一种碳量子点纳米组装体的制备方法及其应用

1.本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种碳量子点纳米组装体的制备方法及其应用。


背景技术：

2.癌症是一类严重危害人类生命健康和生活质量的疾病。随着医学科技的不断进步，癌症的诊疗已经从经验医学、循证医学进而迈入精准医学时代。由于精准诊疗将诊断和治疗功能整合为一体，因此相对于单一的诊断或治疗手段具有明显的优势。当前，成像介导治疗体系已成为现代医学影像技术的发展趋势。其中，磁共振成像(mri)技术是癌症早期诊断的常用技术之一。与其他成像技术手段相比，mri具有高组织分辨力、高空间分辨力、无硬性伪影和无放射性损伤等优点。目前，临床诊断中约半数磁共振成像需要用到造影剂。然而，目前应用的钆基造影剂成像效果并不十分理想，例如钆喷替酸葡甲胺(gd-dtpa)弛豫率一般是在4左右，灵敏性和准确性较差。这些推动着科学创新朝着开发更优异的磁共振成像造影剂的方向发展。
3.碳量子点是一种新型的碳基纳米材料，尺寸在10nm以下，具有高生物安全性和易于功能化等优异性能，使其在生物学和医学研究领域有广阔的应用前景，可应用于生物分析与检测、生物成像、癌症治疗和纳米药物等领域。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种碳量子点纳米组装体的制备方法，获得的碳量子点纳米组装体可以作为造影剂用于核共振成像。
5.本发明的一个目的在于提供一种碳量子点纳米组装体的制备方法，以紫胶色酸a为前驱体，经过溶剂热反应生成碳量子点，利用含铁无机盐为络合剂使得碳量子点形成碳量子点纳米组装体。
6.本发明以紫胶色酸a为前驱体，紫胶色酸a是一种食品添加剂，本身安全无毒，制备出的材料生物安全性较高；且紫胶色素a具有多酚结构，多酚结构在形成的碳量子点与铁离子络合成纳米组装体中起到关键作用。
7.紫胶色酸a经过溶剂热反应后形成碳量子点，碳量子点表面的多酚结构与含铁无机盐络合从而使碳量子点形成组装体，成功制备碳量子点纳米组装体。
8.作为优选，所述碳量子点纳米组装体的制备方法包括以下步骤：
9.1)将紫胶色酸a加入有机溶剂至溶解；
10.2)将步骤1)的溶液在空气气氛下进行溶剂热反应，反应后，经硅胶柱层析分离提纯除去多余杂质，随后除去溶剂(可以采用旋转蒸发方式除去溶剂，此处的溶剂为硅胶柱层析中采用的洗脱剂)，将得到的粉末分散于水中，静置，抽滤，倒出上清液装入透析袋中，在水中透析，然后冻干得到碳量子点；
11.3)将步骤2)得到的碳量子点分散于含铁无机盐水溶液中，超声反应10～60min，静
置后，装入透析袋中，在水中透析，冻干得碳量子点纳米组装体。
12.紫胶色酸a溶于有机溶剂中形成0.05～0.5mol/l的紫胶色酸a溶液。作为优选，有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、甲酰胺、二甲基亚砜、无水乙醇中的一种或多种。
13.步骤1)得到的紫胶色酸a溶液转移至含聚四氟乙烯内衬的不锈钢水热合成釜中，放入马弗炉，在空气氛围下进行溶剂热反应，作为优选，溶剂热反应为：以2～10℃/min的速率升温至140-200℃，反应4～12h。
14.作为优选，步骤2)中，硅胶柱层析分离提纯采用石油醚、乙酸乙酯和甲醇中的一种或多种混合物作为洗脱剂。
15.作为优选，步骤2)中，抽滤时采用孔径为0.20～0.50μm的水性微孔滤膜。经过抽滤，去除溶液中的大颗粒。
16.作为优选，步骤2)和步骤3)中的透析袋截留分子量为500～5000，透析时间为48～96h，冻干时间为50～80h。
17.含铁无机盐水溶液为含铁无机盐溶于水溶液中形成，优选为含铁无机盐的浓度为0.01～0.5mol/l，通过调控铁离子的浓度可以控制碳量子点纳米组装体的尺寸大小。
18.作为优选，含铁无机盐为氯化铁、硝酸铁、硫酸铁、氯化亚铁、硫酸亚铁中的一种或多种混合物。
19.在本发明中，碳量子点的质量与含铁无机盐水溶液的体积的比例不做具体限制，可以举例为：碳量子点的质量(mg)与含铁无机盐水溶液的体积(ml)的比例为1：(5～50)。
