一种融合蛋白及其应用1.本技术是申请号为2021101929299、发明名称为“连接肽、含有连接肽的融合蛋白及其应用”的中国专利申请的分案申请。
技术领域：
：2.本发明涉及基因工程和酶工程
技术领域：
：，尤其涉及一种连接肽、含有连接肽的融合蛋白及其应用。
背景技术：
：：3.手性醇是药物及化学工业中重要的中间体。利用醇脱氢酶(adh，alcoholdehydrogenase)进行手性醇的生产相较化学法具有一系列的优势：反应具有高度的化学、立体和区位选择性，催化条件温和且催化过程环境友好等。醇脱氢酶在催化醇和醛/酮的相互转化过程中，需要不断地消耗尼克酰胺辅酶nad或nadp。然而辅酶价格昂贵且不稳定，为了降低醇脱氢酶的工业应用成本，需要开发高效的辅酶再生(cofactorregeneration)系统。4.根据再生辅酶的氧化态不同，辅酶再生包括还原型及氧化型辅酶再生两大类。由于醇脱氢酶催化前手性酮生成手性醇应用广泛，还原型辅酶再生的研究已经非常成熟。但有时醇脱氢酶可通过氧化反应对外消旋醇进行动力学拆分，得到相应的手性醇，该反应也具有重要价值，且在此过程中，需要氧化型辅酶的再生。由于nad(p)依赖型脱氢酶大都倾向于还原反应，因此氧化型辅酶nad(p) 的再生要比还原型辅酶nad(p)h的再生复杂得多。5.酶偶联法是应用广泛的辅酶再生方法，其中，底物催化酶作用于目标底物催化目标产物的生成，辅酶循环酶则作用于辅助底物进行辅酶再生。利用基因工程手段将底物催化酶与辅酶循环酶融合，可以实现催化与辅酶再生的双功能，另外，由于两个酶的活性位点接近，可能具有空间靠近效应，从而提高辅酶传递效率。专利申请cn109628419a与cn104845988a涉及乳酸脱氢酶与辅酶循环酶的融合表达，但是他们均利用整细胞催化苯乳酸的生成，未对体外的融合蛋白催化效率进行评价，而整细胞催化为体内催化，与体外游离酶催化辅酶再生有着本质的不同。torrespazmino等构建了baeyer-villiger单加氧酶与亚磷酸脱氢酶的融合蛋白体系，实现了催化与辅酶再生的双功能，但并未发现融合蛋白体系相比等活性单酶混合体系具备辅酶传递的优势(torrespazminode,etal.self-sufficientbaeyer-villigermonooxygenases:effectivecoenzymeregenerationforbiooxygenationbyfusionengineering.angewandtechemieinternationaledition,2008,47:2275-2278)。hoelsch等构建了酮还原酶-甲酸脱氢酶的融合酶，虽然整细胞催化效率高于同时表达单酶的细胞，但细胞粗提液中融合酶的催化效率却稍有下降(hoelschk,etal.enantioselectivereductionofprochiralketonesbyengineeredbifunctionalfusionproteins.biotechnologyandappliedbiochemistry,2010,56:131-140)。这表明，在体外利用融合蛋白实现酶的空间靠近效应仍具有偶然性，融合蛋白的分子设计有可能会对其功能的控制产生重要影响。此外，这些利用融合蛋白实现目标产物的生成及辅酶再生的双功能案例，均为还原型辅酶再生系统，鲜有关于融合蛋白进行氧化型辅酶再生的案例。技术实现要素：6.针对现有的融合酶辅酶再生体系局限于还原型辅酶再生，酶融合后催化特异性常数降低，辅酶循环效率不高的问题，本发明提供了一种连接肽、以及含有该连接肽的融合蛋白及其应用，所述融合蛋白为涉及醇脱氢酶和nad(p)h氧化酶的融合蛋白，该融合蛋白针对氧化型辅酶再生，能够提高醇脱氢酶与nad(p)h氧化酶的活性，改善其催化特性，并通过连接肽的长度调节合理控制两酶之间的距离，在体外实现蛋白的空间靠近效应，提高辅酶的循环效率。进一步利用该融合蛋白高效制备出光学纯的手性醇，简化体系，降低成本，为药物与化学工业的中间体的生产提供新的工具。7.本发明具体技术方案如下：8.1.一种连接肽，其为r0、r1、r2或r3，其中，r0的氨基酸序列为aaa，r1的氨基酸序列为eaaak，r2的氨基酸序列为(eaaak)2，r3的氨基酸序列为(eaaak)3。9.2.一种dna分子，其编码项1所述的连接肽。10.3.项1所述的连接肽在辅酶再生中的应用。11.4.一种融合蛋白，其选自下述中的一种：12.醇脱氢酶-r0-nad(p)h氧化酶、醇脱氢酶-r1-nad(p)h氧化酶、醇脱氢酶-r2-nad(p)h氧化酶、醇脱氢酶-r3-nad(p)h氧化酶、nad(p)h氧化酶-r0-醇脱氢酶、nad(p)h氧化酶-r1-醇脱氢酶、nad(p)h氧化酶-r2-醇脱氢酶和nad(p)h氧化酶-r3-醇脱氢酶。13.5.根据项4所述的蛋白质，其氨基酸序列为选自下述中的一种：14.seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15和seqidno.16。15.6.一种核酸分子，其编码项4或5所述的融合蛋白。16.7.一种载体，其包含项6所述的核酸分子。17.8.一种基因工程菌，其包含项7所述的载体。18.9.项4或5所述的融合蛋白在辅酶再生中的应用。19.10.项4或5所述的融合蛋白在手性二级醇生产中的应用。20.11.一种辅酶再生的方法，其包括：21.使用项4或5所述的融合蛋白将nad(p)h再生为nad(p) 。22.12.根据项11所述的方法，其中，所述融合蛋白为醇脱氢酶-r2-nad(p)h氧化酶。23.13.一种手性二级醇的生产方法，其包括：24.使用项4或5所述的融合蛋白对包含(r)-二级醇和(s)-二级醇的混合物进行手性拆分以获得(r)-二级醇。25.14.根据项13所述的生产方法，其中，所述二级醇为脂肪二级醇或芳基二级醇，优选的，所述芳基二级醇为1-苯乙醇。26.15.根据项13或14所述的生产方法，其中，所述融合蛋白为醇脱氢酶-r2-nad(p)h氧化酶。27.16.项1所述的连接肽在手性二级醇生产中的应用。28.发明的效果29.本发明设计的连接肽，可用于融合蛋白的分子改造。通过对醇脱氢酶(以下也简称为adh)与nad(p)h氧化酶(以下也简称为nox)的融合蛋白的连接肽的设计，使得醇脱氢酶与nad(p)h氧化酶的活性提高，催化特性改善，通过连接肽的长度调节合理控制两个酶之间的距离，在体外实现了空间靠近效应，提高了辅酶的循环效率，实现了高效的氧化型辅酶再生。进一步利用单一融合蛋白能够高效制备出光学纯的手性醇，简化体系，降低成本，为药物与化学工业的中间体的生产提供了新的工具。附图说明30.图1是实施例1中大肠杆菌rosetta(de3)表达融合蛋白的sds-page分析图，其中，图1-1为细胞粗提液上清；图1-2为细胞粗提液上清经85℃热处理上清；条带1为融合蛋白adh-r1-nox，条带2为融合蛋白adh-r2-nox，条带3为融合蛋白adh-r0-nox，条带4为融合蛋白nox-r1-adh，条带5为nox-r2-adh，条带6为nox-r0-adh，条带m为蛋白分子量标准，单位是kda；箭头指出的为目标融合蛋白条带所在的位置。31.图2是实施例1中大肠杆菌rosetta(de3)表达融合蛋白的sds-page分析图，其中，图2-1为细胞粗提液上清；图2-2为细胞粗提液上清经85℃热处理上清；条带1为融合蛋白adh-r3-nox，条带2为融合蛋白nox-r3-adh，条带m为蛋白分子量标准，单位是kda；箭头指出的为目标融合蛋白条带所在的位置。32.图3是实施例4与实施例5中使用融合蛋白进行氧化型辅酶再生生成手性芳基二级醇的反应示意图。33.图4是实施例5中使用融合蛋白催化手性芳基二级醇的生成过程中(s)-1-苯乙醇与(r)-1-苯乙醇的转化率随时间变化的曲线图。