一种具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医用药物技术领域，涉及一种具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物及其制备方法和应用，尤其涉及一种用于声动力介导肿瘤精准治疗的具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.癌症是威胁人类健康的三大疾病之一，近年来越来越受到人们的重视。如何快速、精准杀死癌细胞并彻底治愈癌症，成为医学领域研究的重要内容。研究表明，肿瘤细胞新陈代谢旺盛、繁殖能力强，肿瘤微环境的多种理化性质不同于正常体内环境，如乏氧、低ph，以及血管异常等。肿瘤微环境的特点一方面有利于肿瘤的增殖、侵袭、粘附和血管生成，促使恶性肿瘤形成；同时，也成为区分肿瘤组织和健康组织的重要依据，这为肿瘤的特异性诊断和治疗提供了新思路。
3.临床上目前癌症治疗的主要手段包括手术治疗，化学治疗，放疗，免疫疗法等。然而，由于手术治疗存在微小病灶肉眼不可见，区分正常细胞和肿瘤细胞较为困难，难以实现肿瘤完全切除干净且伴随着复发和转移的风险；化疗药物，例如顺铂、阿霉素和紫杉醇等小分子抗癌制剂是常用的明星药物，对中晚期癌症有较好的治疗效果。然而，化疗药物不能有效区分正常细胞和癌症细胞，其治疗的同时对正常细胞产生的损伤以及易产生耐药性并且在化疗过程中产生的黏膜炎、脱发、骨髓抑制和胃肠道严重不良反应限制了其目前的应用。因此，提高药物的靶向性，降低药物的毒副作用是治疗癌症的关键。
4.纳米材料具有小尺寸、免疫毒性低、易于合成等优点，通过不同的多肽材料设计，在体内循环过程中使得一定粒径尺寸的纳米材料通过被动靶向聚集在肿瘤区域，实现肿瘤精准治疗。
5.声动力治疗具有损伤小、选择性高和穿透能力强(＞10cm)等优势，在肿瘤治疗领域受到广泛关注。目前，声动力治疗肿瘤具有多种机制，其中自由基理论被广泛接受并应用于实际治疗中，是近年来各个医药领域的重要研究热点。例如，声动力疗法利用卟啉敏化剂，在超声刺激下产生过氧化基等活性化合物，可以实现肿瘤组织杀伤，具有局部精准、无创伤、副作用低等优点。纳米技术发展为肿瘤治疗带来新的思路和变革。目前ros响应型纳米递送体系主要是将药物负载在载体中，进入肿瘤组织后，实现药物控释。
6.然而，药物递送过程中往往因稳定性等因素产生一定毒性。因此，在药物递送系统设计方面还有待改进。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物及其制备方法和应用，尤其提供一种用于声动力介导肿瘤精准治疗的具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物及其制备方法和应用。
8.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供一种具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物，所述具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物包括依次连接的线粒体靶向单元、自组装单元和声动力响应单元。
10.本发明所涉及的自组装多肽药物在体液循环过程中能够通过疏水作用自组装形成纳米颗粒被动靶向于肿瘤细胞，并靶向线粒体，由于肿瘤细胞中的线粒体会产生大量的活性氧(ros)，纳米颗粒借助内源性ros的环境能够进一步形成纤维，增强了其与线粒体的多价键协同作用，使其与线粒体作用位点更多，与线粒体的结合力更牢，后续通过外源性的超声(us)激活声敏剂产生单线态氧，对线粒体产生破坏，从而诱导肿瘤细胞凋亡。该药物能够精准定位病灶部位，能够实现在线粒体表面的长效滞留效果，增强与线粒体结合的稳定性，具有选择性杀伤肿瘤细胞的作用，在体内具有很强的抑瘤效果，为肿瘤疾病的诊断和治疗提供了新的非侵入超声治疗策略，在超声(1.0mhz，1.25wcm-2
，50％占空比)照射下，可诱导90％的肿瘤细胞凋亡。且该药物具有良好的生物安全性。
