一种纳米膜微流控胶体金检测装置及其应用的制作方法

1.本发明属于胶体金检测装置技术领域，尤其涉及一种纳米膜微流控胶体金检测装置及其应用。


背景技术：

2.微流控芯片技术(microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程中样品的制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。
3.胶体金法是由氯金酸(haucl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用形成一种稳定的、带负电的疏水胶体，故称胶体金。胶体金技术具有方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点，因而特别适合应用于基层检验以及大批量检测和大面积普查中。
4.cn207133195u公开了一种多通道胶体金/免疫荧光检测微流控芯片，包括基板；基板上设有加样池及与其相连的多个检测区；每个检测区包括毛细通道、通过毛细通道连通的设有胶体金或荧光标记物的反应池和显色池；显色池为胶体金或荧光反应的显色池，加样池也通过毛细通道与反应池连通，毛细通道以加样池为起点呈树权状布设。该产品实现了对多种待测项目进行同时检测，但反应池与显色池设在芯片内部可能会因无法充分反应而引入误差；加样池与反应池之间的毛细通道的长度不同则会使显色时间有一定的差异，无法同时获得所有检测项目的结果；将加样孔设置在芯片的一侧限制了检测项目的数量。
5.目前，胶体金法检测中普遍存在检测项目少、需要样本量大、检测时间长的问题。如何提供一种检测项目多、样本需求量少、耗时较短且结果准确的胶体金检测装置，已成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种纳米膜微流控胶体金检测装置及其应用，解决了现有胶体金检测卡检测项目单一、且样本需求量大、不适合多项目筛查的问题；所有项目的检测结果均可以同时获知，用时较短，结果准确，使用方便。
7.为达此目的，本发明采用如下技术方案：
8.第一方面，本发明提供了一种纳米膜微流控胶体金检测装置，所述纳米膜微流控胶体金检测装置包括金标微孔和检测卡；
9.所述检测卡包括自上而下依次层叠设置的微流控芯片、纳米膜、吸水纸和基板；
10.所述微流控芯片上设有加样孔、渗滤孔以及连接所述加样孔和渗滤孔的流动通道。
11.本发明中，将装有胶体金-抗体结合物的金标微孔设置在芯片外，样品与胶体金的混合及反应也均在芯片外进行，人工操作使反应更加充分，增加了检测的准确性。通过自上
而下设置微流控芯片、纳米膜和吸水纸，充分反应后的液体可在吸水纸的作用下通过层析作用沿着微流控芯片内的流动通道在纳米膜上移动，进而显色，显示检测结果；基板起支撑作用，保证了检测装置在运输、储存及反应过程中维持相对稳定。
12.优选地，所述金标微孔的材质包括聚氧乙烯。
13.优选地，所述微流控芯片的材质包括聚二甲基硅氧烷。
14.本发明中，所述纳米膜包括颗粒膜与致密膜，颗粒膜是纳米颗粒粘在一起，中间有极为细小的间隙的薄膜，致密膜指膜层致密但晶粒尺寸为纳米级的薄膜。本发明中，优选致密膜作为反应的载体，其致密的结构更有利于液体的均匀渗透，纳米级的晶粒相较于常规大颗粒的材料有更好的抗原包被效率，使得该检测装置具有各渗滤孔反应均匀、灵敏度高、节省原料且检测速度快的特点。
15.优选地，所述纳米膜的材质包括纳米硝酸纤维。