20.本发明的另一个目的在于提供一种通过上述制备方法制备获得的碳量子点纳米组装体。
21.本发明的另一个目的在于将上述碳量子点纳米组装体作为造影剂应用于磁共振成像。
22.制备的碳量子点纳米组装体用于制备造影剂，造影剂一般通过静脉注射的方式使用，粒径不能太大，因此所述的碳量子点纳米组装体的粒径优选为10～200nm。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24.(1)本发明以紫胶色酸a为前驱体，以含铁无机盐为络合剂，成功制备了碳量子点纳米组装体；
25.(2)本发明制得碳量子点纳米组装体不仅易分散于无水乙醇、n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇等有机溶剂，而且能较好地分散于水、磷酸盐缓冲溶液、生物培养基等水溶液体系中；
26.(3)本发明制备的碳量子点纳米组装体粒径较小均匀，结构稳定，且具有良好的mri t1成像效果，可用作造影剂；
27.(4)本发明制得的碳量子点纳米组装用于磁共振成像造影时具有优秀的生物安全性，在模拟体液环境下，几乎没有铁离子释放，其血液循环半衰期长达5h；
28.(5)本发明制得的碳量子点纳米组装体作为造影剂应用在磁共振成像中，具有高t1成像系数、体内循环时间长、良好的生物安全性和超低成本，可适用于淋巴瘤、乳腺癌、脑胶质瘤等的早期影像学诊断，有望替代市售的钆基造影剂gd-dtpa。
附图说明
29.图1为本发明实施例1制备的碳量子点及碳量子点纳米组装体的高分辨透射电镜图；
30.图2(a)为本发明实施例1制备的碳量子点在超纯水中的紫外可见吸收光谱，图2(b)为本发明实施例1制备的碳量子点纳米组装体在超纯水中的紫外可见吸收光谱，图2(c)为本发明实施例1制备的碳量子点在超纯水中的荧光发射光谱图，图2(d)为本发明实施例1制备的碳量子点纳米组装体在超纯水中的荧光发射光谱图；
31.图3为本发明实施例1制备的碳量子点纳米组装体的mri t1成像结果；
32.图4为本发明实施例1制备的碳量子点在不同浓度下与hela细胞共培养24h后，采用mtt法测试细胞毒性的结果；
33.图5为本发明对比例1制备的碳量子点纳米组装体的mri t1成像结果。
具体实施方式
34.下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步描述说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于帮助理解本发明，不用于本发明的具体限制。且本文中所使用的附图，仅仅是为了更好地说明本发明所公开内容，对保护范围并不具有限制作用。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
35.实施例1
36.一种可用于磁共振成像的碳量子点纳米组装体的制备方法，具体包括以下步骤：
37.1)称取2.15g紫胶色酸a溶于20ml n,n-二甲基甲酰胺中，形成0.2mol/l紫胶色酸a溶液；
38.2)将上述步骤1)得到的紫胶色酸a溶液转移至含聚四氟乙烯内衬的不锈钢水热合成釜中，放入马弗炉，在空气氛围下以5℃/min的速率升温至180℃，反应8h，反应结束后取出水热合成釜中的碳化溶液，过硅胶柱层析，以乙酸乙酯为洗脱液，经硅胶柱层析分离提纯技术除去多余杂质；随后除去洗脱液，将得到的粉末分散于20ml的超纯水中，静置后，用孔径0.22μm的水性微孔滤膜真空抽滤，倒出上清液，重复5次，将上清液装入截留分子量为500～1000的透析袋中，在超纯水中透析72h，之后冻干处理72h，得到褐色的碳量子点。
39.3)将步骤2)得到的10mg碳量子点粉末分散于200ml 0.05mol/l氯化铁水溶液中，超声反应30min，静置后，装入截留分子量为500～1000的透析袋中，在超纯水中透析72h，之后冻干处理72h，得到深褐色的碳量子点纳米组装体。
