抗B7-H3单克隆抗体、抗B7-H3

抗b7-h3单克隆抗体、抗b7-h3
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cd3双特异性抗体、制备方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及免疫及抗体药物领域，特别涉及抗b7-h3单克隆抗体、抗b7-h3
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cd3双特异性抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.在过去几年中，证明治疗性双特异性抗体(bsabs)的发展和效果的报告数量迅速增加。涉及同时调节肿瘤细胞上的两个分子靶标或重定向免疫效应细胞以杀死肿瘤细胞的方法可能在癌症免疫治疗中显示出巨大的潜力。blinatumomab是一种上市的双特异性抗体，靶向急性淋巴细胞白血病患者的t细胞上的cd3和b细胞上的cd19，已在临床中显示出有效的治疗效果。这些有希望的临床数据鼓励研究人员有效地合成和生产稳定的双特异性抗体。
3.目前，各种用于癌症治疗的双特异性抗体正在临床开发中，其中将t细胞重定向到肿瘤细胞的t细胞衔接子(bstces)代表了最大的一组。此外，大多数临床阶段的bstce正在开发用于治疗血液系统恶性肿瘤。实体瘤特有的因素，包括关键组织中的抗原表达、免疫抑制性肿瘤微环境、肿瘤血管系统紊乱以及抗体和效应细胞在肿瘤渗透中的局限性，使得开发用于实体瘤治疗的bstce变得困难。然而，许多靶向实体瘤抗原的bstce，如her2、egfrviii、psma、epcam和cea，正在临床实践中进行评估，并且已经提出了一些证明cd3-双特异性抗体在治疗实体瘤中疗效的证据。
4.b7-h3(cd276)是b7超家族成员，被鉴定为t细胞共刺激和共抑制分子。人b7-h3在体外t细胞增殖、细胞毒性t细胞活化和ifn-γ产生方面表现出积极的调节功能。其他研究也证明了b7-h3的共刺激作用，它被认为与增强肿瘤治疗的疗效以及延长生存期有关。然而，随后的研究表明b7-h3参与了t细胞的抑制，并且正在成为肿瘤进展的重要调节剂。
5.除了免疫调节外，b7-h3通过非免疫反应参与肿瘤进展。已在多种人类实体瘤组织中检测到高b7-h3表达。除了在肿瘤细胞上表达外，b7-h3在肿瘤浸润性树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、肿瘤相关成纤维细胞、内皮细胞和癌症干细胞上过表达。b7-h3异常高表达在多种人类实体癌中被检测到，包括非小细胞肺癌，前列腺癌，胰腺癌，神经母细胞瘤和成神经管细胞瘤，卵巢癌，胃癌，下咽鳞状细胞癌，子宫内膜癌，结直肠癌，肝细胞癌，骨肉瘤，乳腺癌，皮肤黑色素瘤、透明细胞肾细胞癌、头颈癌以及胶质母细胞瘤。此外，在肿瘤浸润性树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、肿瘤相关成纤维细胞、内皮细胞和癌症干细胞上也发现了b7-h3的过度表达。b7-h3在肿瘤组织中的过表达与预后不良、转移增加、临床分期进展和对治疗的抵抗相关。在正常健康组织中表达有限并维持在低水平。总的来说，这些发现表明b7-h3是治疗实体瘤的潜在靶点。
6.目前，许多靶向b7-h3的肿瘤治疗方法已经在临床前或临床试验中进行研究。omburtamab(8h9)是一种人源化亲和力成熟的单克隆抗体(mab)，介导强效抗肿瘤活性并调节b7-h3的免疫抑制功能。一种鞘内注射用131i放射性标记的8h9(131i-8h9)，已经完成治
疗神经母细胞瘤(儿科)的cns/软脑膜转移的关键2期临床试验，并已经提交bla(nct03275402)。131i-8h9针对其他多种类型肿瘤的临床试验也在进行中。enoblituzumab(mga271)通过fc优化设计为具有增强效应功能的抗体，并表现出针对多种肿瘤类型的adcc效应。enoblituzumab分别作为单药，与pd-1抑制剂，或pd-1
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lag-3双特异性抗体联合用药在临床研究中进行评估(nct02982941、nct01391143、nct02475213、nct04634825)。抗体-药物偶联物(adc)mgc018和ds7300a也在晚期实体瘤患者中进行了临床研究(nct03729596,nct04145622)。最近，许多靶向b7-h3的嵌合抗原受体(car)t细胞和双特异性抗体也正在开发中。b7-h3特异性car t细胞局部免疫治疗弥漫性内源性脑桥胶质瘤、弥漫性中线神经胶质瘤和复发性或难治性小儿中枢神经系统肿瘤的临床研究正在进行中(nct04185038)。其中，靶向b7-h3的bstces也在几项临床前研究中展现出抗肿瘤活性，但是到目前为止只有mgd009进入临床研究。mgd009，又称为orlotamab，是一种人源化、带有fc的双亲和重定位(dart)结构分子,该结构中抗cd3(xr32)和抗b7-h3(brca84d)单克隆抗体的人源化fv并列位于fc的n端。而其他研究中设计的抗b7-h3 bstces主要为bite结构分子和通过化学偶联方法制备的抗cd3抗体和抗b7-h3抗体的偶联物。bite结构抗体半衰期较短，而化学偶联方法制备的抗体由于分子量较大、具有较强的免疫原性，这两种结构的抗体在后续应用中都具有局限性。
7.因此，制备并筛选新的抗b7-h3的特异性单克隆抗体，设计构建新型结构的抗b7-h3
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cd3双特异性抗体，具有重要的现实意义。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明提供了抗b7-h3的单克隆抗体和抗b7-h3