16.本发明中，选用纳米硝酸纤维制备纳米膜，该材料具有易溶解、蛋白包被效率高、亲水性能好、市场上比较普遍的特点，使得使用该材料制备的纳米膜有制备简单、性能好、渗透均匀、成本低的优点。
17.优选地，所述加样孔位于所述微流控芯片的中心。
18.优选地，所述流动通道以所述加样孔为中心，呈辐射状分布。
19.本发明中，将加样孔设置在微流控芯片的中心，同时将流动通道设置成辐射状，反应后的液体样本可在表面张力的作用下从加样孔均匀向四周扩散，增加了检测项目的同时也保证了所有检测反应同时发生，缩短了反应时间，提高了检测装置的精密度。
20.优选地，所述流动通道的长度相同。
21.本发明中，将流动通道设置成相同的长度也是为了进一步保证检测反应可以同时发生，避免因不同检测项目所需的显色时间不同而引入误差。
22.优选地，所述加样孔的数量为1个。
23.本发明中，仅需要极少量的样本即可实现多种项目的同时检测。
24.优选地，所述渗滤孔和所述流动通道的数量均为不少于2个，例如可以是2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
25.优选地，所述渗滤孔和所述流动通道的数量相同。
26.本发明中，渗滤孔和流动通道的数量可根据具体的检测项目进行具体选择，但二者的数量相同，保证了每条流动通道仅对应单一的渗滤孔，避免不同渗滤孔之间发生交叉污染从而影响检测结果的准确性。
27.优选地，所述纳米膜的面积不小于所述微流控芯片的面积，所述吸水纸的面积不小于所述纳米膜的面积。
28.优选地，所述金标微孔中包埋有冻干的胶体金-抗体结合物。
29.优选地，所述金标微孔中包埋有至少一种胶体金-抗体结合物，所述胶体金-抗体结合物中的抗体为待测物的特异性抗体。
30.优选地，所述纳米膜在所述渗滤孔对应的位置上包被有待测物偶联抗原。
31.优选地，所述检测卡的形状为矩形或圆形。
32.优选地，所述检测卡的形状为矩形。
33.本发明中，通过将检测卡的形状设置成矩形，方便不同检测卡之间的排序与组合，为大批量样品的同时检测创造了条件。
34.优选地，所述纳米膜微流控胶体金检测装置检测的样品的类型包括血液、尿液、淋巴液、脑脊液或唾液中的任意一种或至少两种的组合。
35.第二方面，本发明提供了第一方面所述的纳米膜微流控胶体金检测装置的使用方法，所述使用方法包括：
36.将待测样品加至金标微孔中，溶解，转移至加样孔中；
37.反应，根据渗滤孔的颜色进行判断。
38.本发明中，根据检测的样品类型、金标微孔中包埋的物质和纳米膜在所述渗滤孔对应的位置上包被的具体物质对结果进行具体的判定。
39.第三方面，本发明提供了第一方面所述的纳米膜微流控胶体金检测装置和/或第二方面所述的纳米膜微流控胶体金检测装置的使用方法在以非疾病诊断和/或治疗为目的的样品检测中的应用。
40.相比于现有技术，本发明具有如下的有益效果：
41.(1)本发明可以同时检测多个项目，解决了多项目检测时耗时较长的问题；在同时检测多个项目时，只需要一次上样，解决了多项目检测时需要样本量较多的问题，且操作也更为简便；
42.(2)本发明使用纳米膜作为抗原包被和反应的载体，大幅度提高了检测反应的灵敏度与特异性；通过将金标微孔设置在芯片外，使混合可以在人为可控的条件下进行，反应也更为充分；将加样孔设置在微流控芯片的中心，同时将流动通道设置成辐射状，并将所有的流动通道设置成相同的长度，反应后的液体样本可以向四周均匀扩散，保证了所有检测反应的同时发生，进一步减少了检测所需的时间，同时也增加了检测反应的准确度。
