一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法与流程

一种含干扰素
α
的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，pedv），猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus，pdcov）以及猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus tgev）三种冠状病毒的联合感染或者单独感染是养殖业的天敌。
3.干扰素α（ifnα）具有抗病毒、抗肿瘤、抗增殖和免疫调节作用。目前，猪 α-干扰素在大肠杆菌、毕赤酵母和动物细胞等表达系统中均实现了表达。重组猪 α-干扰素蛋白活性分析表明其对口蹄疫病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪伪狂犬病病毒等均具有抑制作用，并与多种抗原配伍免疫具有免疫佐剂功能，因此，作为广谱抗病毒药可用于猪病毒性疾病的防治。但是干扰素α在体内的半衰期较短限制其应用，所以有必要开发ifnα长效蛋白药物。
4.近年来，ifnα半衰期的研究取得了很大的进展，许多技术已经被提出并测试延长治疗性蛋白的作用时间，如与其他蛋白基因融合（免疫球蛋白域或血清蛋白，如白蛋白）、与聚合物结合（peg化修饰等）。但以上方法均降低了干扰素α的活性。因此，亟需开发了一种新型的不降低干扰素α活性的长效策略。
5.猪冠状病毒在感染宿主后能抑制机体的天然免疫反应，从而导致病毒的免疫逃逸和持续性感染。已有研究表明，非结构蛋白nsp5蛋白在这方面起到重要作用。nsp5是一种与微rna病毒3c蛋白酶类似的蛋白酶，称为3c样蛋白酶。该蛋白酶具有切割活性，可以将多聚前体蛋白切割为成熟的非结构蛋白。除了具有切割活性外，还发现冠状病毒的nsp5是一种干扰素的拮抗分子，识别nemo等先天免疫分子上的特异位点并切割，阻止干扰素的合成，在病毒的免疫调控中发挥重要作用。
6.为了降低nsp5诱导的免疫抑制，因此，开发nsp5分子抑制剂一直是目前研究抗猪冠状病毒药物的重点。
7.因此，降低冠状病毒的免疫逃逸，提高ifnα长效蛋白的活性，是目前的亟需解决的技术难题。


技术实现要素：

8.针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种重组猪血清白蛋白-冠状病毒nsp5切割位点-干扰素α融合蛋白制备（以下简称“rpoalb-nsp5 site-ifnα”）及猪冠状病毒治疗上的应用，实现以下发明目的：提高融合蛋白的抗病毒活性，延长融合蛋白的半衰期，减缓其活性的下降。
9.为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种含干扰素α的融合蛋白，该融合蛋白由以下模块依次串联得到：猪血清白蛋白rpoalb、冠状病毒nsp5切割位点nsp5 site、干扰素α融合蛋白ifnα依次串联构成。
10.以下是对上述技术方案的进一步改进：所述rpoalb的核酸序列如序列表中seq id no.3所示；所述nsp5 site的核酸序列如序列表中seq id no.4所示；所述ifnα的核酸序列如序列表中seq id no.5所示。
11.该融合蛋白的核酸序列如序列表中seq id no.1所示；该融合蛋白的氨基酸序列如序列表中seq id no.2所示。
12.一种表达所述融合蛋白的重组菌株，所述重组菌株为重组毕赤酵母。
13.所述重组毕赤酵母的保藏号为cctcc no：m 20211522。
14.所述制备方法包括一级种子繁殖、二级种子繁殖、一级发酵、二级发酵、纯化。
15.所述一级种子繁殖，将表达融合蛋白的重组毕赤酵母冻干菌种，接种于ypd液体培养基，27-29℃、200-250r/min摇床振荡培养过夜，作为一级种子；所述冻干菌种与ypd液体培养基的质量体积比为1g：45-55ml。
16.所述二级种子繁殖，将一级种子按1.5%的体积比接种于ypd液体培养基，27-29℃、200-250r/min摇床振荡培养23-25h，作为二级种子。
17.所述一级发酵，将二级种子按照2%（v/v）的接种量接入含0.05%（v/v）的bmgy培养基中，接种后将溶氧控制30%～100%，通风量1:1～1:1.5，转速200-250rpm，发酵温度为27.5-28.5℃，发酵至od值长到1.2以上。
