一种高通量qPCR芯片及其在检测微生物重金属抗性基因中的应用

验证所有引物的特异性，覆盖度和灵敏度，最终设计出含有87对针对57种重金属抗性基因的高通量qpcr芯片，命名为重金属抗性基因芯片(mrg chip)。并将该芯片成功应用于环境样品研究，能很好地区分不同生境下的重金属抗性组。重金属抗性基因芯片提供了一个高通量的分子工具，用于在不同环境下对多种重金属抗性基因进行绝对定量和相对定量，可以有效地补充传统qpcr和宏基因组学不可绝对定量的缺点，为研究环境中重金属抗性组提供有效的分子手段。
8.本发明所设计的芯片共覆盖2界，29门，64纲，130目，226科，382属。覆盖序列中，约95.2％的序列属于细菌，其余4.8％的覆盖序列来自古菌，以上结果证明芯片具有较高的覆盖度。sanger测序结果证明，81.6％的扩增子与对应的靶标具有超过80％以上的相似性；同时，在ht-qpcr系列稀释检验中，溶解曲线分析表明，所有引物与其对应的标准质粒具有特异性，溶解曲线均为单峰；最后，使用计算机评估所有引物的特异性，其中75.4％的引物特异性超过70％；以上结果说明该芯片具有较强特异性。ht-qpcr标准曲线分析得到，ct值为31～12之间对应的质粒模板质量为3
×
10-3
～300ng；最低检测限(lod)范围为1-147copies/reaction，均值为62copies/reaction，最低定量限 (loq)范围为72-9670copies/reaction，均值为3932copies/reaction。这些结果表明重金属抗性基因芯片具有较高的灵敏度。
9.利用重金属抗性基因芯片测定不同生境下的重金属抗性基因特征。不同生境之间检测到的重金属抗性基因存在较大差异，检测到的重金属抗性基因绝对丰度为2.38
×ꢀ
106(居民区灰尘样品)到1.93
×
108copies
·
g-1
(中度金属污染水稻土)，相对丰度为8.71
×ꢀ
10-5
(添加抗生素饲喂的猪粪便样品)到2.23
×
10-2
(低金属污染沉积物)。重金属抗性基因的主成分分析显示，不同生境的重金属抗性基因具有明显分簇。这些结果表明，重金属抗性基因芯片能够很好地区分不同生境中重金属抗性基因的分布格局。
10.更详尽的实施方案见具体实施例。
附图说明
11.图1为sanger测序评估重金属抗性基因芯片的特异性(n＝87)。
12.图2为重金属抗性基因芯片上的扩增效率分布(n＝87)。
13.图3为ht-qpcr检测的标准曲线，评价重金属抗性基因芯片灵敏度。
14.图4为不同环境样品中重金属抗性基因的分布。a-b在环境样品中检测到的重金属抗性基因的绝对丰度和相对丰度。
15.图5为基于重金属抗性基因绝对丰度的pca分析。
具体实施方案
16.以下结合实施例对本发明进行详细地说明。需要指出的是，本发明的实施例仅限于对于本发明进行说明，而没有限制作用。本发明中所涉及的其它各种操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
17.实施例1芯片设计
18.采用公共数据库national center for biotechnology information(ncbi)、
bacmet (http://bacmet.biomedicine.gu.se)以及uniprot(https://www.uniprot.org/)，针对重金属抗性基因搜集序列并设计引物，相关抗性基因及功能如表1所示。
19.a.功能基因检索及序列下载：针对cu、ag、hg、cr、zn、pb、ni、co、cd九种重金属，参考文献报道，搜集相关抗性基因及对应功能，通过公共数据库，检索、收集、统计基因信息并下载相关基因及蛋白序列。最终针对57个抗性基因(表1)，从ncbi 公共数据库共下载3301条核酸序列和2892个氨基酸序列，同时从bacmet或uniport 数据库下载97条经实验确定的重金属抗性基因序列。
20.b.系统发育树构建：在mega-x 10.1软件中导入目标基因序列，使用clustal w 进行序列比对并构建系统发育树。共构建57个重金属抗性基因的系统发育树。
21.c.codehop设计简并引物：根据系统发育树的亲缘关系，对序列进行分簇，通过 base-by-base软件上传比对序列，设置相应参数设计引物。对codehop生成的引物集进行筛选，筛选标准如下:(i)非简并5'区：引物长度为18-24个碱基，预计退火温度(tm) 为60℃；(ii)简并3'区：gc含量为40％～60％，核心区简并度最大为256，至少含有4 个氨基酸序列连续保守；(iii)其他参数：扩增子长度为120～400个碱基，引物得分在60 分以上。针对48个抗性基因获得78对新引物，同时，在文献中搜集了针对9种重金属抗性基因的9对应用于环境样品研究的引物，共计87对引物(表2)采用同一流程进行评估。
22.表1重金属抗性基因芯片中的重金属抗性基因及相关功能
23.[0024][0025]
表2 87对引物序列及其片段长度
[0026]
[0027]
[0028]
[0029][0030]
[0031]
*代表文章中发表引物
[0032]
实施例2芯片验证
[0033]
申请人对所有引物进行实验验证及计算机验证，来评估芯片的性能。
[0034]