11.优选地，所述自组装单元为具有自组装功能的多肽。
12.优选地，所述多肽的序列包括yff、klvff、devd、gflg或rvrr中的任意一种或至少两种的组合。
13.优选地，所述线粒体靶向单元为线粒体靶向多肽。
14.优选地，所述线粒体靶向多肽的序列包括cgkrk、[klaklak]2、tpp、szeto-schiller或dlp中的任意一种或至少两种的组合。
[0015]
优选地，所述线粒体靶向单元与自组装单元通过酰胺键连接。
[0016]
优选地，所述声动力响应单元为声敏剂。
[0017]
优选地，所述声敏剂包括中-四(4-羧基苯基)卟吩、紫红素、血卟啉单甲醚、ir-780iodide、dvdms-mn-lps或mnttp-hsa。
[0018]
所述声动力响应单元与自组装单元通过酰胺键直接连接或通过多肽序列连接。
[0019]
优选地，所述多肽序列为含有酸性氨基酸的序列，进一步优选为氨基酸数1-3的含有酸性氨基酸的序列，例如，gg、ggk，其中gg是连接多肽氨基酸或小分子之间常用的连接键，具有调控空间构象的作用，k氨基酸主链和侧链的氨基具有同时连接小分子和功能性分子的作用。
[0020]
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物的制备方法，所述制备方法包括：
[0021]
通过多肽固相合成法得到线粒体靶向单元，并连接自组装单元和声动力响应单元，得到所述具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物。
[0022]
优选地，所述制备方法包括：
[0023]
(1)将线粒体靶向单元中的第一个氨基酸c端固定于树脂上，n端进行fmoc保护，侧链进行dde保护，然后进行溶胀处理；
[0024]
(2)脱保护剂脱去第一个氨基酸n端的fmoc保护，洗涤后加入下一个氨基酸进行反应，依次进行氨基酸的连接，得到固定于树脂的多肽序列；
[0025]
(3)将得到的固定于树脂的多肽序列与声敏剂混合反应，然后收缩树脂，裂解，氮气吹干，得到所述具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物。
[0026]
本发明所涉及的具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物的制备工艺简单易操作，且适合工业化生产。
[0027]
优选地，所述溶胀处理使用活化的dmf处理1-5h，例如1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h等。
[0028]
优选地，步骤(3)所述反应在避光条件下进行。
[0029]
优选地，所述裂解在冰水浴中进行2.5-3h，例如2.5h、2.6h、2.7h、2.8h、2.9h、3h等。
[0030]
上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0031]
优选地，所述氮气吹干后用乙醚洗涤。
[0032]
本发明所涉及的多肽固相合成法是从多肽链的c端向n端方向合成，采用fmoc保护n端的氨基酸，通过kaiser test检测法检测是否有伯氨基的存在，，在伯氨基裸露的情况下，1.5ml离心管中含有检测试剂的树脂的颜色为深紫色；在fmoc保护氨基的存在情况下，则树脂为无色。其中kaiser text检测法含有三种试剂分别命名为a、b、c，三种试剂的配方如下：
[0033]
a：0.5g的茚三酮溶于10ml无水乙醇；
[0034]
b：20g苯酚溶于5ml无水乙醇；
[0035]
c：0.1g抗坏血酸溶于5ml无水乙醇。
[0036]
示例性地，tcpp-kggffycgkrk的合成方法具体如下：
[0037]
(1)溶胀树脂：称取300mg的fmoc
–d–
lys(boc)-wang resin树脂放入多肽合成管中，加入活化后的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，放入摇床中摇晃溶胀1-5h；