具体实施方式34.下面结合附图所描述的实施方式对本发明做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。35.需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。36.本发明提供了一种连接肽，其为r0、r1、r2或r3，其中，r0的氨基酸序列为aaa(seqidno:1)，r1的氨基酸序列为eaaak(seqidno:2)，r2的氨基酸序列为(eaaak)2(seqidno:3)，r3的氨基酸序列为(eaaak)3(seqidno:4)。37.所述连接肽是用于连接两个或以上目标蛋白质或蛋白质结构域的一段氨基酸序列，通常连接肽的长度为3-50个氨基酸。连接肽可以用于连接不同体系的两个或多个蛋白质、多肽、抗体等等，本领域技术人员可以根据所需要连接的蛋白质、多肽、抗体的性质等来选择适当的连接肽。38.本发明提供了一种dna分子，其编码本文所述的连接肽。39.对于编码所述的连接肽的基因没有特别的限制，只要通过翻译能表达出相应的连接肽序列即可。例如，当连接肽为r0时，其核苷酸序列可以为如seqidno:5所示的核苷酸序列，其核苷酸序列如下：40.gcggccgcg(seqidno:5)41.当连接肽为r1时，其核苷酸序列可以为如seqidno:6所示的核苷酸序列，其核苷酸序列如下：42.gaagcggccgcgaaa(seqidno:6)43.当连接肽为r2时，其核苷酸序列可以如seqidno:7所示的核苷酸序列，其核苷酸序列如下：gaagccgcggcgaaagaagcggccgcgaaa(seqidno:7)。44.当连接肽为r3时，其核苷酸序列可以如seqidno:8所示的核苷酸序列，其核苷酸序列如下：gaagccgcggcgaaagaagcggccgcgaaagaagccgcggcgaaa(seqidno:8)。45.本发明提供了上述所述的连接肽在辅酶再生中的应用，例如可以将所述连接肽用于连接醇脱氢酶(adh)和nad(p)h氧化酶(nox)，并将该获得的融合蛋白用于辅酶再生。46.本发明提供了一种融合蛋白，其选自下述中的一种：醇脱氢酶(以下用adh表示)-r0-nad(p)h氧化酶(以下用nox表示)、醇脱氢酶(adh)-r1-nad(p)h氧化酶(nox)、醇脱氢酶(adh)-r2-nad(p)h氧化酶(nox)、醇脱氢酶(adh)-r3-nad(p)h氧化酶(nox)、nad(p)h氧化酶(nox)-r0-醇脱氢酶(adh)、nad(p)h氧化酶(nox)-r1-醇脱氢酶(adh)、nad(p)h氧化酶(nox)-r2-醇脱氢酶(adh)和nad(p)h氧化酶(nox)-r3-醇脱氢酶(adh)。47.当融合蛋白为adh-r0-nox时，其氨基酸序列如seqidno:9所示；当融合蛋白为adh-r1-nox时，其氨基酸序列如seqidno:10所示；当融合蛋白为adh-r2-nox时，其氨基酸序列如seqidno:11所示；当融合蛋白为adh-r3-nox时，其氨基酸序列如seqidno:12所示；当融合蛋白为nox-r0-adh时，其氨基酸序列如seqidno:13所示；当融合蛋白为nox-r1-adh时，其氨基酸序列如seqidno:14所示；当融合蛋白为nox-r2-adh时，其氨基酸序列如seqidno:15所示；当融合蛋白为nox-r3-adh时，其氨基酸序列如seqidno:16所示。48.其中，所述醇脱氢酶(adh)是一类重要的氧化还原酶，催化醇和醛/酮的相互转化，它们广泛分布于各种生物当中，对维持生物的正常生理功能有着重要作用。49.nad(p)h氧化酶(nox)可催化nad(p)h的氧化，通过两电子传递，将分子氧还原至过氧化氢，或通过四电子传递，将分子氧还原至水。nox广泛分布于各种具有不同亲缘关系的物种当中，如人类、脊椎动物、植物、细菌以及古细菌，它们属于嘧啶核苷酸二硫氧化还原酶类，通常需要fad(黄素腺嘌呤二核苷酸)作为第二个辅酶，共价地与n端结构域中高度保守的gxt(h/s)ag基元相结合。50.本发明提供了一种核酸分子，其编码本文的融合蛋白。51.对于编码所述的融合蛋白的核酸分子，本发明没有特别的限制，只要通过翻译能表达出相应的融合蛋白的序列即可。52.例如，当融合蛋白为adh-r0-nox时，其核苷酸序列如seqidno:17所示；当融合蛋白为adh-r1-nox时，其核苷酸序列如seqidno:18所示；当融合蛋白为adh-r2-nox时，其核苷酸序列如seqidno:19所示；当融合蛋白为adh-r3-nox时，其核苷酸序列如seqidno:20所示；当融合蛋白为nox-r0-adh时，其核苷酸序列如seqidno:21所示；当融合蛋白为nox-r1-adh时，其核苷酸序列如seqidno:22所示；当融合蛋白为nox-r2-adh时，其核苷酸序列如seqidno:23所示；当融合蛋白为nox-r3-adh时，其核苷酸序列如seqidno:24所示。53.本发明提供了一种载体，其包含编码上述融合蛋白的核酸分子。54.本发明对于载体不作任何限制，其可以根据需要选择的合适的载体，例如，所述载体可以为质粒。55.本发明提供了一种基因工程菌，其包括上述所述的载体。56.对于基因工程菌，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行确定，例如，所述基因工程菌可以为大肠杆菌。57.本发明提供了一种融合蛋白的构建和表达的方法，其是将连接肽与目的蛋白质进行融合，所构建的融合蛋白是将两个目的蛋白(如adh和nox)通过连接肽按照一定顺序连接而得到的融合蛋白。58.融合蛋白的构建和表达方法是本领域技术人员所熟知的，例如可以采用如下的步骤：59.(1)将编码目的蛋白(如adh和nox)的基因与编码连接肽的基因实现串联连接，构建融合基因，所述的连接的方法包括：设计适当的引物，通过聚合酶链式反应(pcr)方法得到融合基因；也可以采用人工合成的方法直接合成所需的融合基因。60.(2)将(1)中所述的融合基因插入到表达载体的多克隆位点区域，从而得到含有融合基因的表达载体；61.(3)将(2)中所得到的含有融合基因的表达载体转化合适的宿主细胞，获得转化的宿主细胞；62.(4)培养转化的宿主细胞，通过合适的方式诱导融合蛋白的表达；63.(5)从(4)所述的细胞中提取、分离融合蛋白。64.本发明提供了上述所述的融合蛋白在辅酶再生中的应用。65.所述辅酶例如可以为nad 以及nadp ，优选的，本发明通过连接肽将nox融合在adh的c端或n端，能够提高醇脱氢酶与nad(p)h氧化酶的活性以及催化特异性常数，通过连接肽的长度调节合理控制两个酶之间的距离从而提高了辅酶的循环效率。66.本发明使用nad 是启动adh催化的手性二级醇的氧化，而adh在消耗nad 的同时，会生成nadh，利用nox氧化nadh将nad 再生出来，从而实现了辅酶再生，其反应机理示意图如图3所示。由于adh也可利用nadp ，nox也可氧化nadph，因此将上述表述中的nad 替换成nadp ，相应地将nadh替换成nadph同样成立。67.本发明提供了上述所述的融合蛋白在手性二级醇生产中的应用。68.优选的，所述二级醇为脂肪二级醇或者芳基二级醇，优选的,所述芳基二级醇可以为1-苯乙醇。69.本发明通过使用adh来实现手性二级醇的生产，而adh在消耗nad 的同时，会生成nadh，此时利用nox氧化nadh就可以将nad 再生出来，从而在实现手性二级醇生产的同时，实现了辅酶再生，其反应机理示意图如图3所示。由于adh也可利用nadp ，nox也可氧化nadph，因此将上述表述中的nad 替换成nadp ，相应地将nadh替换成nadph同样成立。70.