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cd3的双特异性抗体。
9.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
10.第一方面，本发明提供了新结构的抗b7-h3
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cd3双特异性抗体，包括：
11.其特征在于，所述双特异性抗体具有不对称结构，其中一条fc片段的n端与能与b7-h3结合的抗体fab片段和能与cd3结合的抗原结合片段相连接，另一条fc片段的n端无抗原结合区域，该两条fc片段通过铰链区二硫键及fc区域氨基酸突变(knobs-into-holes或其他机制)形成异源二聚体。
12.所述双特异性抗体包含三条多肽链：
13.a)所述第一条多肽链从n末端到c末端依次包含vh-b7-h3—ch1—ch2—ch3，所述第二条多肽链从n末端到c末端依次包含vl-b7-h3—cl—linker—cd3 scfv,所述第三条多肽链从n末端到c末端依次包含ch2—-ch3；或
14.b)所述第一条多肽链从n末端到c末端依次包含vl-b7-h3—cl—ch2—ch3，所述第二条多肽链从n末端到c末端依次包含vh-b7-h3—ch1—linker—cd3 scfv,所述第三条多肽链从n末端到c末端依次包含ch2—-ch3；或
15.c)所述第一条多肽链从n末端到c末端依次包含vh-b7-h3—ch1—ch2—ch3，所述第二条多肽链从n末端到c末端依次包含cd3 scfv—linker—vl-b7-h3—cl,所述第三条多肽链从n末端到c末端依次包含ch2—-ch3；或
16.d)所述第一条多肽链从n末端到c末端依次包含vl-b7-h3—cl—ch2—ch3，所述第二条多肽链从n末端到c末端依次包含cd3 scfv—linker—vh-b7-h3—ch1,所述第三条多
肽链从n末端到c末端依次包含ch2—-ch3，
17.其中，所述vh-b7-h3为结合b7-h3的重链可变区，所述vl-b7-h3为结合b7-h3的轻链可变区，所述ch1和ch2和ch3为重链恒定区，所述cl为轻链恒定区；所述cd3 scfv是抗cd3单链抗体，其序列可以是vl-cd3—linker—vh-cd3或vh-cd3—linker—vl-cd3，其中所述vh-cd3为结合cd3的重链可变区，所述vl-cd3为结合cd3的轻链可变区；
18.其中，所述vh-b7-h3与所述vl-b7-h3形成特异性结合b7-h3的抗原结合片段，所述vh-cd3与所述vl-cd3形成结合cd3的抗原结合片段；
19.其中，所述第一条多肽链和所述第三条多肽链通过铰链区二硫键结合，所述第一条多肽链和所述第二条多肽链通过二硫键结合；
20.其中，所述linker为15～25个氨基酸组成的短肽。
21.在本发明的一些具体实施方案中，所述抗b7-h3
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cd3双特异性抗体包括：
22.(i)、所述vl-b7-h3的三个cdr区的氨基酸序列分别具有如seq id no.6、7和8所示的氨基酸序列；和
23.(ii)、所述vh-b7-h3的三个cdr区的氨基酸序列分别具有如seq id no.9、10和11所示的氨基酸序列；
24.或
25.(iii)、(i)或(ii)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(i)或(ii)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；
26.或
27.(iv)、与(i)、(ii)或(iii)所述氨基酸序列具有50％以上同源性的氨基酸序列。
28.具体的，所述vl-b7-h3的三个cdr区包括cdr1、cdr2、cdr3；
29.其中，所述vl-b7-h3 cdr1的氨基酸序列：sssvsy(如seq id no.6所示)；
30.所述vl-b7-h3 cdr2的氨基酸序列：dts(如seq id no.7所示)；
31.所述vl-b7-h3 cdr3的氨基酸序列：qqwssnppt(如seq id no.8所示)；
32.所述vh-b7-h3的三个cdr区包括cdr1、cdr2、cdr3；
33.其中，所述vh-b7-h3 cdr1的氨基酸序列：gytfteyi(如seq id no.9所示)；
34.所述vh-b7-h3 cdr2的氨基酸序列：inpnnggt(如seq id no.10所示)；
35.所述vh-b7-h3 cdr3的氨基酸序列：asrlapstagfay(如seq id no.11所示)。
36.在本发明的一些具体实施方案中，所述抗b7-h3
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cd3双特异性抗体包括：
37.(i)、所述第二条多肽链具有如seq id no.3所示的氨基酸序列；和/或
38.(ii)、所述第一条多肽链具有如seq id no.4所示的氨基酸序列；和/或
39.(iii)、所述第三条多肽链具有如seq id no.5所示的氨基酸序列；和/或
40.(iv)、(i)、(ii)或(iii)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(i)、(ii)或(iii)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；
41.或
42.(v)、与(i)、(ii)、(iii)或(iv)所述氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
43.第二方面，本发明提供了抗b7-h3单克隆抗体，包括
44.(i)、所述单克隆抗体的轻链的三个cdr区分别具有如seq id no.6、7和8所示的氨