[0038]
(2)脱保护：先用dcm和dmf交替反复(3遍)冲洗，然后在多肽合成管中加入脱保护剂(六氢吡啶:dmf＝1:4)，在摇床上摇晃10min，脱掉氨基酸上的fmoc基团；
[0039]
(3)检测：用dcm和dmf交替反复冲洗(3遍)，然后取a、b，c各一滴以及少量树脂加入到1.5ml离心管，将离心管在沸水中加热1min。如果树脂的颜色变为紫色，则证明fmoc保护基脱除；
[0040]
(4)偶联：称取相对于树脂载量的10倍当量的氨基酸和hbtu于15ml离心管中，然后加入10ml的偶联剂(dmf:n-甲基吗啉(nmm)＝19:1)预反应10分钟，再倒入多肽合成管，放在摇床上反应2h；
[0041]
(5)检测：用dcm和dmf交替反复冲洗，每个溶剂冲洗3遍，然后加入kaiser text检测试剂，如果树脂的颜色没有变化，证明氨基酸偶联上；
[0042]
(6)循环偶联：重复步骤(2)、(3)、(4)、(5)，使所有氨基酸完全偶联上，检测完最后一个氨基酸完全偶联上后，用脱保护剂将fmoc保护基团脱去；
[0043]
(7)检测：重复第二步；
[0044]
(8)偶联声动力响应分子中-四(4-羧基苯基)：称取4倍当量的tcpp和10倍当量的苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)于15ml离心管中，然后加入10ml的偶联剂反应10分钟，再倒入多肽合成管，放在摇床上过夜反应；
[0045]
(9)收缩：用甲醇收缩树脂15min，然后将收缩好的树脂转移至10ml的血清瓶，瓶中加入磁子；
[0046]
(10)裂解：加入3ml的裂解液(2.5％超纯水 2.5％三异丙基硅烷 92.5％三氟乙酸
2.5％乙二硫醇)，在冰浴中磁力搅拌2.5-3h，然后抽滤，用tfa润洗血清瓶，再将tfa用氮气吹干，加入冰乙醚，使多肽在乙醚中析出，然后将多肽转移至离心管，4℃，8000r
·
min-1
条件下离心，重复三次，再将多肽转移至1.5ml离心管，用封口膜封口，过夜，使乙醚挥发干净，最终得到靶向线粒体的组装多肽药物。
[0047]
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物在制备声动力疗法介导的抗肿瘤药物中的应用。
[0048]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0049]
本发明所涉及的自组装多肽药物在体液循环过程中能够通过疏水作用自组装形成纳米颗粒被动靶向于肿瘤细胞，并靶向线粒体，由于肿瘤细胞中的线粒体会产生大量的活性氧(ros)，纳米颗粒借助内源性ros的环境能够进一步形成纤维，增强了其与线粒体的多价键协同作用，使其与线粒体作用位点更多，与线粒体的结合力更牢，后续通过外源性的超声(us)激活声敏剂产生单线态氧，对线粒体产生破坏，从而诱导肿瘤细胞凋亡。该药物能够精准定位病灶部位，能够实现在线粒体表面的长效滞留效果，增强与线粒体结合的稳定性，具有选择性杀伤肿瘤细胞的作用，在体内具有很强的抑瘤效果，为肿瘤疾病的诊断和治疗提供了新的非侵入超声治疗策略，在超声(1.0mhz，1.25wcm-2
，50％占空比)照射下，可诱导90％的肿瘤细胞凋亡。且该药物具有良好的生物安全性。
附图说明
[0050]
图1是自组装多肽药物在pbs溶液中自组装产物的maldi-tof-ms验证图；
[0051]
图2是自组装多肽药物在h2o2溶液中自组装产物的maldi-tof-ms验证图；
[0052]
图3是自组装多肽药物分别在pbs溶液和h2o2溶液中自组装产物的tem图；
[0053]
图4是自组装多肽药物与线粒体共定位的验证结果图(图中标尺为20μm)；
[0054]
图5是自组装多肽药物在线粒体上组装后的sem图(图中标尺为200nm)；
[0055]
图6是超声前和超声后自组装多肽药物产生的1o2信号图；
[0056]
图7是自组装多肽药物在超声前和超声后的细胞毒性统计结果图；
[0057]
图8是自组装多肽药物在小鼠体内分布的活体成像图；
[0058]