本发明通过使用上述所述的融合蛋白，能够实现手性二级醇例如芳基二级醇或者脂肪二级醇完全的拆分，即实现了单一酶对具有光学活性的二级醇例如芳基二级醇或脂肪二级醇的高效制备。71.本发明提供了一种辅酶再生的方法，其包括使用上述所述的融合蛋白将nad(p)h再生为nad(p) 。72.优选的，所述融合蛋白为adh-r2-nox。73.本发明提供了一种手性二级醇的生产方法，其包括使用上述所述的融合蛋白对包含(r)-二级醇和(s)-二级醇的混合物进行手性拆分以获得(r)-二级醇。74.所述包含(r)-二级醇和(s)-二级醇的混合物既可以是外消旋体(即n(r)-二级醇:n(s)-二级醇＝1:1，也可以不是外消旋体(即二者的摩尔比例不同)，均可实现手性拆分得到(r)-二级醇。75.优选的，所述二级醇为脂肪二级醇或芳基二级醇，优选的，所述芳基二级醇为1-苯乙醇，所述融合蛋白为adh-r2-nox。76.实施例77.下面列举实施例对本发明进行进一步的说明。78.下列实施例中若无特殊说明，均为常规方法。其中，pcr相关试剂来自北京全式金公司；限制性内切酶均购自neb公司(newenglandbiolabs)；t4dna连接酶购自宝生物工程有限公司(takara)；质粒提取试剂盒购自omega公司；pcr产物纯化，酶切产物纯化试剂盒购自上海华舜公司；辅酶nad 及nadh购自roche公司；其他分析纯化学试剂购自sigma公司。79.实施例1醇脱氢酶与nad(p)h氧化酶的融合蛋白构建80.本实施例中涉及的醇脱氢酶与nad(p)h氧化酶均来源于超嗜热菌thermococcuskodakarensiskod1，分别命名为tkadh和tknox，在genebank中的登录号分别为bad85034.1及bad84493.1。81.tkadh和tknox的异源表达及纯化分别参见文献(wuxi,etal.thermostablealcoholdehydrogenasefromthermococcuskodakarensiskod1forenantioselectivebioconversionofaromaticsecondaryalcohols.appliedandenvironmentalmicrobiology,2013,79:2209-2217.)与(wuxi,etal.applicationofanovelthermostablenad(p)hoxidasefromhyperthermophilicarchaeonforregenerationofbothnad andnadp .biotechnologyandbioengineering,2012,109:53-62.)。82.本发明涉及到的融合蛋白的构建，是通过引物和酶切位点的巧妙设计，通过pcr扩增的方法，将编码部分连接肽的基因分别连接至两个目的蛋白基因的一端，再通过酶切与连接，使两个目的蛋白基因之间插入完整的编码目标连接肽的基因，引物组合1中的上游引物如seqidno:25所示，下游引物如seqidno:26所示；83.引物组合2中的上游引物如seqidno:27所示，下游引物如seqidno:28所示；84.引物组合3中的上游引物如seqidno:25所示，下游引物如seqidno:29所示；85.引物组合4中的上游引物如seqidno:30所示，下游引物如seqidno:28所示；86.引物组合5中的上游引物如seqidno:25所示，下游引物如seqidno:31所示；87.引物组合6中的上游引物如seqidno:32所示，下游引物如seqidno:28所示；88.引物组合7中的上游引物如seqidno:25所示，下游引物如seqidno:33所示；89.引物组合8中的上游引物如seqidno:34所示，下游引物如seqidno:28所示；90.引物组合9中的上游引物如seqidno:35所示，下游引物如seqidno:36所示；91.引物组合10中的上游引物如seqidno:37所示，下游引物如seqidno:38所示；92.引物组合11中的上游引物如seqidno:35所示，下游引物如seqidno:39所示；93.引物组合12中的上游引物如seqidno:40所示，下游引物如seqidno:38所示；94.引物组合13中的上游引物如seqidno:35所示，下游引物如seqidno:41所示；95.引物组合14中的上游引物如seqidno:42所示，下游引物如seqidno:38所示；96.引物组合15中的上游引物如seqidno:35所示，下游引物如seqidno:43所示；97.引物组合16中的上游引物如seqidno:44所示，下游引物如seqidno:38所示；98.并且，核苷酸序列(下划线表示酶切位点)如下表所示：99.表1用于融合蛋白表达的质粒构建引物列表100.[0101][0102]具体构建步骤如下：[0103]以含有tkadh编码基因的序列为模板，利用引物组合1进行pcr反应扩增出连接部分连接肽序列的tkadh基因片段，其中，pcr扩增程序如下：98℃预变性30s，然后进入以下30个循环：98℃变性10s，63℃退火30s，72℃延伸45s；循环完毕，72℃延伸10min。[0104]以含有tknox编码基因的序列为模版，利用引物组合2进行pcr反应扩增出连接剩余部分连接肽的tknox基因片段，其中，pcr扩增程序如下：98℃预变性30s，然后进入以下30个循环：98℃变性10s，63℃退火45s，72℃延伸45s；循环完毕，72℃延伸10min。[0105]将扩增出的tkadh片段用ndei及noti，tknox片段用noti及ecori，质粒pet-21b( )(购自novagen)用ndei及ecori进行双酶切后回收，用t4连接酶连接三个片段，构建出含有目的融合蛋白编码基因的质粒pet-21b/adh-r0-nox，并进行酶切及测序验证质粒的正确性。[0106]通过类似的方法，分别使用上述引物组合3-16，成功构建出质粒pet-21b/adh-r1-nox、pet-21b/adh-r2-nox、pet-21b/adh-r3-nox、pet-21b/nox-r0-adh、pet-21b/nox-r1-adh、pet-21b/pet-nox-r2-adh和pet-21b/nox-r3-adh；[0107]将所述质粒转化大肠杆菌rosetta(de3)菌株(购自novagen)，构建出工程菌rosetta(de3)/pet21b/adh-r0-nox、rosetta(de3)/pet21b/adh-r1-nox、rosetta(de3)/pet21b/adh-r2-nox、rosetta(de3)/pet21b/adh-r3-nox、rosetta(de3)/pet21b/nox-r0-adh、rosetta(de3)/pet21b/nox-r1-adh、rosetta(de3)/pet21b/nox-r2-adh和rosetta(de3)/pet21b/nox-r3-adh。[0108]利用下述方法培养基因工程菌：基因工程菌的液体培养基使用lb培养基(含100μg·ml-1氨苄青霉素及34μg·ml-1氯霉素)，摇床转速为170rpm。并利用下述方法诱导培养基因工程菌：从固体平板上接种单菌落至lb培养基中，37℃预培养12-16h，将培养物以1％(v/v)的接种量转接至新鲜的lb培养基中，37℃培养3h左右，待菌体浓度od600达到0.6时，加入终浓度为0.05mm的iptg进行诱导，并转入20℃空气浴摇床继续培养20h。培养结束后，8,000×g，4℃离心10min，收集菌体并用50mmtris-hcl缓冲液(ph8.5)洗涤三次，最后利用含0.1mmfad，100mmnacl的50mmtris-hcl缓冲液(ph8.5)重悬菌体。