40.步骤2)制得的碳量子点，其高分辨透射电镜图如图1a所示，可见碳量子点形貌为类似球形结构，尺寸大约为3nm；步骤3)制得的碳量子点纳米组装体，其高分辨透射电镜图如图1b所示，可见组装体形貌为不规则结构，尺寸大约为30nm。
41.图2(a)为碳量子点在超纯水中的紫外可见吸收光谱，图2(b)为碳量子点纳米组装体在超纯水中的紫外可见吸收光谱，图2(c)为碳量子点在超纯水中的荧光发射光谱图，图2(d)为碳量子点纳米组装体在超纯水中的荧光发射光谱图，分析可知碳量子点和碳量子点纳米组装体水溶液在455nm和635nm有荧光发射峰。
42.所制备的碳量子点纳米组装体水溶液的mri t1成像结果如图3所示，随着碳量子
点纳米组装体浓度的增大，mri t1信号逐渐增强。而碳量子点溶液无法mri t1成像。
43.采用mtt法检测制得的碳量子点纳米组装体的细胞毒性。mtt细胞毒性测试结果显示hela细胞(人类子宫颈癌细胞)与不同浓度的碳量子点纳米组装体共培养24h后，结果如图4所示。由图4可知，hela细胞的存活率仍维持在80％以上，表明制得的碳量子点纳米组装体具有良好的生物相容性。
44.其中，hela细胞培养条件：在60nm细胞培养皿中，加入3ml含10％胎牛血清的dmem培养液，置于37℃、5％co2恒温培养箱中培养。hela为贴壁细胞，待细胞长到80％时，用1ml的0.25％的胰蛋白酶液消化2min，用1ml含10％胎牛血清的培养液终止胰酶作用，反复吹打皿底细胞使其充分分散。在100rpm转速下，离心5min，弃去上清液，在细胞沉淀中加入新鲜培养基，吹打均匀后以1：4的比例转到新培养皿中继续培养待用。
45.实施例2
46.本实施例的可用于磁共振成像的碳量子点纳米组装体的制备方法，具体包括以下步骤：
47.1)称取6.45g紫胶色酸a溶于40ml n,n-二甲基甲酰胺中，形成0.3mol/l紫胶色酸a溶液；
48.2)将上述步骤1)得到的紫胶色酸a溶液转移至含聚四氟乙烯内衬的不锈钢水热合成釜中，放入马弗炉，在空气氛围下以8℃/min的速率升温至200℃，反应6h，反应结束后取出水热合成釜中的碳化溶液，过硅胶柱层析，以石油醚为洗脱液，经硅胶柱层析分离提纯技术除去多余杂质；随后除去洗脱液，将得到的粉末分散于40ml的超纯水中，静置后，用孔径0.22μm的水性微孔滤膜真空抽滤，倒出上清液，重复5次，将上清液装入截留分子量为500～1000的透析袋中，在超纯水中透析80h，之后冻干处理60h，得到褐色的碳量子点；
49.3)将步骤2)得到的10mg碳量子点粉末分散于150ml 0.1mol/l硝酸铁水溶液中，超声反应40min，静置后，装入截留分子量为500～1000的透析袋中，在超纯水中透析80h，之后冻干处理60h，得到深褐色的碳量子点纳米组装体。
50.碳量子点纳米组装体制备的溶液具有良好的mri t1成像效果，随着碳量子点纳米组装体浓度的增大，mri t1信号逐渐增强。
51.对比例1
52.对比例1与实施例1的区别在于，对比例1将实施例1步骤3)中0.05mol/l氯化铁溶液改为0.05mol/l硝酸钆溶液，其余制备方法与实施例1相同。
53.其制备的碳量子点纳米组装体溶液的mri t1成像结果如图5所示，随着样品浓度的增大，mri t1信号逐渐增强。但是对比例1的碳量子点纳米组装体溶液的mri t1信号弱于实施例1的，表明采用硝酸钆溶液替代氯化铁溶液虽然可以实现mri t1成像，但是效果不如氯化铁溶液。
54.最后应说明的是，本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明，而并非对本发明的实施方式的限定。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具有实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，这里无需也无法对所有的实施方式予以全例。而这些属于本发明的实质精神所引申出的显而易见的变化或变动仍属于本发明的保护范围，把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。