18.所述二级发酵，将一级发酵后的液体全部接种到含0.05%（v/v）的bmmy培养基中，接种后将溶氧控制30%～100%，通风量1:1～1:1.5，转速200-250rpm，温度全程控制到27.5-28.5℃，全程控制ph 5.7-5.8，培养到19-21h流加1%（v/v）甲醇，培养到67-69h，得到二级发酵液。
19.本发明表达rpoalb
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nsp5 site-ifnα的重组毕赤酵母x-33-chifnα，分类命名为：毕赤酵母pichia pastoris，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2021年12月1日，保藏编号为cctcc no：m 20211522。
20.相对于现有技术，本发明的有益效果在于：（1）本发明的rpoalb
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nsp5 site-ifnα融合蛋白，猪血清白蛋白作为天然的蛋白质分子具有超长的半衰期与ifnα融合表达可以有效延长ifnα半衰期。冠状病毒nsp5切割位点(klaqlqvayhq)的共表达，一方面使部分nsp5作用于融合蛋白，避免nsp5对nemo等先天免疫分子切割，从而解除ifn-i信号通路的抑制，阻断冠状病毒的免疫逃脱。另一面nsp5切割冠状病毒nsp5切割位点，可以释放出ifnα，激活jak-stat信号通路，诱导直接发挥抗病毒效应的干扰诱导基因(interferon stimulated genes，isgs)的表达，促进机体抵抗病毒能力，提高干扰素疗法清除病毒效果。
21.本发明所述rpoalb-nsp5 site-ifnα融合蛋白，对水泡性口炎病毒的抗病毒活性为3.25
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10
6 iu /ml；本发明所述rpoalb-nsp5 site-ifnα融合蛋白，活性下降50%的时间为24.5h；本发明所述rpoalb-nsp5 site-ifnα融合蛋白，可以降低感染病毒后仔猪的发病率和死亡率。
rpoalb-nsp5site-ifnα进行验证。经1.5%（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳后，在预期分子量(2863bp)处有明显条带，获得表达rpoalb-nsp5site-ifnα的重组毕赤酵母，保藏名称为x-33-chifnα(图2)；将重组毕赤酵母制成冻干粉保存备用。
28.所述毕赤酵母x-33感受态菌悬液的制备方法为：挑取毕赤酵母x33单菌落接种于50mlypd液体培养基中，28℃震荡过夜培养；按照0.2%（体积比）接种量重新接种于50mlypd液体培养基中，28℃震荡培养至od600=1.3。将培养液装于50ml离心管中，4℃，4000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。离心管中加入35ml预冷的无菌水，轻轻吹打重悬菌体。4℃，4000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。离心管中加入18ml预冷的无菌水，轻轻吹打重悬菌体。4℃，4000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。离心管中加入5ml预冷的1m山梨醇，轻轻吹打重悬菌体。4℃，4000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。离心管中加入1ml预冷的1m山梨醇重悬菌体，即得到酵母感受态细胞。
29.所述ypd培养基，其有效成分包括：1%（质量体积比）酵母粉，2%（质量体积比）胰蛋白胨，2%（质量体积比）葡萄糖。
30.三、rpoalb-nsp5site-ifnα融合蛋白的鉴定取步骤二得到的重组菌株冻干粉1克接种于50mlypd培养基，于28℃、250r/min培养12h。取10ml上述培养液转接于50mlbmgy培养基；在同样条件下继续培养24h，离心收集菌体，全部菌体转接于甲醇浓度为1.5%（v/v）的50mlbmmy培养基，于28℃、250r/min继续培养64h，得到发酵液，取培养上清液用于sds-page。结果表明在88.0kd处有明显条带(图3)。