低温超声破碎所得重悬液，8,000×g，4℃离心10min收集上清获取粗酶液。将融合蛋白的粗酶液经过85℃热处理10min后，15,000×g，4℃离心30min，此步骤可以去除变性沉淀的蛋白，获得上清并浓缩纯化的融合蛋白。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)鉴定(图1和图2)，粗酶液中含有目的融合蛋白，并且经过热处理可以达到较好的纯化效果，进一步的鉴定表明，获得的融合蛋白adh-r0-nox、adh-r1-nox、adh-r2-nox、adh-r3-nox、nox-r0-adh、nox-r1-adh、nox-r2-adh和nox-r3-adh同时具有tkadh和tknox本身具有的活性。[0109]实施例2融合蛋白的活性分析[0110]通过实施例1中的方法，构建并表达融合蛋白adh-r0-nox、adh-r1-nox、adh-r2-nox、adh-r3-nox、nox-r0-adh、nox-r1-adh、nox-r2-adh和nox-r3-adh，通过热处理的方式对融合蛋白进行纯化。为了考察这八种具有不同连接肽长度及融合方向的融合蛋白的活性的本征变化，分别在70℃对其进行醇脱氢酶活性以及nad(p)h氧化酶活性的测定。[0111](1)醇脱氢酶活性的测定[0112]融合蛋白中醇脱氢酶(adh)的活性检测方法如下：反应体系为750μl，包括50mm甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(ph9.0)，100mm(rs)-1-苯乙醇，1mmnad ，加入适量酶液(当测定融合蛋白活性时，酶液为融合蛋白；当测定单酶tkadh活性时，酶液为tkadh)后迅速混合均匀以起始反应，温度为70℃，利用分光光度计(ultrospec3100pro,amershambiosciences,usa)测定1min内340nm下吸光度的变化，nad 在340nm下无吸收，而nadh在340nm下的吸光系数为ε340＝6.22mm-1cm-1。1uadh的活性定义为每分钟还原1μmolnad 所需要的酶量。[0113](2)nad(p)h氧化酶活性的测定[0114]融合蛋白中nad(p)h氧化酶(nox)的活性检测方法如下：反应体系为750μl，包括100mmtris-hcl缓冲液(ph7.0)，0.1mmfad(黄素腺嘌呤二核苷酸)，0.2mmnadh，加入适量的酶液(当测定融合蛋白活性时，酶液为融合蛋白；当测定单酶tknox活性时，酶液为tknox)后迅速混合均匀以起始反应，温度为70℃，利用分光光度计(ultrospec3100pro,amershambiosciences,usa)测定1min内340nm下吸光度的变化，nad 在340nm下无吸收，而nadh在340nm下的吸光系数为ε340＝6.22mm-1cm-1。1unox的活性定义为每分钟氧化1μmolnadh所需要的酶量。[0115]其中，蛋白浓度是以牛血清蛋白(bsa)为标准蛋白，根据bradford的标准方法测定。为了计算融合蛋白的比活性，需分别对融合蛋白进行胶密度扫描，估算出目标蛋白在总蛋白中所占的比例。[0116]分别将经纯化的单酶tkadh(来源于thermococcuskodakarensiskod1的醇脱氢酶，在e.coli中异源表达)与tknox(来源于thermococcuskodakarensiskod1的nad(p)h氧化酶，在e.coli中异源表达)的比活性设为100％，八种融合蛋白的比活性的绝对值如表2所示。[0117]表2单酶及融合蛋白的adh及nox比活性[0118][0119]注:括号内的数值为融合蛋白的比活性相对于对应单酶的比活性的比值。[0120]由表2可以看出，对于nox融合在adh的c端的情况下，当连接肽为r2时，融合蛋白adh-r2-nox的adh部分与nox部分在70℃下的比活性相比单酶tkadh与tknox分别提高了38％与27％；与连接肽为r3的融合蛋白相比，adh部分比活性提高了20％，而nox部分比活性持平。[0121]而对于nox融合在adh的n端的情况下，当连接肽为r2时，融合蛋白nox-r2-adh的adh部分与nox部分在70℃下的比活性相比单酶tkadh与tknox分别提高了1％与116％；与连接肽为r3的融合蛋白相比，adh部分与nox部分比活性分别提高了87％与2％。[0122]综上可见，无论nox融合在adh的c端或n端，连接肽r2的应用，使得融合蛋白中的adh部分与nox部分在70℃下的比活性相较单酶都有不同程度的提高，且都高于相对应的连接肽为r3的融合蛋白，而连接肽为r3的融合蛋白相对略差。[0123]实施例3融合蛋白的动力学参数测定[0124]为了尽可能减小底物在高温下挥发对实验造成的误差，以更好地比较融合蛋白与其等活性单酶混合体系的辅酶再生效率的差异，将反应温度设为40℃。首先测定了融合蛋白在40℃下分别对于辅酶nad 及nadh的动力学参数。醇脱氢酶及nad(p)h氧化酶的活性测定采用的缓冲液为辅酶再生反应将要采用的缓冲液——50mmgly-naoh缓冲液(ph9.0)。[0125]具体方法如下：对于adh部分，缓冲液中加入100mm的(rs)-1-苯乙醇，在0-1.0mm的范围内改变nad 的浓度，测定nad 还原的初始速率；对于nox部分，在0-0.25mm范围内改变nadh的浓度，测定nadh氧化的初始速率。将八种融合蛋白与tkadh在不同nad 浓度下的初始反应速率以及八种融合蛋白与tknox在不同nadh浓度下的初始反应速率分别拟合米氏方程曲线，计算蛋白的动力学参数，结果如表3所示。[0126]表3单酶及融合蛋白对辅酶的动力学参数[0127][0128][0129]注:括号内的数值为融合蛋白的参数值相对于单酶的对应参数值的比值。[0130]从表3可以看出，当连接肽为r3(氨基酸序列为(eaaak)3)时，对融合蛋白adh-r3-nox及nox-r3-adh的动力学分析表明，蛋白融合使adh及nox对辅酶的亲和性降低，且催化特异性常数kcat/km均有所下降。[0131]将连接肽替换为r2(氨基酸序列为(eaaak)2)后，对于nox融合在adh的c端的情况下，即adh-r2-nox，adh部分对nad 的亲和性以及nox部分对nadh的亲和性相较连接肽为r39.0)，其中包含20mm(rs)-1-苯乙醇，100mmnacl，0.2mmnad ，0.17mmfad，以及适量的融合蛋白酶液，反应示意图如图3所示。反应温度为40℃，总反应时间为8h。反应在15ml的带盖试管中进行，样品采取三个平行，置于空气浴摇床中，转速为150rpm。经过合适的反应时间后，从试管中迅速取出100μl反应液置于冰上，利用乙酸乙酯萃取反应液并进行气相色谱的分析，分析条件与实施例4中的分析条件相同。反应过程中(s)-1-苯乙醇与(r)-1-苯乙醇的转化率随时间变化的曲线如图4所示。[0143]从图4可以看出，利用adh-r2-nox融合蛋白体系，经过8小时的反应，(s)-1-苯乙醇的转化率为100％，而(r)-1-苯乙醇没有消耗，即20mm的(rs)-1-苯乙醇实现了完全的拆分，生成了对映体过量值(enantiomericexcess,ee)为》99.8％的(r)-1-苯乙醇，即实现了单一酶对具有光学活性的芳基二级醇的高效制备。[0144]综上所述，本发明所提供的连接肽，可用于融合蛋白的分子改造。将醇脱氢酶与nad(p)h氧化酶通过该连接肽融合，实现了醇脱氢酶与nad(p)h氧化酶的活性提高，改善两酶的催化特性，通过连接肽的长度调节合理控制两酶之间的距离，实现辅酶循环效率的提高。进一步利用该融合蛋白催化包含(r)-二级醇和(s)-二级醇的混合物的动力学拆分，制备出光学纯的手性醇。[0145]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：2.本发明涉及基因工程和酶工程