87mg、a498、a549、skov3中的一种或多种；
73.(ii)、与细胞表面上的b7-h3和cd3特异性结合；
74.(iii)、具有细胞毒活性；
75.(iv)、诱导t细胞活化和/或促进t细胞增殖；
76.(v)、抑制肿瘤生长；
77.(vi)、杀伤肿瘤细胞；
78.和/或所述抗b7-h3单克隆抗体，或所述抗b7-h3
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cd3双特异性抗体在制备检测肿瘤、免疫相关疾病的试剂或试剂盒中的用途。
79.本发明所称的治疗肿瘤的药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤相关症状的延迟和/或这些症状的严重程度的降低，进一步还包括已存在的肿瘤伴随症状的减轻和防止其他症状的出现，还包括减少或防止肿瘤的转移等。
80.第八方面，本发明提供了药物、药物组合、检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，直接或间接包括所述抗b7-h3单克隆抗体，或所述抗b7-h3
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cd3双特异性抗体、所述核酸分子、所述表达载体、所述宿主、所述结合物或偶联物，以及药学上可接受的辅料；
81.所述药物组合还包括其他任意有效成分；
82.所述检测试剂或检测试剂盒还包括可接受的助剂、辅料或载体。
83.本发明中，所述药物组合中的所述其他任意有效成分本发明不做限定，凡是能与本发明提供的所述抗b7-h3单克隆抗体，或所述抗b7-h3
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cd3双特异性抗体能够联用的药物，均在本发明的保护范围之内。
84.综上，本发明的目的是制备并筛选新的抗b7-h3的特异性单克隆抗体，设计构建新型抗b7-h3
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cd3双特异性抗体，并利用动物模型证明其在实体肿瘤治疗中的应用潜力。
85.本发明通过杂交瘤技术制备抗b7-h3单克隆抗体：使用重组人b7-h3-ecd蛋白(11188-h08h，sinobiological)免疫balb/c小鼠，制备杂交瘤细胞株，使用elisa筛选与重组人b7-h3-ecd蛋白结合的抗b7-h3单克隆抗体，并使用流式细胞术验证单克隆抗体与肿瘤细胞系的结合。我们还通过分子克隆方法获取该抗体的重链轻链可变区序列，通过与抗体文库进行比对证明该抗体为全新的抗b7-h3单克隆抗体。由于靶点b7-h3在免疫及肿瘤发展等方面具有的重要功能，我们认为该单克隆抗体可能在肿瘤及免疫等相关疾病治疗中具有应用价值。此外，治疗性抗体可以通过药物偶联物或联合用药等方式进行疾病治疗，因此本发明请求对该单克隆抗体序列、该单克隆抗体及其衍生品在肿瘤、免疫等相关疾病中的应用进行保护。
86.本发明构建了新型抗b7-h3
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cd3双特异性抗体，其中包括该双特异性抗体的序列及结构。现有的抗b7-h3
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cd3双特异性抗体所使用的抗b7-h3抗体的序列来源并非本发明中的抗体序列，现有已知的双特异性抗体结构中也不包括本发明中构建的双特异性抗体的结构。
87.该双特异性抗体的结构是通过knob into holes技术开发的异二聚体，并通过去除fc(n297a)中的糖基化来消除igg1 fc效应功能。该结构中靶向b7-h3和cd3的结构域位于抗体的同一侧(顺式)，这在之前的研究中被证实有利于介导t细胞的激活和对肿瘤的杀伤。该结构设计为与cd3单价结合，之前的研究表明单价cd3结合相对于双价结合具有更弱的t细胞结合力，这有利于减弱抗体的脱靶毒性。另外，该非对称抗体结构中，第三条多肽链为
独立的fc片段，因此不存在抗体轻链错配的问题，这有利于抗体纯化策略的制订。
88.抗体序列
89.通过分子克隆方法获取该抗体的重链轻链可变区序列，通过与抗体文库进行比对证明该抗体为全新的抗b7-h3单克隆抗体。
90.抗体轻链可变区氨基酸序列：(如seq id no.1所示)
91.divltqtpaimsaspgekvtmtcrasssvsymhwyqqrsgtspktwiydtsklasgvpgrfsgsgsgtsysltisimeaedaatyycqqwssnpptfgggtkleik
92.抗体重链可变区氨基酸序列：(如seq id no.2所示)
93.evqlqqsgpalvkpgtsvkiscktsgytfteyiihwvkqshgkslewigginpnnggtsynqkfkgkatltvdkssstaymelrsltsedsavyycasrlapstagfaywgqgtmltvss
94.新型抗b7-h3
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cd3双特异性抗体的设计与构建：
95.抗b7-h3
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cd3双特异性抗体各链序列如下所示：
96.第二条多肽链：(如seq id no.3所示)
97.mvsywdtgvllcallscllltgsssgdivltqtpaimsaspgekvtmtcrasssvsymhwyqqrsgtspktwiydtsklasgvpgrfsgsgsgtsysltisimeaedaatyycqqwssnpptfgggtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesiteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkggggsggggsggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssypydvpdya-98.第一条多肽链：(如seq id no.4所示)