附图说明
43.图1为纳米膜微流控胶体金检测装置的结构示意图。
44.图中，1-金标微孔，2-微流控芯片，3-纳米膜，4-吸水纸，5-加样孔，6-流动通道，7-渗滤孔，8-基板。
具体实施方式
45.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
46.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
47.材料：
48.胶体金-抗体结合物、氯霉素-bsa、磺胺-bsa、喹诺酮-bsa、β-内酰胺类抗生素-bsa、四环素-bsa、庆大霉素-bsa、卡那霉素-bsa、三氯氰胺-bsa、氟苯尼考-bsa、林可霉素-bsa、链霉素-bsa、新霉素-bsa、猪瘟病毒重组蛋白、猪蓝耳病毒重组蛋白、猪圆环病毒重组
蛋白、猪伪狂犬病毒重组蛋白、猪口蹄疫病毒重组蛋白、猪乙型脑炎病毒重组蛋白、猪传染性胃肠炎病毒重组蛋白、猪流行性腹泻病毒重组蛋白、猪水肿病病毒重组蛋白、副猪嗜血病毒重组蛋白、猪链球菌重组蛋白和猪丹毒杆菌重组蛋白购自无锡中德伯尔生物技术有限公司；
49.纳米膜购自德国赛多利斯集团；
50.氯霉素单抗、磺胺单抗、喹诺酮单抗、β-内酰胺类抗生素单抗、四环素单抗、庆大霉素单抗、卡那霉素单抗、三氯氰胺单抗、氟苯尼考单抗、林可霉素单抗、链霉素单抗、新霉素单抗和胶体金-protein a结合物购自广州优抗多生物技术有限公司。
51.实施例1
52.本实施例提供一种纳米膜微流控胶体金检测装置，纳米膜微流控胶体金检测装置的结构示意图如图1所示。
53.所述纳米膜微流控胶体金检测装置包括金标微孔1和检测卡；
54.所述检测卡包括自上而下依次层叠设置的微流控芯片2、纳米膜3、吸水纸4和基板8；
55.所述微流控芯片2上设有加样孔5、渗滤孔7以及连接所述加样孔5和渗滤孔7的流动通道6。
56.所述金标微孔1的材质为聚氧乙烯，所述金标微孔1中包埋有至少一种胶体金-抗体结合物，所述胶体金-抗体结合物中的抗体为待测物的特异性抗体。
57.所述微流控芯片2的材质为聚二甲基硅氧烷；所述纳米膜3为致密膜，材质为纳米硝酸纤维。
58.所述加样孔5位于所述微流控芯片2的中心；所述流动通道6以所述加样孔5为中心，呈辐射状分布；所述流动通道6的长度相同。
59.所述加样孔5的数量为1个；所述渗滤孔7和所述流动通道6的数量相同，均为12个。
60.所述微流控芯片2、纳米膜3和吸水纸4的面积相同。
61.所述纳米膜3在所述渗滤孔7对应的位置上包被有待测物偶联抗原。
62.所述检测卡的形状为正方形。
63.实施例2
64.本实施例以实施例1中的纳米膜微流控胶体金检测装置为基础，所述纳米膜3在所述渗滤孔7对应的位置上分别包被12种抗生素偶联抗原，每个对应的位置上仅包被1种抗生素偶联抗原，制成抗生素12联纳米膜微流控胶体金检测装置，结构示意图如图1所示，具体结构如下：
65.所述纳米膜微流控胶体金检测装置包括金标微孔1和检测卡；
66.所述检测卡包括自上而下依次层叠设置的微流控芯片2、纳米膜3、吸水纸4和基板8；
67.所述微流控芯片2上设有加样孔5、渗滤孔7以及连接所述加样孔5和渗滤孔7的流动通道6。
68.所述金标微孔1的材质为聚氧乙烯，所述金标微孔1中包埋有12种胶体金-抗体结合物，所述胶体金-抗体结合物中的抗体为待测物的特异性抗体，分别为氯霉素单抗、磺胺单抗、喹诺酮单抗、β-内酰胺类抗生素单抗、四环素单抗、庆大霉素单抗、卡那霉素单抗、三