图9是自组装多肽药物的体内抗肿瘤实验结果统计图。
具体实施方式
[0059]
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0060]
下述测试例中涉及的动物小鼠为雌性balb/c裸鼠(6-8周，17-19g)，购自北京维通利华公司。
[0061]
实施例
[0062]
本实施例提供一种具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物(tcpp-kggffycgkrk，简称ty)，其结构式可由式i所示：
[0063][0064]
其制备方法如下：
[0065]
(1)称量300mg fmoc-d-lys(boc)-wang resin树脂加入到多肽固相合成管中，加入dmf溶胀3h，通过抽滤泵滤掉dmf，加入脱保护剂，在摇床上放置10min；抽掉脱保护液，用dmf、dcm洗涤3次，从多肽固相合成管中取量wang树脂于试管中，茚三酮法检测呈深蓝色即为阳性结果后，准备接入第二个氨基酸(r)，进入氨基酸缩合反应；
[0066]
(2)分别按照ty的氨基酸序列顺序取10倍当量的氨基酸和hbtu，用10ml反应液溶解，投入到多肽固相合成管中，搅拌反应，1h后，从多肽固相合成管中取适量wang树脂于试管中，茚三酮法检测未变色即为阴性结果后证明缩合反应成功；抽掉多肽固相合成管中的液体，用dmf、dcm洗涤3次，得到第二个氨基酸缩合后的肽树脂；
[0067]
(3)对所得肽树脂重复进行以上“fmoc脱保护-氨基酸缩合”反应步骤，至最后一个k氨基酸反应完毕，用dmf、dcm各洗涤3次，加入tcpp偶联液，避光置于摇床上反应12h，反应完毕后，用dmf、dcm各洗涤3次，甲醇洗3次，将其抽干；
[0068]
(4)多肽固相合成管中取出合成的肽树脂，在冰水浴中裂解3h；将树脂过滤后，用氮气吹干，冰浴条件下用无水乙醚洗3次，使用制备型反相hplc纯化，即得，所得多肽药物在-20℃保存待用。
[0069]
测试例1
[0070]
maldi-tof-ms验证：
[0071]
将实施例制得的自组装多肽药物ty分别溶于pbs溶液或100μm h2o2水溶液中(500μg/ml)，于25℃下反应8h使其充分组装，取少量溶液通过质谱(ms,electrospray)进行鉴定，如图1(pbs溶液)和图2(h2o2水溶液)所示。由图1和图2可知：ty自组装多肽纳米药物在pbs溶液里组装为纳米颗粒，其分子量为2063.687，在h2o2水溶液里反应后，发生了交联，分子量为4125.732，从质谱上进一步证明其偶联成为了二倍体。
[0072]
测试例2
[0073]
tem验证：
[0074]
将实施例制得的自组装多肽药物ty分别溶于pbs溶液或100μm h2o2水溶液中(500μg/ml)，于25℃下反应8h使其充分组装，取10μl两种溶液，滴在230目的碳膜铜网上，等待10min使样品沉降在铜网上，然后用滤纸将多余的样品吸干。用醋酸双氧铀溶液染色5min，随后用去离子水将其洗涤2次，并用滤纸吸干，以清洗铜网，静至，干燥。用透射电镜(tem)实时ccd成像，如图3所示(a为溶于pbs溶液中样品；b为溶于h2o2水溶液中样品)，由图3可知：本发明中具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物在100μm h2o2中为不同于纳米颗粒的纳米纤维。
[0075]
测试例3
[0076]
药物与线粒体共定位的验证：
[0077]
将1
×
104hela细胞置于共聚焦显微镜培养皿中培养24h，与ty(10μm)孵育8h，然后用pbs洗涤3次。然后用mitotracker red荧光探针(简写为mt-red)与细胞孵育30分钟。最后，用pbs清洗细胞3次，用蔡司lsm710激光共聚焦显微镜(zeiss lsm710)和油性63倍物镜成像。如图4所示，由图可知：8h时，靶向线粒体的自组装多肽药物与线粒体具有很好的共定位现象，pearson’s系数为0.71。
[0078]
测试例4
[0079]