技术领域：
：，尤其涉及一种连接肽、含有连接肽的融合蛋白及其应用。
背景技术：
：：3.手性醇是药物及化学工业中重要的中间体。利用醇脱氢酶(adh，alcoholdehydrogenase)进行手性醇的生产相较化学法具有一系列的优势：反应具有高度的化学、立体和区位选择性，催化条件温和且催化过程环境友好等。醇脱氢酶在催化醇和醛/酮的相互转化过程中，需要不断地消耗尼克酰胺辅酶nad或nadp。然而辅酶价格昂贵且不稳定，为了降低醇脱氢酶的工业应用成本，需要开发高效的辅酶再生(cofactorregeneration)系统。4.根据再生辅酶的氧化态不同，辅酶再生包括还原型及氧化型辅酶再生两大类。由于醇脱氢酶催化前手性酮生成手性醇应用广泛，还原型辅酶再生的研究已经非常成熟。但有时醇脱氢酶可通过氧化反应对外消旋醇进行动力学拆分，得到相应的手性醇，该反应也具有重要价值，且在此过程中，需要氧化型辅酶的再生。由于nad(p)依赖型脱氢酶大都倾向于还原反应，因此氧化型辅酶nad(p) 的再生要比还原型辅酶nad(p)h的再生复杂得多。5.酶偶联法是应用广泛的辅酶再生方法，其中，底物催化酶作用于目标底物催化目标产物的生成，辅酶循环酶则作用于辅助底物进行辅酶再生。利用基因工程手段将底物催化酶与辅酶循环酶融合，可以实现催化与辅酶再生的双功能，另外，由于两个酶的活性位点接近，可能具有空间靠近效应，从而提高辅酶传递效率。专利申请cn109628419a与cn104845988a涉及乳酸脱氢酶与辅酶循环酶的融合表达，但是他们均利用整细胞催化苯乳酸的生成，未对体外的融合蛋白催化效率进行评价，而整细胞催化为体内催化，与体外游离酶催化辅酶再生有着本质的不同。torrespazmino等构建了baeyer-villiger单加氧酶与亚磷酸脱氢酶的融合蛋白体系，实现了催化与辅酶再生的双功能，但并未发现融合蛋白体系相比等活性单酶混合体系具备辅酶传递的优势(torrespazminode,etal.self-sufficientbaeyer-villigermonooxygenases:effectivecoenzymeregenerationforbiooxygenationbyfusionengineering.angewandtechemieinternationaledition,2008,47:2275-2278)。hoelsch等构建了酮还原酶-甲酸脱氢酶的融合酶，虽然整细胞催化效率高于同时表达单酶的细胞，但细胞粗提液中融合酶的催化效率却稍有下降(hoelschk,etal.enantioselectivereductionofprochiralketonesbyengineeredbifunctionalfusionproteins.biotechnologyandappliedbiochemistry,2010,56:131-140)。这表明，在体外利用融合蛋白实现酶的空间靠近效应仍具有偶然性，融合蛋白的分子设计有可能会对其功能的控制产生重要影响。此外，这些利用融合蛋白实现目标产物的生成及辅酶再生的双功能案例，均为还原型辅酶再生系统，鲜有关于融合蛋白进行氧化型辅酶再生的案例。技术实现要素：6.针对现有的融合酶辅酶再生体系局限于还原型辅酶再生，酶融合后催化特异性常数降低，辅酶循环效率不高的问题，本发明提供了一种连接肽、以及含有该连接肽的融合蛋白及其应用，所述融合蛋白为涉及醇脱氢酶和nad(p)h氧化酶的融合蛋白，该融合蛋白针对氧化型辅酶再生，能够提高醇脱氢酶与nad(p)h氧化酶的活性，改善其催化特性，并通过连接肽的长度调节合理控制两酶之间的距离，在体外实现蛋白的空间靠近效应，提高辅酶的循环效率。进一步利用该融合蛋白高效制备出光学纯的手性醇，简化体系，降低成本，为药物与化学工业的中间体的生产提供新的工具。7.本发明具体技术方案如下：8.1.一种连接肽，其为r0、r1、r2或r3，其中，r0的氨基酸序列为aaa，r1的氨基酸序列为eaaak，r2的氨基酸序列为(eaaak)2，r3的氨基酸序列为(eaaak)3。9.2.一种dna分子，其编码项1所述的连接肽。10.3.项1所述的连接肽在辅酶再生中的应用。11.4.一种融合蛋白，其选自下述中的一种：12.醇脱氢酶-r0-nad(p)h氧化酶、醇脱氢酶-r1-nad(p)h氧化酶、醇脱氢酶-r2-nad(p)h氧化酶、醇脱氢酶-r3-nad(p)h氧化酶、nad(p)h氧化酶-r0-醇脱氢酶、nad(p)h氧化酶-r1-醇脱氢酶、nad(p)h氧化酶-r2-醇脱氢酶和nad(p)h氧化酶-r3-醇脱氢酶。13.5.根据项4所述的蛋白质，其氨基酸序列为选自下述中的一种：14.seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15和seqidno.16。15.6.一种核酸分子，其编码项4或5所述的融合蛋白。16.7.一种载体，其包含项6所述的核酸分子。17.8.一种基因工程菌，其包含项7所述的载体。18.9.项4或5所述的融合蛋白在辅酶再生中的应用。19.10.项4或5所述的融合蛋白在手性二级醇生产中的应用。20.11.一种辅酶再生的方法，其包括：21.使用项4或5所述的融合蛋白将nad(p)h再生为nad(p) 。22.12.根据项11所述的方法，其中，所述融合蛋白为醇脱氢酶-r2-nad(p)h氧化酶。23.13.一种手性二级醇的生产方法，其包括：24.使用项4或5所述的融合蛋白对包含(r)-二级醇和(s)-二级醇的混合物进行手性拆分以获得(r)-二级醇。25.14.根据项13所述的生产方法，其中，所述二级醇为脂肪二级醇或芳基二级醇，优选的，所述芳基二级醇为1-苯乙醇。26.15.根据项13或14所述的生产方法，其中，所述融合蛋白为醇脱氢酶-r2-nad(p)h氧化酶。27.16.项1所述的连接肽在手性二级醇生产中的应用。28.发明的效果29.本发明设计的连接肽，可用于融合蛋白的分子改造。通过对醇脱氢酶(以下也简称为adh)与nad(p)h氧化酶(以下也简称为nox)的融合蛋白的连接肽的设计，使得醇脱氢酶与nad(p)h氧化酶的活性提高，催化特性改善，通过连接肽的长度调节合理控制两个酶之间的距离，在体外实现了空间靠近效应，提高了辅酶的循环效率，实现了高效的氧化型辅酶再生。进一步利用单一融合蛋白能够高效制备出光学纯的手性醇，简化体系，降低成本，为药物与化学工业的中间体的生产提供了新的工具。附图说明30.图1是实施例1中大肠杆菌rosetta(de3)表达融合蛋白的sds-page分析图，其中，图1-1为细胞粗提液上清；图1-2为细胞粗提液上清经85℃热处理上清；条带1为融合蛋白adh-r1-nox，条带2为融合蛋白adh-r2-nox，条带3为融合蛋白adh-r0-nox，条带4为融合蛋白nox-r1-adh，条带5为nox-r2-adh，条带6为nox-r0-adh，条带m为蛋白分子量标准，单位是kda；箭头指出的为目标融合蛋白条带所在的位置。31.图2是实施例1中大肠杆菌rosetta(de3)表达融合蛋白的sds-page分析图，其中，图2-1为细胞粗提液上清；图2-2为细胞粗提液上清经85℃热处理上清；条带1为融合蛋白adh-r3-nox，条带2为融合蛋白nox-r3-adh，条带m为蛋白分子量标准，单位是kda；箭头指出的为目标融合蛋白条带所在的位置。32.图3是实施例4与实施例5中使用融合蛋白进行氧化型辅酶再生生成手性芳基二级醇的反应示意图。33.图4是实施例5中使用融合蛋白催化手性芳基二级醇的生成过程中(s)-1-苯乙醇与(r)-1-苯乙醇的转化率随时间变化的曲线图。具体实施方式34.