99.mvsywdtgvllcallscllltgsssgevqlqqsgpalvkpgtsvkiscktsgytfteyiihwvkqshgkslewigginpnnggtsynqkfkgkatltvdkssstaymelrsltsedsavyycasrlapstagfaywgqgtmltvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk-100.第三条多肽链：(如seq id no.5所示)
101.mvsywdtgvllcallscllltgsssgdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkdykddddk
102.本发明构建的新型抗b7-h3
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cd3双特异性抗体在肿瘤治疗中的应用：本发明通过流式细胞术实验证明了该新型双特异性抗体与靶点b7-h3和cd3的特异性结合，通过大量的体外功能研究证明该双特异性抗体可以介导t细胞对肿瘤细胞的杀伤，且在此过程中诱导t细胞活化、增殖和细胞因子的分泌。同时，我们还在免疫系统人源化的ncg小鼠中验证该双特异性抗体对移植瘤的生长抑制作用。
103.本发明构建的新型抗b7-h3
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cd3双特异性抗体在人实体瘤治疗中具有较大的应
用价值。因此要求对该双特异性抗体在肿瘤治疗中的应用进行保护。
104.b7-h3在肿瘤增殖、凋亡、粘附、血管生成、侵袭、迁移和逃避免疫监视中发挥重要作用，且在多种人类实体癌中高表达。b7-h3的过度表达与晚期、较差的临床结果和患者对治疗的抵抗相关。b7-h3在肿瘤进展中的作用使其成为靶向治疗的潜在候选者。在本发明中，我们制备了一种小鼠抗人b7-h3单克隆抗体，并通过基于蛋白质和基于细胞的免疫方法证明了其与b7-h3的结合活性。然后，我们开发了一种靶向cd3和b7-h3的新型双特异性抗体，并证明该抗体通过促进t细胞的活化和增殖，在体外介导针对各种b7-h3阳性肿瘤细胞系的有效细胞毒活性。这种双特异性抗体还在过继转移异种移植小鼠模型中显示出有效的抗肿瘤活性。这些结果表明，新型抗b7-h3
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抗cd3双特异性抗体具有用于治疗b7-h3阳性实体瘤的潜力。
附图说明
105.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
106.图1示b7-h3在人肿瘤细胞系上的表达分析；其中，(a-l)b7-h3在不同细胞系上表达水平(a498、u-87mg、skov3、mda-mb-468、panc-1、a549、bcpap、raji、hepg2、mda-mb-231、aspc-1、k562)通过流式细胞术进行分析；灰色直方图，同型对照；红色直方图，apc结合的抗人cd276(b7-h3)；
107.图2示抗b7-h3抗体10-2#的结合测定；其中，(a)elisa评估10-2#c与人b7-h3重组蛋白的结合(n＝3)；(b-i)通过流式细胞术检测10-2#c与人肿瘤细胞系(u-87mg、mda-mb-231、hepg2、a549、mda-mb-468、skov3、raji、k562)的结合；mfi，平均荧光强度；
108.图3示抗b7-h3/cd3双特异性抗体的制备和表征；其中，(a)抗b7-h3
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cd3结构示意图；该形式包括抗cd3 scfv通过15个氨基酸(g4s)3接头与单价单臂抗b7-h3抗体的轻链连接的；(b)对纯化的抗b7-h3
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cd3进行考马斯蓝染色的sds-page分析，其中包含三个具有以下分子量的链：57、55和28kda；(c和d)使用流式细胞术评估抗b7-h3
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cd3与b7-h3(肿瘤细胞系：u-87mg、a498、mda-mb-231、skov3、hepg2和k562)和cd3(来自两个供体的t细胞)的结合；
109.图4示抗b7-h3
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cd3在体外介导t细胞的细胞毒性；calcein am标记的肿瘤细胞和pbmc(e:t＝10:1)与指定的抗体一起孵育24小时；calcein am阳性细胞被计数为活的肿瘤细胞；计算细胞毒性；其中，(a)通过流式细胞术测量由抗b7-h3
×
cd3或对照抗体介导的pbmc对u-87mg细胞(e:t＝10:1)的细胞毒活性；(b
–
g)抗b7-h3
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cd3显示出对具有不同b7-h3表达水平的多种肿瘤细胞系(u-87mg、a498、skov3、mda-mb-231、hepg2、k562、e:t＝10:1)的细胞毒活性；
110.图5示抗b7-h3
×
