一种伪狂犬病毒的纯化方法与流程

1.本发明涉及一种动物疫苗分离纯化领域，具体说是伪狂犬病毒的纯化方法。


背景技术：

2.伪狂犬病(porcine pseudorabies)是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus，prv)引起的发生在多种家畜和野生动物体内的一种急性传染病，以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要发病症状。猪是伪狂犬病的唯一自然宿主，对其危害大。成年猪常表现为隐性感染，妊娠母猪感染后可引起流产、死胎以及呼吸系统疾病症状。新生仔猪感染后除了出现神经症状外，还可侵害消化系统。伪狂犬病给猪养殖业造成的危害仅次于猪瘟。伪狂犬病的传播和蔓延，给养殖业造成了巨大损失，全世界每年因伪狂犬病造成的经济损失高达数十亿美元，因此该病引起了世界各国的高度重视。伪狂犬病目前尚无特效治疗药物，因而以预防为主，通过疫苗的免疫接种是预防和控制猪伪狂犬病的根本措施。要生产伪狂犬病毒疫苗就需要对伪狂犬病毒进行纯化。
3.目前，猪伪狂犬病毒液通常采用连续流离心、死端过滤、常规超滤及分子筛层析等方法。如，公布号为cn103937758a的中国专利申请公布了一种猪伪狂病毒纯化方法，它主要采用了微滤澄清纯化法，超滤浓缩纯化法，重复洗滤法等一系列工艺；公布号为 cn110129287a的中国专利申请公布了一种猪伪狂犬病毒双重超滤系统及纯化方法，同样提供了一种双重超滤系统用于种猪伪狂犬病毒的纯化方法；公布号为cn107254449a的中国专利申请公布了一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，它是通过连续流离心、中空纤维澄清过滤、超滤浓缩、分子筛纯化工艺相结合，制备用于疫苗的prv浓缩液。然而，超滤步骤会降低病毒的收率。且，分子筛层析所需填料体积大、上样量小(不超过10％)，纯化效率非常低。
4.公布号cn108660119b的中国申请专利公布了一种伪狂犬病毒的纯化方法，该方法提出了采用肝素亲和介质进行一步层析，纯化伪狂犬病毒的方法。然而，肝素亲和填料的配基采用了外源生物制品，具有潜在风险。且该方法的上样量也较小，效率仅略高于分子筛层析。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供一种伪狂犬病毒的纯化方法，该纯化方法的不会降低病毒的收率，上样量大，纯化效率高，没有潜在风险。
6.为解决上述问题，提供以下技术方案：
7.本发明的伪狂犬病毒的纯化方法的特点是包括如下步骤：
8.第一步，制备待纯化样品液
9.a.选取伪狂犬病毒的收获液作为原料备用。
10.b.将原料经2800-3200rpm的转速、离心10-30min去除细胞碎片，取出上清。
11.c.在上清中加入1-2倍体积的ph5-6的样品缓冲液，得到ph为6-7、电导为 8-15ms/
cm待纯化样品液。
12.第二步，获取浓缩液
13.a.选取亲和层析柱并利用平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡处理，至流出液的ph 和电导稳定；所述亲和层析柱，是装填填料为vircap af的硫酸酯亲和介质的层析柱，该亲和介质为超大孔聚合物基质，粒径50-70μm，孔径300nm以上，偶联非动物源类肝素硫酸酯配基的亲和介质。
14.b.将待纯化样品液经平衡处理后的亲和层析柱上样，上样体积为5-15倍柱体积，上样流速为100-300cm/h。
15.c.用淋洗缓冲液，以100-500cm/h的流速对上样后的亲和层析柱淋洗。