氯氰胺单抗、氟苯尼考单抗、林可霉素单抗、链霉素单抗和新霉素单抗。
69.所述微流控芯片2的材质为聚二甲基硅氧烷；所述纳米膜3为致密膜，材质为纳米硝酸纤维。
70.所述加样孔5位于所述微流控芯片2的中心；所述流动通道6以所述加样孔5为中心，呈辐射状分布；所述流动通道6的长度相同。
71.所述加样孔5的数量为1个；所述渗滤孔7和所述流动通道6的数量相同，均为12个。
72.所述微流控芯片2、纳米膜3和吸水纸4的面积相同。
73.所述纳米膜3在所述渗滤孔7对应的位置上包被有待测物偶联抗原，所述抗原分别为氯霉素-bsa、磺胺-bsa、喹诺酮-bsa、β-内酰胺类抗生素-bsa、四环素-bsa、庆大霉素-bsa、卡那霉素-bsa、三氯氰胺-bsa、氟苯尼考-bsa、林可霉素-bsa、链霉素-bsa和新霉素-bsa。
74.所述检测卡的形状为正方形。
75.所述检测卡的检测原理为：当待测样本中待测物含量低于检测限或不含待测物时，胶体金-抗体结合物通过流动通道6后，与渗滤孔7处包被的检测抗原结合，形成红色圆点；当待测样本中待测物含量高于检测限时，待测物与胶体金-抗体结合物结合，通过流动通道6后，抗体没有多余位点与渗滤孔7处包被的检测抗原结合，不出现红色圆点。
76.所述检测卡判读方法为渗滤孔7中，出现红色圆点，说明待测样本中对应检测物含量低于检出限或不含该检测物，判定为阴性；不出现红色圆点，说明待测样本中对应检测物含量大于或等于检出限，判定为阳性。
77.所述检测卡检出限如表1所示。
78.表1
79.项目检出限(ng/ml)项目检出限(ng/ml)氯霉素0.1卡那霉素20磺胺类总量100三聚氰胺2000喹诺酮类总量100氟苯尼考0.1β-内酰胺类抗生素2林可霉素2四环素类总量100链霉素20庆大霉素20新霉素5
80.实施例3
81.本实施例使用实施例2制备的抗生素12联纳米膜微流控胶体金检测装置，对猪尿中抗生素进行检测，步骤如下：
82.(1)上样：取100μl待测尿液，加至金标微孔1中，反复吹打至金标微孔1内红色物质完全溶解后，将所有液体转移至加样孔5中；
83.(2)反应：反应等待10分钟；
84.(3)判读：根据渗滤孔7的颜色判断反应的阴阳性，渗滤孔7呈现红色为阴性反应，无颜色为阳性反应，再根据纳米膜3在所述渗滤孔7对应的位置上分别包被的抗生素检测抗原，判断样本中对应检测项目的阴阳性。
85.检测结果如表2所示。
86.表2猪尿中抗生素检测结果
87.项目检测结果(-/ )项目检测结果(-/ )氯霉素-卡那霉素-磺胺类-三聚氰胺-喹诺酮类 氟苯尼考-β-内酰胺类抗生素-林可霉素-四环素类 链霉素-庆大霉素-新霉素-88.表中，-：阴性， ：阳性。
89.如表2所示，该猪尿样本使用抗生素12联纳米膜微流控胶体金检测装置检测，其中喹诺酮类和四环素类残留量高于检出限，判定为阳性；其余10项残留低于检出限，判定为阴性。
90.实施例4
91.本实施例以实施例1中的纳米膜微流控胶体金检测装置为基础，所述纳米膜3在所述渗滤孔7对应的位置上分别包被12种病毒重组蛋白，每个对应的位置上仅包被1种病毒重组蛋白，制成猪疫苗抗体有效性12联纳米膜微流控胶体金检测装置，结构示意图如图1所示，具体结构如下：
92.所述纳米膜微流控胶体金检测装置包括金标微孔1和检测卡；
93.所述检测卡包括自上而下依次层叠设置的微流控芯片2、纳米膜3、吸水纸4和基板8；
94.所述微流控芯片2上设有加样孔5、渗滤孔7以及连接所述加样孔5和渗滤孔7的流动通道6。