cd3在体外诱导t细胞活化和增殖；如方法部分所述，将u-87mg细胞和pbmc与指定的抗体共培养，并分析t细胞活化/增殖；通过流式细胞术分析cd8 和cd4 t亚群中的t细胞活化标志物cd69和grb的表达以及t细胞增殖；使用elisa检测pbmc释放的细胞因子；其中，(a和b)cd4 或cd8 t细胞亚群中cd69和grb阳性细胞的百分比；(c)由指定抗体诱导的pbmc分泌的细胞因子；(a
–
c)数据表示为来自三个代表性实验之一的平均值
±
sem(n＝3)；ns，不显著；*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；(d)使用cfse稀释法检测t细胞增殖，
荧光强度变弱说明细胞增殖；图中显示了cd4 t和cd8 t细胞亚群中cfse标记的t细胞的代表性直方图；
111.图6示抗b7-h3
×
cd3在ncg免疫重建小鼠的异种移植瘤模型中抑制肿瘤生长；其中，(a和c)u-87mg(a)和skov3(c)异种移植模型的示意图；u-87mg或skov3被皮下植入了ncg免疫重建小鼠中；在肿瘤形成后每周两次用pbs和5mg/kg、1mg/kg或0.2mg/kg的抗b7-h3
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cd3处理小鼠；(b和d)每组u-87mg(b)和skov3(d)异种移植物的平均肿瘤生长曲线；生长曲线从抗体治疗后进行统计；每组小鼠数量如图所示；数据显示为平均值
±
sem；
112.图7示两种结构抗b7-h3
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cd3双特异性抗体与cd3(jurkat)的结合力比较；其中，a示抗cd3scfv融合于单价抗b7-h3抗体轻链c端的双特异性抗体结构示意图；b示抗cd3scfv融合于单价抗b7-h3抗体轻链n端的双特异性抗体结构示意图；c示图a(c terminus)和图b(n terminus)所示两种结构的双特异性抗体与靶点cd3的结合力比较，通过流式细胞术检测其与jurkat细胞(cd3 )的结合。
具体实施方式
113.本发明公开了抗b7-h3单克隆抗体、抗b7-h3
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cd3双特异性抗体及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了更容易理解本技术，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其他技术和科学术语都具有本技术所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
114.本发明中，术语“抗体”指免疫球蛋白，通常完整抗体是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为5种，或称为免疫球蛋白的同种型，即igm、igd、igg、iga和ige，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如igg可分为igg1、igg2、igg3、igg4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类ig种每类ig都可以有κ链或λ链。
115.本发明中，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高度特异性地针对单个抗原位点。
116.本发明中，术语“双特异性抗体(双抗)”是指能同时特异性结合两个抗原(靶点)或两种表位的抗体。
117.我们生成了新型抗b7-h3
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抗cd3双特异性抗体(抗b7-h3
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cd3)，例如，本发明的双特异性抗体可以如图7a(3a)或7b所示，其中结合cd3的抗原结合片段融合到结合b7-h3的单价抗原结合片段同侧c端或n端(顺式)。我们比较了这两种结构抗体的cd3结合特性，结果表明，当结合cd3的抗原结合片段位于c末端时，抗体具有较低的t细胞结合能力(图7)，这可能有利于减轻抗体的脱靶毒性。但是，不排除换用其他抗体序列后，cd3结合片段位于n端和
c端时可能具有相似的结合力。
118.本发明中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体中发挥特异性结合抗原功能的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可通过抗体的全长片段来实现。抗体的抗原结合功能也可通过以下来实现：fv，scfv，dsfv，fab，fab’或f(ab’)2的片段的重链，或者，包括fv，scfv，dsfv，fab，fab’或f(ab’)2的片段的轻链。(1)fab片段，通常由vl、vh、cl和ch结构域组成的一价片段；(2)f(ab’)2片段，可包含通过铰链区处的二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(3)由vh和ch结构域组成的fd片段；(4)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；(5)由vh结构域组成的片段；(6)分离的互补决定区(cdr)和(7)可任选地通过接头连接的两个或以上分离的cdr的组合；(8)由vl和vh配对形成的一价单链fv(scfv)；(9)单域抗体vhh。
119.我们在fc域中引入了n297a氨基酸突变，以减少fc区域与fcγr和c1q的结合，因为fc片段与fcγr和c1q结合会导致脱靶毒性效应并阻碍治疗效果。在小鼠实验中，我们观察到给予抗b7-h3
×
cd3治疗的的小鼠的gvhd症状的缓解，一定程度上说明该抗体对小鼠具有较低的毒性。