16.d.用洗脱缓冲液，以100-500cm/h的流速对淋洗后的亲和层析柱洗脱，所收集的洗脱液即为纯化后的浓缩伪狂犬病毒。
17.其中，所述伪狂犬病毒的收获液为贴壁/悬浮培养的伪狂犬病毒收获液。
18.所述样品缓冲液是5-15mm的磷酸盐缓冲液或mes缓冲液。
19.所述亲和层析柱的平衡处理过程是，采用5-10倍柱体积的ph6-7的10-50mm的磷酸盐缓冲液或mes缓冲液作为平衡缓冲液，以100-500cm/h的流速平衡亲和层析柱，至流出液的ph和电导稳定。
20.所述淋洗缓冲液为ph6-7的10-50mm的磷酸盐缓冲液或mes缓冲液。
21.所述洗脱缓冲液为含有0.5-1.5m氯化钠的ph8-10的磷酸盐缓冲液或tris缓冲液。
22.采取以上方案，具有以下优点：
23.由于本发明的伪狂犬病毒的纯化方法将伪狂犬病毒收获液离心、取上清，用样品缓冲液稀释，调节ph，得到待纯化样品液，再将待纯化样品液经装填型号为vircap af 的硫酸酯亲和介质的层析柱上样、淋洗、洗脱得到纯化的伪狂犬病毒浓缩液。这种纯化方法没有超滤步骤，不会降低病毒的收率。而且，vircap af的硫酸酯亲和介质为超大孔聚合物基质，粒径50-70μm，孔径300nm以上，偶联非动物源类肝素硫酸酯配基的亲和介质，这种亲和介质上样体积为5-15倍柱体积，上样量大，从而减少了填料的体积，大大提高了纯化的效率。而且，vircap af的硫酸酯亲和介质为类似肝素亲和填料，其配基非动物来源，具有更高的生物安全性，避免了潜在风险，刚性的聚合物基材具有更高的操作流速和柱床稳定性，伪狂病毒能够被该填料吸附，其他杂质在上样过程流穿，被吸附的伪狂病毒经洗脱从而实现了伪狂犬病毒从粗提液中分离出来并得到浓缩。
附图说明
24.图1是本发明的伪狂犬病毒的纯化方法中实施例一的层析图谱；
25.图2是本发明的伪狂犬病毒的纯化方法中实施例二的层析图谱；
26.图3是本发明的伪狂犬病毒的纯化方法中实施例三的层析图谱；
27.图4是实施例一、实施例二和实施例三的待纯化样品液、流穿液和洗脱液的gb抗原 western blot检测图。
具体实施方式
28.以下结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
29.实施例一
30.一种伪狂犬活病毒的纯化方法包括如下步骤：
31.第一步，制备待纯化样品液
32.a.将悬浮培养的伪狂犬病毒收获液解冻后作为原料备用；
33.b.将原料经2800rpm的转速、离心20min去除细胞碎片，取出上清；
34.c.在上清中加入1倍体积的ph6的10mm的磷酸盐缓冲液作为样品缓冲液，得到ph 为7、电导为15ms/cm的待纯化样品液；
35.第二步，获取浓缩液
36.a.选取亲和层析柱并用5倍柱体积的ph为7的10mm的磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液，以300cm/h的流速平衡亲和层析柱至流出液的ph和电导稳定。所述亲和层析柱，是装填填料为vircap af的硫酸酯亲和介质的层析柱，该亲和介质为超大孔聚合物基质，粒径50μm，孔径300nm，偶联非动物源类肝素硫酸酯配基的亲和介质。本实施例中亲和介质的层析柱的直径3.6cm，高度20cm，柱体积200ml。
37.b.将待纯化样品液经平衡处理后的亲和层析柱上样，上样体积为15倍柱体积，上样流速为300cm/h；
38.c.用ph为7的10mm的磷酸盐缓冲液作为淋洗缓冲液，以300cm/h的流速对上样后的亲和层析柱淋洗，收集的流穿液为杂质蛋白、色素、内毒素等。
39.d.用含有1.5m氯化钠的ph8的磷酸盐缓冲液作为洗脱缓冲液，以300cm/h的流速对淋洗后的亲和层析柱洗脱，所收集的洗脱液即为纯化后的浓缩伪狂犬病毒。