95.所述金标微孔1的材质为聚氧乙烯，所述金标微孔1中包埋有冻干的胶体金-protein a结合物。
96.所述微流控芯片2的材质为聚二甲基硅氧烷；所述纳米膜3为致密膜，材质为纳米硝酸纤维。
97.所述加样孔5位于所述微流控芯片2的中心；所述流动通道6以所述加样孔5为中心，呈辐射状分布；所述流动通道6的长度相同。
98.所述加样孔5的数量为1个；所述渗滤孔7和所述流动通道6的数量相同，均为12个。
99.所述微流控芯片2、纳米膜3和吸水纸4的面积相同。
100.所述纳米膜3在所述渗滤孔7对应的位置上包被有猪病毒重组蛋白，所述猪病毒重组蛋白分别为猪瘟病毒重组蛋白、猪蓝耳病毒重组蛋白、猪圆环病毒重组蛋白、猪伪狂犬病毒重组蛋白、猪口蹄疫病毒重组蛋白、猪乙型脑炎病毒重组蛋白、猪传染性胃肠炎病毒重组蛋白、猪流行性腹泻病毒重组蛋白、猪水肿病病毒重组蛋白、副猪嗜血病毒重组蛋白、猪链球菌重组蛋白和猪丹毒杆菌重组蛋白。
101.所述检测卡的形状为正方形。
102.所述检测卡的检测原理为：当待测样本中待测抗体含量低于检测限或不含待测抗体时，胶体金-protein a结合物通过流动通道6后，与渗滤孔7处包被的重组蛋白不结合，不出现红色圆点，判定为疫苗免疫无效；当待测样本中待测抗体含量高于检测限时，待测抗体与胶体金-protein a结合物结合，形成胶体金-protein a-抗体复合物，通过流动通道6后，
胶体金-protein a-抗体复合物与渗滤孔7处包被的重组蛋白结合，形成红色圆点，判定为疫苗免疫有效。
103.所述检测卡判读方法为渗滤孔7中，出现红色圆点，说明待测样本中对应中和抗体含量高于检出限，判定为疫苗免疫有效；不出现红色圆点，说明待测样本中对应中和抗体含量低于检出限，判定为疫苗免疫无效。
104.实施例5
105.本实施例使用实施例4制备的猪疫苗抗体有效性12联纳米膜微流控胶体金检测装置，对血清中的抗体进行检测，步骤如下：
106.(1)上样：取100μl待测猪血清，加至金标微孔1中，反复吹打至金标微孔1内红色物质完全溶解后，将所有液体转移至加样孔5中；
107.(2)反应：反应等待10分钟；
108.(3)判读：根据渗滤孔7的颜色判断反应的阴阳性，渗滤孔7呈现红色为阳性反应，无颜色为阴性反应，再根据纳米膜3在所述渗滤孔7对应的位置上分别包被的猪病毒重组蛋白，判断样本中对应检测项目的阴阳性。
109.检测结果如表3所示。
110.表3猪血清中抗体检测结果
[0111][0112][0113]
表中，-：阴性， ：阳性。
[0114]
如表3所示，该猪血清样本使用猪疫苗抗体有效性12联纳米膜微流控胶体金检测装置，对血清中的抗体进行检测，其中猪乙型脑炎、猪流行性腹泻、猪水肿、猪链球菌4项抗体浓度低于检出限，判定该4项疫苗免疫效果不足或未进行疫苗免疫；其余8项抗体浓度高于检出限，判定该8项疫苗免疫效果有效。
[0115]
综上所述，本发明提供了一种纳米膜微流控胶体金检测装置，所述纳米膜微流控胶体金检测装置通过对加样孔的位置、流动通道的形状与长度进行设置，使充分反应后的液体样本可以向四周均匀扩散，保证了所有检测反应的同时发生，增加了检测的精准度；选用纳米膜作为反应载体，提高了反应的灵敏度与特异性；所述纳米膜微流控胶体金检测装置使用方便，操作简单，可实现大批量样本的同时检测，应用价值广泛。
[0116]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。