120.为了检测抗b7-h3
×
cd3的抗肿瘤活性，我们分析了b7-h3在肿瘤细胞表面的表达。结果表明，b7-h3在大多数实体瘤细胞系中高表达，而在血液肿瘤细胞系中表达较少。针对一组肿瘤细胞系的体外细胞毒性分析表明，由抗b7-h3
×
cd3介导的b7-h3和cd3的共同作用导致具有b7-h3高表达的肿瘤细胞的有效裂解。这些结果表明b7-h3的表达水平与抗b7-h3
×
cd3介导的t细胞抗肿瘤活性之间存在显著关系。我们的研究还表明，抗b7-h3
×
cd3介导的抗肿瘤活性伴随着t细胞增殖和激活。
121.在两种肿瘤异种移植模型u-87mg和skov3中评估了抗b7-h3
×
cd3的体内抗肿瘤活性。在肿瘤植入前两周将pbmc接种到免疫缺陷小鼠中，以开发免疫系统人源化小鼠模型。当肿瘤体积达到约150mm3时，给予抗b7-h3
×
cd3治疗。我们观察到两种异种移植模型中已建立肿瘤的消退和根除。结果表明，抗b7-h3
×
cd3可有效抑制肿瘤生长，延长肿瘤小鼠的生存期。
122.总之，本发明制备了一种新型的b7-h3特异性的双特异性抗体。本发明中开发的双特异性抗体双特异性抗体可介导针对来自广泛肿瘤亚型的b7-h3阳性人类肿瘤细胞系的强大体外抗肿瘤活性。抗b7-h3
×
cd3在人pbmc移植的小鼠中表现出对肿瘤生长的有效抑制。我们的研究支持抗b7-h3
×
cd3是治疗b7-h3阳性实体瘤的有前途的治疗策略的假设。
123.本发明所涉及到的细胞系：人类肿瘤细胞系a498、skov3、mda-mb-468、a549、hepg2、bcpap和raji来自atcc。u-87mg、panc-1、mda-mb-231、aspc-1和k562来自ncacc。细胞培养在37℃和5％co2的培养箱中。a498、u-87mg、skov3、mda-mb-468、panc-1、a549、bcpap、mda-mb-231、hepg2和aspc-1在补充有100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清(fbs)的dmem中培养。k562和raji培养在含有100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％fbs的1640培养基中。freestyle
tm 293t细胞购自thermo fisher scientific，在freestyle
tm 293培养基中置于37℃、8％co2和120rpm条件下培养。
124.本发明提供的抗b7-h3单克隆抗体、b7-h3
×
cd3双特异性抗体的生产制备及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
125.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
126.实施例1抗b7-h3单克隆抗体和双特异性抗体的生产
127.二价抗b7-h3抗体使用杂交瘤技术制备。用重组人b7-h3-ecd蛋白(11188-h08h，sinobiological)免疫balb/c小鼠，并使用elisa进行蛋白质结合和流式细胞术进行细胞结合筛选抗b7-h3的亲本单克隆抗体。嵌合单克隆抗体(10-2#c)是通过将轻链可变区(vl)序列与人kappa恒定区融合并将重链可变区(vh)序列与人igg1恒定区融合而产生的。
128.抗b7-h3
×
cd3结构是通过knob-into-holes(kih)技术开发的异二聚体结构，并通过去除fc(n297a)中的糖基化来去除igg1 fc的效应功能。hole链是在fc区进行突变的(n297a、t366s、l368a和y407v)10-2#c的重链。knob链是带有突变(n297a和t366w)的igg1 fc片段。轻链由huokt3scfv(genbank:and42858.1)通过15-氨基酸(g4s)3接头与10-2#c轻链的c端融合构建。
129.实施例2抗体表达和纯化
130.编码重链和轻链的dna片段由genewiz(azenta life sciences)合成并克隆到pcdna3.1 表达载体中。通过pei转染在freestyletm 293t细胞(thermo fisher scientific)中表达抗体。转染后7天收集上清液，通过蛋白a亲和层析(thermo fisher scientific)纯化抗体，之后使用抗flag亲和凝胶(碧云天)对亲和层析产物进一步纯化(knob fc片段c端带有flag标签)，使用sds电泳分析蛋白质样品。
131.实施例3原代细胞的制备
132.使用ficoll-hypaque密度梯度离心法(tbdscience，天津，中国)从健康供体的血液中分离外周血单个核细胞(pbmc)。pbmc在补充有100u/ml青霉素、100u/ml链霉素和10％热灭活fbs的imdm培养基(hyclone)中培养。根据制造商的方案，使用人cd3 t细胞分离试剂盒(480022；biolegend)通过阴性选择从pbmc中分离人cd3 t细胞。使用流式细胞术测试预选择和后选择(阳性和阴性级分)纯度。
133.实施例4细胞结合测定
134.将肿瘤细胞系、cd3 t细胞分别与连续稀释的指定浓度(0.0001
–
100μg/ml)的抗b7-h3单克隆抗体和抗b7-h3
×
cd3在冰上孵育1小时，然后用apc-抗人igg(409306，biolegend)在黑暗中孵育30分钟。通过流式细胞术(cytoflex lx，beckman coulter)测定细胞结合活性。使用cytexpert(beckman coulter)分析数据。
135.实施例5体外杀伤实验
136.用2μm calcein-am(425201，biolegend)标记的靶细胞(5
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103–1×
104)与效应细胞及指定浓度(0.00001