下面结合附图所描述的实施方式对本发明做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。35.需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。36.本发明提供了一种连接肽，其为r0、r1、r2或r3，其中，r0的氨基酸序列为aaa(seqidno:1)，r1的氨基酸序列为eaaak(seqidno:2)，r2的氨基酸序列为(eaaak)2(seqidno:3)，r3的氨基酸序列为(eaaak)3(seqidno:4)。37.所述连接肽是用于连接两个或以上目标蛋白质或蛋白质结构域的一段氨基酸序列，通常连接肽的长度为3-50个氨基酸。连接肽可以用于连接不同体系的两个或多个蛋白质、多肽、抗体等等，本领域技术人员可以根据所需要连接的蛋白质、多肽、抗体的性质等来选择适当的连接肽。38.本发明提供了一种dna分子，其编码本文所述的连接肽。39.对于编码所述的连接肽的基因没有特别的限制，只要通过翻译能表达出相应的连接肽序列即可。例如，当连接肽为r0时，其核苷酸序列可以为如seqidno:5所示的核苷酸序列，其核苷酸序列如下：40.gcggccgcg(seqidno:5)41.当连接肽为r1时，其核苷酸序列可以为如seqidno:6所示的核苷酸序列，其核苷酸序列如下：42.gaagcggccgcgaaa(seqidno:6)43.当连接肽为r2时，其核苷酸序列可以如seqidno:7所示的核苷酸序列，其核苷酸序列如下：gaagccgcggcgaaagaagcggccgcgaaa(seqidno:7)。44.当连接肽为r3时，其核苷酸序列可以如seqidno:8所示的核苷酸序列，其核苷酸序列如下：gaagccgcggcgaaagaagcggccgcgaaagaagccgcggcgaaa(seqidno:8)。45.本发明提供了上述所述的连接肽在辅酶再生中的应用，例如可以将所述连接肽用于连接醇脱氢酶(adh)和nad(p)h氧化酶(nox)，并将该获得的融合蛋白用于辅酶再生。46.本发明提供了一种融合蛋白，其选自下述中的一种：醇脱氢酶(以下用adh表示)-r0-nad(p)h氧化酶(以下用nox表示)、醇脱氢酶(adh)-r1-nad(p)h氧化酶(nox)、醇脱氢酶(adh)-r2-nad(p)h氧化酶(nox)、醇脱氢酶(adh)-r3-nad(p)h氧化酶(nox)、nad(p)h氧化酶(nox)-r0-醇脱氢酶(adh)、nad(p)h氧化酶(nox)-r1-醇脱氢酶(adh)、nad(p)h氧化酶(nox)-r2-醇脱氢酶(adh)和nad(p)h氧化酶(nox)-r3-醇脱氢酶(adh)。47.当融合蛋白为adh-r0-nox时，其氨基酸序列如seqidno:9所示；当融合蛋白为adh-r1-nox时，其氨基酸序列如seqidno:10所示；当融合蛋白为adh-r2-nox时，其氨基酸序列如seqidno:11所示；当融合蛋白为adh-r3-nox时，其氨基酸序列如seqidno:12所示；当融合蛋白为nox-r0-adh时，其氨基酸序列如seqidno:13所示；当融合蛋白为nox-r1-adh时，其氨基酸序列如seqidno:14所示；当融合蛋白为nox-r2-adh时，其氨基酸序列如seqidno:15所示；当融合蛋白为nox-r3-adh时，其氨基酸序列如seqidno:16所示。48.其中，所述醇脱氢酶(adh)是一类重要的氧化还原酶，催化醇和醛/酮的相互转化，它们广泛分布于各种生物当中，对维持生物的正常生理功能有着重要作用。49.nad(p)h氧化酶(nox)可催化nad(p)h的氧化，通过两电子传递，将分子氧还原至过氧化氢，或通过四电子传递，将分子氧还原至水。nox广泛分布于各种具有不同亲缘关系的物种当中，如人类、脊椎动物、植物、细菌以及古细菌，它们属于嘧啶核苷酸二硫氧化还原酶类，通常需要fad(黄素腺嘌呤二核苷酸)作为第二个辅酶，共价地与n端结构域中高度保守的gxt(h/s)ag基元相结合。50.本发明提供了一种核酸分子，其编码本文的融合蛋白。51.对于编码所述的融合蛋白的核酸分子，本发明没有特别的限制，只要通过翻译能表达出相应的融合蛋白的序列即可。52.例如，当融合蛋白为adh-r0-nox时，其核苷酸序列如seqidno:17所示；当融合蛋白为adh-r1-nox时，其核苷酸序列如seqidno:18所示；当融合蛋白为adh-r2-nox时，其核苷酸序列如seqidno:19所示；当融合蛋白为adh-r3-nox时，其核苷酸序列如seqidno:20所示；当融合蛋白为nox-r0-adh时，其核苷酸序列如seqidno:21所示；当融合蛋白为nox-r1-adh时，其核苷酸序列如seqidno:22所示；当融合蛋白为nox-r2-adh时，其核苷酸序列如seqidno:23所示；当融合蛋白为nox-r3-adh时，其核苷酸序列如seqidno:24所示。53.本发明提供了一种载体，其包含编码上述融合蛋白的核酸分子。54.本发明对于载体不作任何限制，其可以根据需要选择的合适的载体，例如，所述载体可以为质粒。55.本发明提供了一种基因工程菌，其包括上述所述的载体。56.对于基因工程菌，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行确定，例如，所述基因工程菌可以为大肠杆菌。57.本发明提供了一种融合蛋白的构建和表达的方法，其是将连接肽与目的蛋白质进行融合，所构建的融合蛋白是将两个目的蛋白(如adh和nox)通过连接肽按照一定顺序连接而得到的融合蛋白。58.融合蛋白的构建和表达方法是本领域技术人员所熟知的，例如可以采用如下的步骤：59.(1)将编码目的蛋白(如adh和nox)的基因与编码连接肽的基因实现串联连接，构建融合基因，所述的连接的方法包括：设计适当的引物，通过聚合酶链式反应(pcr)方法得到融合基因；也可以采用人工合成的方法直接合成所需的融合基因。60.(2)将(1)中所述的融合基因插入到表达载体的多克隆位点区域，从而得到含有融合基因的表达载体；61.(3)将(2)中所得到的含有融合基因的表达载体转化合适的宿主细胞，获得转化的宿主细胞；62.(4)培养转化的宿主细胞，通过合适的方式诱导融合蛋白的表达；63.(5)从(4)所述的细胞中提取、分离融合蛋白。64.本发明提供了上述所述的融合蛋白在辅酶再生中的应用。65.所述辅酶例如可以为nad 以及nadp ，优选的，本发明通过连接肽将nox融合在adh的c端或n端，能够提高醇脱氢酶与nad(p)h氧化酶的活性以及催化特异性常数，通过连接肽的长度调节合理控制两个酶之间的距离从而提高了辅酶的循环效率。66.本发明使用nad 是启动adh催化的手性二级醇的氧化，而adh在消耗nad 的同时，会生成nadh，利用nox氧化nadh将nad 再生出来，从而实现了辅酶再生，其反应机理示意图如图3所示。由于adh也可利用nadp ，nox也可氧化nadph，因此将上述表述中的nad 替换成nadp ，相应地将nadh替换成nadph同样成立。67.本发明提供了上述所述的融合蛋白在手性二级醇生产中的应用。68.优选的，所述二级醇为脂肪二级醇或者芳基二级醇，优选的,所述芳基二级醇可以为1-苯乙醇。69.本发明通过使用adh来实现手性二级醇的生产，而adh在消耗nad 的同时，会生成nadh，此时利用nox氧化nadh就可以将nad 再生出来，从而在实现手性二级醇生产的同时，实现了辅酶再生，其反应机理示意图如图3所示。由于adh也可利用nadp ，nox也可氧化nadph，因此将上述表述中的nad 替换成nadp ，相应地将nadh替换成nadph同样成立。70.本发明通过使用上述所述的融合蛋白，能够实现手性二级醇例如芳基二级醇或者脂肪二级醇完全的拆分，即实现了单一酶对具有光学活性的二级醇例如芳基二级醇或脂肪二级醇的高效制备。