a.ta克隆及sanger测序：所有引物均以环境样本中提取的dna为模板，通过 touchdown pcr(td-pcr)进行实验验证。使用的环境样本包括无污染及有重金属污染的旱地土壤和沉积物样品。dna提取使用mobio powersoil dna分离试剂盒(mobiolaboratories,carlsbad,ca,usa)进行。从三个重复样本中提取的dna均匀混合，以减少样品偏差。使用nanodrop nd-2000c分光光度计(nanodrop technologies,usa)测定dna 浓度和质量。td-pcr使用20μl体系，含10μl 2
×
taq master mix(vazyme biotech co., ltd,nanjing,china)、1μgμl-1
牛血清白蛋白(new england bilaboratory,beverly,ma)、 0.5μm引物和1ngμl-1
dna模板。td-pcr程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min， 63℃退火30s，72℃延伸1min，之后每循环一次，退火温度降0.5℃直至55℃；后进行 95℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；最后再72℃延伸5min。在琼脂糖凝胶电泳后，对扩增出条带且片段长度合适的pcr产物进行纯化，使用pcr产物纯化试剂盒。将纯化后的片段连接到ptopo-t载体(aidlab biotechnology co.,ltd, beijing,china)，并按照说明书将质粒导入大肠杆菌dh5α感受态细胞。采用与td-pcr 相同的pcr条件进行菌落pcr，验证是否成功插入目的片段。插入目的片段的质粒使用质粒提取试剂盒(tsingke biotechnology co.,ltd.,beijing,china)提取，并将质粒送生工生物公司进行sanger测序。
[0035]
图1所示为通过sanger测序评估重金属抗性基因芯片的特异性，结果表明81.6％以上的扩增子与相应的目标物具有较高的相似性，同源性超过80％，说明芯片具有较好的特异性。
[0036]
b.ht-qpcr验证：首先提取含有目标基因的质粒dna，将这些质粒等浓度等体积混合，使每个目标基因的初始拷贝数约为10
12
copies。用标准质粒10倍梯度稀释进行ht-qpcr检测，获得标准曲线。ht-qpcr在wafergen smartchip real-time pcr系统(thermo fisher，usa)上进行。ht-pcr反应(每孔100nl)由1
×
lightcycler 480sybr greeni master(roche applied sciences,indianapolis,in)、1μgμl-1
牛血清白蛋白(new englandbiolatories,beverly,ma)、0.5μm引物和5ngμl-1
dna模板组成。pcr程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸15s，进行35个循环。溶解曲线分析用于确定引物组扩增特异性，由wafergen软件自动生成。所有qpcr反应均含有3个重复且每块芯片中都包含空白对照，ct阈值为31。在至少两个技术重复中成功扩增的样品被视为阳性检测，并用于进一步分析。标准曲线拟合采用r4.0.3的线性回归分析。根据标准曲线斜率计算扩增效率，公式为eff＝10
(-1/slope)-1。以lod、loq来评估芯片的灵敏度。
[0037]
图2为在退火温度下，重金属抗性基因芯片上的引物的扩增效率分布。当退火温度为57℃时，扩增效率在80～110％之间的引物对占94％。说明芯片的扩增效率较好。每对引物的溶解曲线显示都只存在单一峰，证明所有引物特异性较好。
[0038]
图3为箱线图，显示ht-qpcr检测的标准曲线。从图中可以看出ct值为31～12对应的质粒模板质量为3
×
10-3
～300ng。同时表3为根据标准曲线计算得到lod和loq。lod范围为1-147copies/reaction，均值为62copies/reaction，而loq范围为72-9670copies/reaction，均值为3932copies/reaction。这些结果表明重金属抗性基因芯片具有较高的灵
敏度。
[0039]
表3重金属抗性基因芯片引物的ct值、检测限(lod)和定量限(loq)
[0040]
[0041]
[0042][0043]
*代表文章中发表引物
[0044]
c.计算机验证：为了进一步检验芯片的覆盖度和特异性，申请人使用公共数据库，计算机模拟测试了芯片中引物的覆盖度和特异性。利用从ncbi基因数据库中检索到的核酸序列构建每个金属抗性基因的本地数据库。所有序列均通过hmmer hmmsearch进行验证。共构建了38个金属抗性基因数据库，用来评估引物集的覆盖度和特异性。使用 geneious primer 2021.2.2将引物对与本地数据库进行比对，计算引物覆盖率和特异性。对于使用codehop算法设计的引物集，只将3'简并区与本地数据库进行比对，不允许碱基错配。文献中发表的引物集与本地数据库进行比对时，可允许最大错配碱基数为2。引物覆盖度为正向引物和反向引物同时匹配上的序列占每个靶基因数据库总序列数的百分比；特异性为检索到的序列属于目标基因数据库的比例；假阳性率为比对中观察到的假阳性序列数除以总重金属抗性基因数据库序列数的百分比。