–
1000ng/ml)的抗b7-h3
×
cd3或其他抗体(抗cd3和抗b7-h3单克隆抗体或其混合物)在37℃下共培养12-24小时。来自健康供体的pbmc或cd3 t细胞用作效应细胞，效应细胞与靶标(e:t)的比例设置为10:1。共培养后，收集细胞并使用流式细胞术(cytoflex lx，beckman coulter)进行分析。calcein-am 细胞被评估为活靶细胞，没有抗体的组被分析为对照。细胞死亡率x(％)使用以下公式计算：(100-x中的calcein-am阳性活细胞数/对照中的calcein-am阳性细胞数)
×
100。数据表示为三次重复孔的平均值
±
标准误差。
137.实施例6t细胞活化测定和细胞因子释放测定
138.对于t细胞活化测定，pbmc或cd3 t细胞与肿瘤细胞(e:t＝10:1)和1μg/ml抗b7-h3
×
cd3或其他抗体(抗cd3和抗-b7-h3单克隆抗体或混合物)在96孔平底培养板中培养24小时。部分细胞用apc-anti-human cd4(357408,biolegend)、pc5.5-anti-human cd8
(344710,biolegend)和pe-anti-human cd69(310906,biolegend)暗处染色30分钟。另一部分细胞用apc-抗人cd4(357408，biolegend)、pc5.5-抗人cd8(344710，biolegend)染色，然后固定和透化，然后用pe-抗人/小鼠grb染色(372208，biolegend)。使用流式细胞术检测以上指标。同样的前期处理，并在细胞培养48小时后收集无细胞上清液，检测细胞因子的释放。il-2(431804,biolegend)、il-6(430504,biolegend)和ifn-γ(430104,biolegend)的水平使用elisa试剂盒，根据说明进行测量。
139.实施例7t细胞增殖检测
140.使用cfse稀释法检测t细胞增殖。u-87mg细胞(1
×
104)与cfse(423801,biolegend)标记的人cd3 t细胞(e:t＝10:1)共同孵育，并加入1μg/ml抗b7-h3
×
cd3或其他抗体(抗cd3和抗b7-h3单克隆抗体体或混合物)在96孔平底板中培养5天。然后收集细胞并用apc-抗人cd4和pc5.5-抗人cd8抗体染色。t细胞增殖通过cfse稀释确定，荧光强度变弱的细胞为增殖细胞，使用流式细胞术进行分析。
141.实施例8体内异种移植模型
142.在将5
×
106个u-87mg或skov3细胞皮下植入小鼠右腹侧大约两周前，ncg小鼠(6-8周龄)通过尾静脉静脉接种8
×
106个hpbmc。当肿瘤体积达到约150mm3时，将小鼠随机分组并用抗b7-h3
×
cd3(5mg/kg、1mg/kg和0.2mg/kg)治疗。每周两次腹腔内注射药物，最多20天。每三天测量体重、肿瘤长轴的最大长度(l，mm)和短轴的最大长度(w，mm)。通过测量肿瘤体积来评估抗肿瘤活性。使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝l
×
w2
×
1/2。当肿瘤体积超过1500mm3时，将小鼠安乐死。
143.效果例1b7-h3表达分析
144.b7-h3在各种人类癌症中高度表达。为了分析b7-h3在细胞系中的表达，我们使用流式细胞术对来自不同肿瘤系统的人类肿瘤细胞系进行了表征。如图1a-1l所示，大多数实体肿瘤细胞系被鉴定为b7-h3表达阳性；然而，血液肿瘤肿瘤细胞系(k562、raji)表现出较低的表达，其中raji细胞几乎不表达。
145.效果例2抗b7-h3单克隆抗体制备
146.本发明通过杂交瘤技术制备抗b7-h3单克隆抗体：使用重组人b7-h3-ecd蛋白(11188-h08h，sinobiological)免疫balb/c小鼠，并制备杂交瘤细胞株，使用elisa筛选与重组人b7-h3-ecd蛋白结合的抗b7-h3单克隆抗体，并使用流式细胞术验证单克隆抗体与肿瘤细胞系的结合。单克隆抗体单克隆抗体我们获得了单克隆抗体10-2#，然后我们通过将10-2#vl序列与人κ恒定区融合并将10-2#vh与人igg1恒定区融合来产生嵌合抗体10-2#c。10-2#c与人b7-h3蛋白结合，ec50值为2.216ng/ml(图2a)。该抗体对b7-h3阳性肿瘤细胞(u-87mg、a498、a549、skov3)显示出高结合活性，对b7-h3低表达的细胞株(k562和raji)结合力较弱，其中对raji细胞几乎不结合(图2b-2i)。本发明所制备单克隆抗体可以特异性结合人肿瘤细胞系表面的b7-h3。
147.效果例3抗b7-h3
×
cd3的制备和表征
148.为了开发用于b7-h3靶向免疫疗法的双特异性抗体，我们构建了一种新型双特异性抗体，其中一个抗cd3 scfv(okt3)连接到单价单臂抗b7-h3抗体轻链的c端(图3a或7a)或n端(图7b)。knobs-into-holes技术用于不对称结构的重链异二聚化。双特异性抗体在n297位点进行特定氨基酸置换以沉默fc效应子功能。不对称双特异性抗体通过三种质粒在293f
细胞中的共同瞬时表达产生，并通过蛋白a亲和层析和抗flag亲和凝胶进行纯化。sds-page分析显示抗体的三个条带具有高纯度和正确的分子量：57kda hole链、28kdaknob链和53kda轻链(图3b)。在流式细胞术分析中，抗b7-h3
×
cd3对b7-h3阳性细胞系(u-87mg、a498、skov3和mda-mb-231)显示出高结合活性，但对b7-h3阴性或低表达细胞系结合力较弱(k562和raji)(图3c)。同时该抗体可以以剂量依赖性方式与人cd3 t细胞结合(图3d)。因此，抗b7-h3
×
cd3表现出与细胞表面的b7-h3和cd3特异性结合的能力。
149.效果例4抗b7-h3
×
cd3在体外介导t细胞对b7-h3阳性肿瘤细胞的细胞毒性
150.然后我们评估了由抗b7-h3
×