71.本发明提供了一种辅酶再生的方法，其包括使用上述所述的融合蛋白将nad(p)h再生为nad(p) 。72.优选的，所述融合蛋白为adh-r2-nox。73.本发明提供了一种手性二级醇的生产方法，其包括使用上述所述的融合蛋白对包含(r)-二级醇和(s)-二级醇的混合物进行手性拆分以获得(r)-二级醇。74.所述包含(r)-二级醇和(s)-二级醇的混合物既可以是外消旋体(即n(r)-二级醇:n(s)-二级醇＝1:1，也可以不是外消旋体(即二者的摩尔比例不同)，均可实现手性拆分得到(r)-二级醇。75.优选的，所述二级醇为脂肪二级醇或芳基二级醇，优选的，所述芳基二级醇为1-苯乙醇，所述融合蛋白为adh-r2-nox。76.实施例77.下面列举实施例对本发明进行进一步的说明。78.下列实施例中若无特殊说明，均为常规方法。其中，pcr相关试剂来自北京全式金公司；限制性内切酶均购自neb公司(newenglandbiolabs)；t4dna连接酶购自宝生物工程有限公司(takara)；质粒提取试剂盒购自omega公司；pcr产物纯化，酶切产物纯化试剂盒购自上海华舜公司；辅酶nad 及nadh购自roche公司；其他分析纯化学试剂购自sigma公司。79.实施例1醇脱氢酶与nad(p)h氧化酶的融合蛋白构建80.本实施例中涉及的醇脱氢酶与nad(p)h氧化酶均来源于超嗜热菌thermococcuskodakarensiskod1，分别命名为tkadh和tknox，在genebank中的登录号分别为bad85034.1及bad84493.1。81.tkadh和tknox的异源表达及纯化分别参见文献(wuxi,etal.thermostablealcoholdehydrogenasefromthermococcuskodakarensiskod1forenantioselectivebioconversionofaromaticsecondaryalcohols.appliedandenvironmentalmicrobiology,2013,79:2209-2217.)与(wuxi,etal.applicationofanovelthermostablenad(p)hoxidasefromhyperthermophilicarchaeonforregenerationofbothnad andnadp .biotechnologyandbioengineering,2012,109:53-62.)。82.本发明涉及到的融合蛋白的构建，是通过引物和酶切位点的巧妙设计，通过pcr扩增的方法，将编码部分连接肽的基因分别连接至两个目的蛋白基因的一端，再通过酶切与连接，使两个目的蛋白基因之间插入完整的编码目标连接肽的基因，引物组合1中的上游引物如seqidno:25所示，下游引物如seqidno:26所示；83.引物组合2中的上游引物如seqidno:27所示，下游引物如seqidno:28所示；84.引物组合3中的上游引物如seqidno:25所示，下游引物如seqidno:29所示；85.引物组合4中的上游引物如seqidno:30所示，下游引物如seqidno:28所示；86.引物组合5中的上游引物如seqidno:25所示，下游引物如seqidno:31所示；87.引物组合6中的上游引物如seqidno:32所示，下游引物如seqidno:28所示；88.引物组合7中的上游引物如seqidno:25所示，下游引物如seqidno:33所示；89.引物组合8中的上游引物如seqidno:34所示，下游引物如seqidno:28所示；90.引物组合9中的上游引物如seqidno:35所示，下游引物如seqidno:36所示；91.引物组合10中的上游引物如seqidno:37所示，下游引物如seqidno:38所示；92.引物组合11中的上游引物如seqidno:35所示，下游引物如seqidno:39所示；93.引物组合12中的上游引物如seqidno:40所示，下游引物如seqidno:38所示；94.引物组合13中的上游引物如seqidno:35所示，下游引物如seqidno:41所示；95.引物组合14中的上游引物如seqidno:42所示，下游引物如seqidno:38所示；96.引物组合15中的上游引物如seqidno:35所示，下游引物如seqidno:43所示；97.引物组合16中的上游引物如seqidno:44所示，下游引物如seqidno:38所示；98.并且，核苷酸序列(下划线表示酶切位点)如下表所示：99.表1用于融合蛋白表达的质粒构建引物列表100.[0101][0102]具体构建步骤如下：[0103]以含有tkadh编码基因的序列为模板，利用引物组合1进行pcr反应扩增出连接部分连接肽序列的tkadh基因片段，其中，pcr扩增程序如下：98℃预变性30s，然后进入以下30个循环：98℃变性10s，63℃退火30s，72℃延伸45s；循环完毕，72℃延伸10min。[0104]以含有tknox编码基因的序列为模版，利用引物组合2进行pcr反应扩增出连接剩余部分连接肽的tknox基因片段，其中，pcr扩增程序如下：98℃预变性30s，然后进入以下30个循环：98℃变性10s，63℃退火45s，72℃延伸45s；循环完毕，72℃延伸10min。[0105]将扩增出的tkadh片段用ndei及noti，tknox片段用noti及ecori，质粒pet-21b( )(购自novagen)用ndei及ecori进行双酶切后回收，用t4连接酶连接三个片段，构建出含有目的融合蛋白编码基因的质粒pet-21b/adh-r0-nox，并进行酶切及测序验证质粒的正确性。[0106]通过类似的方法，分别使用上述引物组合3-16，成功构建出质粒pet-21b/adh-r1-nox、pet-21b/adh-r2-nox、pet-21b/adh-r3-nox、pet-21b/nox-r0-adh、pet-21b/nox-r1-adh、pet-21b/pet-nox-r2-adh和pet-21b/nox-r3-adh；[0107]将所述质粒转化大肠杆菌rosetta(de3)菌株(购自novagen)，构建出工程菌rosetta(de3)/pet21b/adh-r0-nox、rosetta(de3)/pet21b/adh-r1-nox、rosetta(de3)/pet21b/adh-r2-nox、rosetta(de3)/pet21b/adh-r3-nox、rosetta(de3)/pet21b/nox-r0-adh、rosetta(de3)/pet21b/nox-r1-adh、rosetta(de3)/pet21b/nox-r2-adh和rosetta(de3)/pet21b/nox-r3-adh。[0108]利用下述方法培养基因工程菌：基因工程菌的液体培养基使用lb培养基(含100μg·ml-1氨苄青霉素及34μg·ml-1氯霉素)，摇床转速为170rpm。并利用下述方法诱导培养基因工程菌：从固体平板上接种单菌落至lb培养基中，37℃预培养12-16h，将培养物以1％(v/v)的接种量转接至新鲜的lb培养基中，37℃培养3h左右，待菌体浓度od600达到0.6时，加入终浓度为0.05mm的iptg进行诱导，并转入20℃空气浴摇床继续培养20h。培养结束后，8,000×g，4℃离心10min，收集菌体并用50mmtris-hcl缓冲液(ph8.5)洗涤三次，最后利用含0.1mmfad，100mmnacl的50mmtris-hcl缓冲液(ph8.5)重悬菌体。低温超声破碎所得重悬液，8,000×g，4℃离心10min收集上清获取粗酶液。