[0045]
测试结果如表4所示，所测引物的覆盖度范围为13％～98.6％，平均覆盖度为52.8％。这些引物集覆盖了2界、29门、64纲、130目、226科、382属。覆盖序列中，约95.2％的序列属于细菌，分别属于γ-变形菌纲(64％)、β-变形菌纲(8％)、α-变形菌纲(8％)、厚壁菌门(8％)和其他(7.2％)。其余4.8％的覆盖序列来自古菌，包括广古菌门(3.9％)和其他(0.9％)。以上结果说明芯片具有较好的覆盖度。
[0046]
特异性检测结果显示，特异性范围为15.1～100％，约75.4％的引物组特异性高于70％。所有引物只检测到很小一部分的假阳性，均值为0.16％。以上结果说明芯片具有较高的特异性。
[0047]
表4计算机验证显示引物覆盖度、特异性及假阳性率
[0048]
[0049][0050]
a：覆盖度依照每个抗性基因的所有引物对覆盖度加和计算。*代表文章中发表引物。
[0051]
实施例3芯片应用
[0052]
采集了5种生态系统样品，包括湖北大冶矿区不同金属污染程度的旱地土壤、水稻
土和底泥等环境样本，武汉高速公路和厦门居民区阳台上的粉尘样本，以及饲喂或不饲喂洛克沙胂(50g/t)和金霉素(50g/t)的猪粪便样本，提取样本中的群落dna应用于芯片。
[0053]
土壤样品采用五点采样法采集0～15cm的表土，均匀混合为一个样品。去除石头和植物残渣后，用2mm的筛子对土壤样品进行筛分。使用采样器收集河流沉积物(0-10厘米)。同一河流3-5个采样点的沉积物被均匀混合为一个样品。高速公路路边和住宅区阳台上堆积的灰尘使用刷子收集，并放入自封袋内。所有样品均储存在冰上，并在24小时内运至实验室。样品分为两份：一份样品风干后用于测定重金属含量；另一份冷冻干燥后，-80℃保存，用于提取dna。
[0054]
接下来测定样品中的重金属含量及污染程度。取过筛样品(0.1g；0.147mm)于微波消解管中，加入14ml hcl-hno
3-hf混合物(2:9:3，v:v:v)，使用mars6tm微波消化系统 (cem公司，美国)，在190℃下消解1小时。消解完全的溶液经0.45μm的滤膜过滤，用超纯水稀释至25ml。ag、cd、co、cr、cu、ni、pb和zn的含量用电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes，agilent technologies 5110，美国)测定。称取0.50g环境样本于特氟龙管中，加入10毫升混合溶液(2mol l-1
hno3和4mol l-1
hcl)，在100℃下消解 2h测定总汞含量，使用冷蒸气原子荧光光谱法(cvafs)检测。采用内梅罗综合污染指数(pn)评价环境样品中金属污染的程度，公式如下:
[0055][0056]
pi＝ci/si[0057]
式中，pi为每种金属的污染指数，i为不同金属；ci为测量的重金属含量；si为阈值。本研究采用《环境质量标准》(gb15618-2018)中的标准值作为环境质量评价标准。 p
i max
是所有金属的最大污染指数。pn值高低代表每个样品的重金属污染程度。每个样品的具体信息及污染程度如表5所示。
[0058]
之后将环境样品dna应用于芯片。采用的ht-qpcr反应、循环程序和数据处理过程与“实施例2”中ht-qpcr程序相同。16srrna基因的绝对拷贝数通过qpcr测定。每个靶基因的绝对丰度通过将ct值代入相应标准曲线计算得出。基因相对丰度＝mrg 绝对拷贝数/16srrna基因绝对拷贝数。
[0059]
如图4，图5所示，利用重金属抗性基因芯片测定不同生境下的重金属抗性基因特 征。不同生境之间检测到的重金属抗性基因存在较大差异，检测到的重金属抗性基因绝 对丰度为2.38
×
106(居民区灰尘样品)到1.93
×
108copies
·
g-1
(中度金属污染水稻土)(图 4a)，相对丰度为8.71
×
10-5
(添加抗生素饲喂的猪粪便样品)到2.23
×
10-2
(低金属污染沉 积物)(图4b)。重金属抗性基因的主成分分析显示，不同生境的重金属抗性基因具有明 显分簇(图5)。这些结果表明，重金属抗性基因芯片能够很好地区分不同生境中重金属 抗性基因的分布格局。
[0060]
我们进一步研究了各生境内重金属抗性基因丰度沿重金属污染梯度的变化。除了沉积物和猪粪样品，其他生境内重金属抗性基因绝对丰度都随内梅罗综合污染指数(pn)的升高而增加(图4a)。在沉积物中，随着pn从4.78增加到18.52，重金属抗性基因的绝对丰度由8.17
×
107copies
·
g-1
降至8.24
×
106copies
·
g-1
。抗生素饲养的猪粪(ma)中pn值较低，
但重金属抗性基因的绝对丰度高于不饲喂抗生素的猪粪(mn)(图4a)。这些结果表明，重金属抗性基因丰度的变化并不总是与金属污染水平一致，在很大程度上取决于生境。
[0061]
表5不同环境样品的样品类型、污染程度，经纬度，单因子污染指数(pi)和综合污染指数(pn)
[0062][0063]