cd3介导的b7-h3阳性肿瘤细胞和t细胞的结合是否可以触发肿瘤细胞裂解。首先针对b7-h3高表达细胞系u-87mg评估细胞毒性作用的效力。结果显示抗b7-h3
×
cd3介导的t细胞对u-87mg细胞的细胞毒性是显著的，并且u-87mg细胞以剂量依赖性方式被杀伤(图4a、4b)。
151.接下来，我们测试了抗b7-h3
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cd3对b7-h3低表达肿瘤细胞系k562和具有不同b7-h3表达水平的多种肿瘤细胞系(a498、skov3、mda-mb-231和hepg2)的细胞毒性。数据显示，抗b7-h3
×
cd3导致b7-h3低表达肿瘤细胞系k562中细胞的最小裂解。然而，它介导高水平表达b7-h3的多种肿瘤细胞系(a498、skov3和mda-mb-231)的细胞死亡(图4b-4g)。这些数据表明抗b7-h3
×
cd3介导的细胞毒性活性是b7-h3特异性的，其效力取决于b7-h3的表达水平。
152.综上，我们在体外评估新型b7-h3
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cd3双特异性抗体对肿瘤细胞系的杀伤能力，结果表明，相对于抗b7-h3单克隆抗体或/与抗cd3抗体处理，单独使用该新型b7-h3
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cd3双特异性抗体对肿瘤细胞的杀伤更显著。且该抗体的杀伤能力与细胞表面b7-h3的表达量呈正相关。
153.效果例5抗b7-h3
×
cd3诱导t细胞活化并促进t细胞增殖
154.t细胞活化通过活化标志物的表达和细胞因子的产生来评估。在存在抗b7-h3
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cd3的情况下，cd8 t细胞亚群显示出早期激活标记物cd69和细胞毒性颗粒颗粒酶b(grb)的高表达。cd4 t细胞也显示出cd69和grb表达的上调(图5a、5b)。在抗b7-h3
×
cd3介导肿瘤细胞裂解后，许多细胞因子被释放到培养物上清液中。此外，与在b7-h3或/和cd3单克隆抗体组中观察到的相比，抗b7-h3
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cd3诱导了更多的il-2产生(图5c)。图5d表明抗b7-h3
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cd3可以促进cd4 和cd8 t细胞增殖。这些结果表明，抗b7-h3
×
cd3通过上调细胞因子(ifn-γ、il-2和il-6)和t细胞激活标志物(cd69和颗粒酶b)的分泌来激活t细胞，并且可以介导cd8和cd4 t细胞亚群的增殖。抗b7-h3
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cd3活性伴随着t细胞的扩增和激活。
155.效果例6抗b7-h3
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cd3在多种体内异种移植模型中抑制肿瘤生长
156.为了确定抗b7-h3
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cd3的体内抗肿瘤效果，使用胶质母细胞瘤细胞系u-87mg和卵巢癌细胞系skov3在人pbmc重建小鼠(hupbmc-ncg)中建立异种移植瘤模型。将u-87mg或skov3细胞(5
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106)皮下植入hupbmc-ncg小鼠中。待肿瘤达到约150mm3后，用一定剂量的抗b7-h3
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cd3或抗b7-h3单克隆抗体(腹腔注射，2次/周
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3周)治疗。每三天评估小鼠的肿瘤体积(图6a、6c)。图6总结了这些实验的结果。在这两种模型中，pbmc输注都抑制了肿瘤的发生。与在对照组中观察到的相比，双特异性抗体治疗对肿瘤生长的抑制作用是显著的。如图6b所示，在注射3或5次100μg抗b7-h3
×
cd3(5mg/kg组)后，u-87mg异种移植物被完全消除)。在用1mg/kg和0.2mg/kg抗b7-h3
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cd3治疗的组中，大多数小鼠观察到异种移植的完全消除(1mg/kg组的4/6，0.2mg/kg组的5/7)组)，少数呈小结节(1mg/kg组的2/6，0.2mg/kg组的2/
7)(图6b)。在skov3异种移植模型中，来自两个供体的pbmc用于重建小鼠免疫系统。根据肿瘤生长曲线，无论pbmcs的来源如何，所有用双特异性抗体治疗的小鼠的肿瘤都被完全消除(图6d)。这些实验结果表明，抗b7-h3
×
cd3可有效介导体内异种移植模型的抗肿瘤活性。
157.综上，我们在人pbmc重建的的ncg小鼠中评估新型b7-h3
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cd3双特异性抗体的体内肿瘤抑制作用。结果表明，该新型b7-h3
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cd3双特异性抗体可以有效抑制小鼠体内人胶质瘤细胞系u-87mg和卵巢癌细胞系skov3异种移植瘤的生长。
158.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。