将融合蛋白的粗酶液经过85℃热处理10min后，15,000×g，4℃离心30min，此步骤可以去除变性沉淀的蛋白，获得上清并浓缩纯化的融合蛋白。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)鉴定(图1和图2)，粗酶液中含有目的融合蛋白，并且经过热处理可以达到较好的纯化效果，进一步的鉴定表明，获得的融合蛋白adh-r0-nox、adh-r1-nox、adh-r2-nox、adh-r3-nox、nox-r0-adh、nox-r1-adh、nox-r2-adh和nox-r3-adh同时具有tkadh和tknox本身具有的活性。[0109]实施例2融合蛋白的活性分析[0110]通过实施例1中的方法，构建并表达融合蛋白adh-r0-nox、adh-r1-nox、adh-r2-nox、adh-r3-nox、nox-r0-adh、nox-r1-adh、nox-r2-adh和nox-r3-adh，通过热处理的方式对融合蛋白进行纯化。为了考察这八种具有不同连接肽长度及融合方向的融合蛋白的活性的本征变化，分别在70℃对其进行醇脱氢酶活性以及nad(p)h氧化酶活性的测定。[0111](1)醇脱氢酶活性的测定[0112]融合蛋白中醇脱氢酶(adh)的活性检测方法如下：反应体系为750μl，包括50mm甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(ph9.0)，100mm(rs)-1-苯乙醇，1mmnad ，加入适量酶液(当测定融合蛋白活性时，酶液为融合蛋白；当测定单酶tkadh活性时，酶液为tkadh)后迅速混合均匀以起始反应，温度为70℃，利用分光光度计(ultrospec3100pro,amershambiosciences,usa)测定1min内340nm下吸光度的变化，nad 在340nm下无吸收，而nadh在340nm下的吸光系数为ε340＝6.22mm-1cm-1。1uadh的活性定义为每分钟还原1μmolnad 所需要的酶量。[0113](2)nad(p)h氧化酶活性的测定[0114]融合蛋白中nad(p)h氧化酶(nox)的活性检测方法如下：反应体系为750μl，包括100mmtris-hcl缓冲液(ph7.0)，0.1mmfad(黄素腺嘌呤二核苷酸)，0.2mmnadh，加入适量的酶液(当测定融合蛋白活性时，酶液为融合蛋白；当测定单酶tknox活性时，酶液为tknox)后迅速混合均匀以起始反应，温度为70℃，利用分光光度计(ultrospec3100pro,amershambiosciences,usa)测定1min内340nm下吸光度的变化，nad 在340nm下无吸收，而nadh在340nm下的吸光系数为ε340＝6.22mm-1cm-1。1unox的活性定义为每分钟氧化1μmolnadh所需要的酶量。[0115]其中，蛋白浓度是以牛血清蛋白(bsa)为标准蛋白，根据bradford的标准方法测定。为了计算融合蛋白的比活性，需分别对融合蛋白进行胶密度扫描，估算出目标蛋白在总蛋白中所占的比例。[0116]分别将经纯化的单酶tkadh(来源于thermococcuskodakarensiskod1的醇脱氢酶，在e.coli中异源表达)与tknox(来源于thermococcuskodakarensiskod1的nad(p)h氧化酶，在e.coli中异源表达)的比活性设为100％，八种融合蛋白的比活性的绝对值如表2所示。[0117]表2单酶及融合蛋白的adh及nox比活性[0118][0119]注:括号内的数值为融合蛋白的比活性相对于对应单酶的比活性的比值。[0120]由表2可以看出，对于nox融合在adh的c端的情况下，当连接肽为r2时，融合蛋白adh-r2-nox的adh部分与nox部分在70℃下的比活性相比单酶tkadh与tknox分别提高了38％与27％；与连接肽为r3的融合蛋白相比，adh部分比活性提高了20％，而nox部分比活性持平。[0121]而对于nox融合在adh的n端的情况下，当连接肽为r2时，融合蛋白nox-r2-adh的adh部分与nox部分在70℃下的比活性相比单酶tkadh与tknox分别提高了1％与116％；与连接肽为r3的融合蛋白相比，adh部分与nox部分比活性分别提高了87％与2％。[0122]综上可见，无论nox融合在adh的c端或n端，连接肽r2的应用，使得融合蛋白中的adh部分与nox部分在70℃下的比活性相较单酶都有不同程度的提高，且都高于相对应的连接肽为r3的融合蛋白，而连接肽为r3的融合蛋白相对略差。[0123]实施例3融合蛋白的动力学参数测定[0124]为了尽可能减小底物在高温下挥发对实验造成的误差，以更好地比较融合蛋白与其等活性单酶混合体系的辅酶再生效率的差异，将反应温度设为40℃。首先测定了融合蛋白在40℃下分别对于辅酶nad 及nadh的动力学参数。醇脱氢酶及nad(p)h氧化酶的活性测定采用的缓冲液为辅酶再生反应将要采用的缓冲液——50mmgly-naoh缓冲液(ph9.0)。[0125]具体方法如下：对于adh部分，缓冲液中加入100mm的(rs)-1-苯乙醇，在0-1.0mm的范围内改变nad 的浓度，测定nad 还原的初始速率；对于nox部分，在0-0.25mm范围内改变nadh的浓度，测定nadh氧化的初始速率。将八种融合蛋白与tkadh在不同nad 浓度下的初始反应速率以及八种融合蛋白与tknox在不同nadh浓度下的初始反应速率分别拟合米氏方程曲线，计算蛋白的动力学参数，结果如表3所示。[0126]表3单酶及融合蛋白对辅酶的动力学参数[0127][0128][0129]注:括号内的数值为融合蛋白的参数值相对于单酶的对应参数值的比值。[0130]从表3可以看出，当连接肽为r3(氨基酸序列为(eaaak)3)时，对融合蛋白adh-r3-nox及nox-r3-adh的动力学分析表明，蛋白融合使adh及nox对辅酶的亲和性降低，且催化特异性常数kcat/km均有所下降。[0131]将连接肽替换为r2(氨基酸序列为(eaaak)2)后，对于nox融合在adh的c端的情况下，即adh-r2-nox，adh部分对nad 的亲和性以及nox部分对nadh的亲和性相较连接肽为r39.0)，其中包含20mm(rs)-1-苯乙醇，100mmnacl，0.2mmnad ，0.17mmfad，以及适量的融合蛋白酶液，反应示意图如图3所示。反应温度为40℃，总反应时间为8h。反应在15ml的带盖试管中进行，样品采取三个平行，置于空气浴摇床中，转速为150rpm。经过合适的反应时间后，从试管中迅速取出100μl反应液置于冰上，利用乙酸乙酯萃取反应液并进行气相色谱的分析，分析条件与实施例4中的分析条件相同。反应过程中(s)-1-苯乙醇与(r)-1-苯乙醇的转化率随时间变化的曲线如图4所示。[0143]从图4可以看出，利用adh-r2-nox融合蛋白体系，经过8小时的反应，(s)-1-苯乙醇的转化率为100％，而(r)-1-苯乙醇没有消耗，即20mm的(rs)-1-苯乙醇实现了完全的拆分，生成了对映体过量值(enantiomericexcess,ee)为》99.8％的(r)-1-苯乙醇，即实现了单一酶对具有光学活性的芳基二级醇的高效制备。[0144]综上所述，本发明所提供的连接肽，可用于融合蛋白的分子改造。将醇脱氢酶与nad(p)h氧化酶通过该连接肽融合，实现了醇脱氢酶与nad(p)h氧化酶的活性提高，改善两酶的催化特性，通过连接肽的长度调节合理控制两酶之间的距离，实现辅酶循环效率的提高。进一步利用该融合蛋白催化包含(r)-二级醇和(s)-二级醇的混合物的动力学拆分，制备出光学纯的手性醇。[0145]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