药物在线粒体上组装形态的验证：
[0080]
将实施例制备的药物ty在硅片上与线粒体共孵育8h后，4％多聚甲醛固定2h，然后分别用50％、70％、80％、90％、100％乙醇依次脱水15min，充分干燥后喷金20s进行扫描电镜拍摄。如图5所示，由图可知：本发明的具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物可以在线粒体上形成纳米纤维。
[0081]
测试例5
[0082]
药物超声响应单元的功能性验证：
[0083]
实施例提供的药物，其中tcpp通过超声产生的1o2的产生是由bruker emx esr光谱仪测定的。在4ml的离心管里先加入2,2,6,6-四甲基哌啶(temp，97μm)50μl，然后加入ty(10μm)的1ml溶液，至于超声治疗仪的探头上经辐照(1.0mhz，1.25w cm-2
，50％占空比)3分钟后，通过电子自旋共振光谱仪立即检测到1o2信号。在相同的超声辐照(1.0m hz，1.5w/cm～2，50％占空比)下3分钟后检测超声前和超声后产生的1o2信号。如图6所示，由图可知：观察到1:1:1的三线态特征峰信号，由此可以证明1o2的生成，且不加超声的ty纳米药物1o2信号较低。
[0084]
测试例6
[0085]
细胞毒性验证：
[0086]
利用cck-8比色法测定靶向线粒体的组装多肽药物对hela细胞的细胞毒作用。将hela细胞接种于含100μl dmem的96孔培养板(6000个/孔)中培养24h，再将不同浓度(20、10、5、2.5、1.2、0.6、0μm)的ty与细胞共孵育8h，给予超声(1.0mhz，1.25w
·
cm-2
，50％占空比)后，每孔加入100μl的cck-8溶液继续孵育2h，用微板仪分别在测试波长450nm和参考波长690nm处确定每孔中增殖细胞的浓度。如图7所示，由图可知：本发明所涉及的具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物在不加超声时细胞没有毒性，细胞活力约为100％；在超声条件下，ty-us组的ic
50
值为9.8μm，有显著的抗肿瘤作用。该自组装多肽药物能够与线粒体共价结合并且在超声作用下能更好地诱导细胞凋亡。
[0087]
测试例7
[0088]
药物的体内靶向性验证：
[0089]
(1)称取适量的ty，配置成200μm的pbs溶液，通过尾静脉给药方式将样品注射至小鼠体内，每只小鼠给药体积200μl；
[0090]
(2)通过小动物成像仪器(型号为biospec70/20usr，制造商名称为bruker公司)，在设计好的不同时间点将小鼠通过异氟烷麻醉，对小鼠进行成像实验，对ty在小鼠体内的生物分布进行观察。
[0091]
结果如图8所示，我们选择分别在不同时间点对小鼠进行荧光成像，ty在8h在肿瘤部位具有高效富集，直到在24h后慢慢的开始减弱，具有ros响应的发生形变的ty多肽纳米药物在肿瘤区域内具有长时间的富集。
[0092]
测试例8
[0093]
体内抗肿瘤效果验证：
[0094]
将裸鼠分为6组(n＝10)，pbs、only-us、tf，tf-us，ty，ty-us组。当裸鼠的皮下肿瘤体积达到100mm3左右时，采用尾静脉注射ty(200μm)或pbs，每只小鼠注射200μl，尾静脉注射后的8h给予或或不给予超声处理；
[0095]
具体的超声实验方案为：首先打开超声治疗仪，将仪器功率调为1.25w/cm2，在超声治疗仪的探头上均匀涂抹超声耦合剂，开始超声治疗。治疗周期结束后，对裸鼠肿瘤部位解剖，称重。
[0096]
结果如图9所示：与对照组相比，本发明所涉及的自组装多肽药物具有显著的抗肿瘤作用。
[0097]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0098]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0099]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。