31.四、rpoalb-nsp5site-ifnα体外活性的鉴定按照步骤三制备的发酵液按照《2017年版兽药质量标准》，采用mdbk-vsv检测系统和细胞病变抑制法检测融合蛋白活性。结果表明发酵液中重组rpoalb-nsp5site-ifnα在mdbk-vsv系统中对水泡性口炎病毒的抗病毒活性为3.25
×
106iu/ml。具体见图4；图4a中的细胞形态完好，图4b中的细胞发生病变。
32.五、rpoalb-nsp5site-ifnα蛋白的制备（1）一级种子繁殖将步骤二得到1支冻干菌种（1g）接种于50mlypd液体培养基，28℃、220r/min摇床振荡培养过夜，作为一级种子。
33.（2）二级种子繁殖取一级种子按1.5%（v/v）接种于200mlypd液体培养基，28℃、220r/min摇床振荡培养24h，作为二级种子。
34.（3）一级发酵：50l发酵罐，装液量30l，培养基为bmgy培养基，并加入0.05%消泡剂（v/v），121℃灭菌30min，降温至28℃备用。
35.将二级种子按照2%（体积比）的接种量接入发酵罐中，接种后将溶氧控制30%～100%，通风量1:1～1:1.5，转速225rpm，温度全程控制到28℃，发酵时间26h小时(od值长到1.2以上)。
36.（4）二级发酵200l发酵罐，装液量120l，培养基为bmmy培养基，并加入0.05%消泡剂（v/v），121℃灭菌30min，降温至28℃备用。
37.将一级发酵后的液体全部接种到二级发酵罐中，接种后将溶氧控制30%～100%，通风量1:1～1:1.5，转速225rpm，温度全程控制到28℃，全程控制ph5.75，培养到20h流加1%
（v/v）甲醇，培养到68h放罐，得到二级发酵液。连续3批发酵液抗病毒活性见下表1表1连续3批本发明发酵液上清抗病毒检测结果（五）纯化工艺将二级发酵液8000r/min离心30min，收集上清液，再将上清液通过30kd孔径超滤膜包将发酵液上清浓缩10倍。在浓缩后的上清中加入等量的平衡缓冲液并调ph至7.4，加入钴柱中与介质充分结合。分别使用含5mmol/l和150mmol/l咪唑的缓冲液进行洗涤和洗脱。
38.将含目标蛋白脱液合并，使用50kd超滤管超滤去除杂带、浓缩目标蛋白。结果表明该纯化工艺可以有效地除去大多数降解条带，保留较高纯度的rpoalb-nsp5site-ifnα全长条带(图5)。
39.实施例2rpoalb-nsp5site-ifnα血浆稳定性检测采集健康balb/c小鼠血液，离心收集血浆，用pbs稀释成50%血浆（v/v），分别将上述纯化后rpoalb-nsp5site-ifnα和纯化后的ifnα（具体制备标准见专利cn201911058504.8）加入50%血浆，终浓度为10
µ
g/ml，37℃孵育0、0.25、0.5、1.0、3.0、6.0、12和24h，各取100
µ
l，12000g离心30min，收集上清液。按照《2017年版兽药质量标准》，采用mdbk-vsv检测系统和细胞病变抑制法检测融合蛋白活性。结果表明ifnα活性下降50%的时间约为6h，rpoalb-nsp5site-ifnα活性下降50%的时间为24.5h。具体见图6。
40.实施例3rpoalb-nsp5site-ifnα的实验室防治试验将30头刚出生未吃初乳的仔猪随机分成3组，每组10头，第1组为rpoalb-nsp5site-ifnα治疗组；第2组为ifnα治疗组（具体制备标准见专利cn201911058504.8）；第3组为未进行治疗组。各组仔猪注射器灌服3mlped病毒液(病毒浓度为1
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106tcid50/ml)，随后立即，试验组仔猪肌肉注射实施例1得到的纯化后rpoalb-nsp5site-ifnα(抗病毒活性为1
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106iu/ml)，每次用量2ml，每天1次，连续3天；第2组仔猪肌肉注射ifnα（(抗病毒活性为1
×
106iu/ml），每次用量2ml，每天1次，连续3天；空白对照组仔猪肌肉注射同等剂量生理盐水2ml，每天1次，连续3天。观察防治效果，统计发病及死亡情况。结果表明第1组在仔猪肌肉注射rpoalb-nsp5site-ifnα后，发病率20%，死亡率为0%。第2组仔猪肌肉注射ifnα后发病率30%，死亡率为20%；第3组未采取治疗措施仔猪，则全部发病死亡，发病率和死亡率为100%。具体见表2。
41.表2rpoalb-nsp5site-ifnα的实验室治疗结果
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