpo4 0.75g/l、查氏浓缩液7.5ml/l、酵母抽提粉3.7g/l、甘油(分析纯)250g/l、琼脂15g/l；肌酸琼脂培养基(crea)：肌氨酸3g/l、蔗糖30g/l、kcl 0.5g/l、mgso4
·
7h2o 0.5g/l、feso4
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7h2o 0.01g/l、k2hpo4
·
3h2o或者k3po4
·
7h2o 1.3g/l、溴甲酚紫0.05g/l、琼脂15g/l。上述培养基均在121℃，灭菌20min。
[0043]
将绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004分别在含有pda培养基的培养皿中活化，培养3～7d后，用内径为4mm的打孔器沿菌落外沿打菌饼，分别接种到倒有适量cya、mea、g25n和crea的直径为90mm培养基平皿中，每一培养基接种3个菌饼，各菌饼相隔约40mm，每种菌每种培养基设置3个重复，放于28℃、湿度80％培养箱中培养。每天观察各菌在不同培养基上的菌丝长势、菌落形态、菌丝和菌落颜色变化，量取并记录菌落直径，计算每天菌落生长速率(菌落生长速率＝总生长量/生长天数)。
[0044]
表2 ny45在不同培养基上的生长速率和产孢情况
[0045][0046]
注： 表示视野中分生孢子相对较多； 表示视野中分生孢子相对一般； 表示视野中分生孢子相对较少；
‑‑‑
：表示视野中不可见分生孢子。
[0047]
结果如表2所示，mea培养基是以有机氮(蛋白胨)为氮源的培养基，cya以硝酸氮为氮素营养，g25n培养基可以观察菌株对甘油的利用和耐受度，crea以肌氨酸为氮源。ny45菌在mea、cya、crea培养基上的生长速率都较快，与在pda上类似，在g25n培养基上未能生长，说明ny45对甘油比较敏感，甘油能够抑制该菌的生长；在cya培养基上，菌丝发育比较致密，在对氮素营养的需求上，有机氮(蛋白胨)、硝酸氮和肌氨酸都可利用。
[0048]
实施例3、绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004对多种病原菌的拮抗作用的测试
[0049]
1)、绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004对木材腐朽菌的对峙试验
[0050]
将白腐菌彩绒革盖菌(trametes versicolor(l.)lloyd)和褐腐菌密粘褶菌(gloeophylum trabeum(pers.)murrill)在pda培养基中活化，培养3～7d后，用直径为4mm的打孔器沿菌落外沿打菌饼，将绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004yn4-5菌饼与其他菌菌饼一起接种在直径为90mm的pda培养基平皿中，两菌株相隔约40mm，距离培养基边缘约20mm，对照组单独接菌饼在另外pda培养基平皿中央，各重复3皿，放置培养箱中培养，第2天开始每天观察生长情况并并用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率(％)。抑制率＝(对照组菌落直径
–
处理组菌落直径)/对照组菌落直径
×
100％。
[0051]
图3和图4分别显示对白腐菌和褐腐菌的抑制作用，经计算，绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004对白腐菌cv的抑制率为23.8％；对褐腐菌gt的抑制率为52.8％。
[0052]
2)绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004处理木材对腐朽菌的抑菌测试
[0053]
将白腐菌彩绒革盖菌(trametes versicolor(l.)lloyd)、褐腐菌密粘褶菌(gloeophylum trabeum(pers.)murrill)和绿木霉(trichoderma virens)ny45皆活化，参照标准ly/t 1283-2011和gb/t 13942.1-2009，先制备pda培养基，接着将试菌接种到此培养基上，培养7～10天，然后转到砂基培养基中培养，待菌丝长满饲木后，将同一组试样放到盛有用5ml蒸馏水浸泡的滤纸的密闭容器中，放在蒸汽灭菌器中，在105
±
2℃下汽蒸30分钟，冷却后，在无菌条件下，将杨木试件以宽面与培养瓶中被菌丝覆盖的饲木相接触，放在饲木上，每片饲木上放1块试样，每1培养瓶中分别放2块饲木和2块试样，将盛有试样的培养瓶放置于培养室中，保持温度28
±
2℃，相对湿度75～85％，受试菌侵染12周。除检查时必须开灯外，其余时间不开灯。经侵染后，将试样从培养瓶中取出，仔细地刮除试样表面的菌丝和杂质，将试样放到鼓风干燥箱中，在103
±
2℃条件下干燥至恒重，然后逐个称重试样，精确至0.01g。
[0054]
绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004孢子液配置备用：在无菌条
件下用接种针挑取pda上活化的绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004孢子菌丝团，加适量灭菌水，混合均匀，显微镜下用血球计数板计数，然后10x逐级稀释，直到观察孢子液浓度为1～2
×
105个/ml。
[0055]
试样分五组，一组放于接种白腐菌的瓶中，一组放于接种褐腐菌的瓶中，一组放于接种绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004的瓶中，一组将试块经绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004孢子液浸泡后，放置于接种密粘褶菌(gloeophylum trabeum(pers.)murrill)(gt)后的培养瓶中，一组将试块经绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004孢子液浸泡后，放置于接种彩绒革盖菌(trametes versicolor(l.)lloyd)cv后的培养瓶中，侵染培养后，将试样从培养瓶中取出，仔细地刮除试样表面的菌丝和杂质，将试样放到鼓风干燥箱中，在103
±
2℃条件下干燥至恒重，然后逐个称重试样，计算培养前后试块的质量损失率，评价绿木霉(trichoderma virens)ny45抑菌情况。结果见下表3：
[0056]
表3绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004处理杨木对腐朽菌的抑菌测试结果
[0057][0058]
结果表明，杨木在白腐菌cv的侵染下造成59.7％的质量损失率，在褐腐菌gt的侵染下造成45.2％的质量损失率，绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004本身不降解木材，质量损失率仅1.2％，经绿木霉(trichoderma virens)ny45 cgmcc no.40004处理杨木后，其质量损失率均低于10％，达到强耐腐等级。