40.实施例一的层析图谱如图1所示。
41.实施例二
42.一种伪狂犬活病毒的纯化方法包括如下步骤：
43.第一步，制备待纯化样品液
44.a.将悬浮培养的伪狂犬病毒收获液解冻后作为原料备用；
45.b.将原料经3000rpm的转速、离心10min去除细胞碎片，取出上清；
46.c.在上清中加入1.5倍体积的ph5.5的15mm的mes缓冲液作为样品缓冲液，得到 ph为6.2、电导为10ms/cm的待纯化样品液；
47.第二步，获取浓缩液
48.a.选取亲和层析柱并用10倍柱体积的ph6.2的20mm的磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液，以500cm/h的流速平衡亲和层析柱至流出液的ph和电导稳定。所述亲和层析柱，是装填填料为vircap af的硫酸酯亲和介质的层析柱，该亲和介质为超大孔聚合物基质，粒径50μm，孔径320nm，偶联非动物源类肝素硫酸酯配基的亲和介质。本实施例中亲和介质的层析柱的直径3.6cm，高度20cm，柱体积200ml。
49.b.将待纯化样品液经平衡处理后的亲和层析柱上样，上样体积为10倍柱体积，上样流速为200cm/h；
50.c.用ph6.2的20mm的磷酸盐缓冲液作为淋洗缓冲液，以500cm/h的流速对上样后的亲和层析柱淋洗，收集的流穿液为杂质蛋白、色素、内毒素等。
51.d.用含有1.0m氯化钠的ph9的磷酸盐缓冲液作为洗脱缓冲液，以500cm/h的流速对淋洗后的亲和层析柱洗脱，所收集的洗脱液即为纯化后的浓缩伪狂犬病毒。
52.实施例二的层析图谱如图2所示。
53.实施例三
54.一种伪狂犬灭活病毒的纯化方法包括如下步骤：
55.第一步，制备待纯化样品液
56.a.将贴壁培养的伪狂犬病毒收获液解冻后作为原料备用；
57.b.将原料经3200rpm的转速、离心30min去除细胞碎片，取出上清；
58.c.在上清中加入2倍体积的ph5.0的5mm的mes缓冲液作为样品缓冲液，得到ph 为6.0、电导为8ms/cm的待纯化样品液；
59.第二步，获取浓缩液
60.a.选取亲和层析柱并用10倍柱体积的ph6.0的50mm的mes缓冲液作为平衡缓冲液，以100cm/h的流速平衡亲和层析柱至流出液的ph和电导稳定。所述亲和层析柱，是装填填料为vircap af的硫酸酯亲和介质的层析柱，该亲和介质为超大孔聚合物基质，粒径70μm，孔径350nm，偶联非动物源类肝素硫酸酯配基的亲和介质。本实施例中亲和介质的层析柱的直径1.6cm，高度15cm，柱体积30ml。
61.b.将待纯化样品液经平衡处理后的亲和层析柱上样，上样体积为5倍柱体积，上样流速为100cm/h；
62.c.用ph6.0的50mm的mes缓冲液作为淋洗缓冲液，以100cm/h的流速对上样后的亲和层析柱淋洗，收集的流穿液为杂质蛋白、色素、内毒素等。
63.d.用含有0.5m氯化钠的ph10的tris缓冲液作为洗脱缓冲液，以100cm/h的流速对淋洗后的亲和层析柱洗脱，所收集的洗脱液即为纯化后的浓缩伪狂犬病毒。
64.实施例三的层析图谱如图3所示。
65.分别取实施例一、实施例二的纯化样品液、流穿液和洗脱液进行tcid50检测，分别取实施例一、实施例二和实施例三的待纯化样品液、流穿液和洗脱液进行bca蛋白浓度检测、gb抗原western blot检测和gd抗原半定量elisa检测。
66.检测结果：
67.tcid50检测结果：
[0068][0069]
bca蛋白检测结果：
[0070]
[0071]
gb抗原western bolt检测结果见图4。
[0072]
gd抗原elisa半定量检测结果：
[0073][0074]
用本发明的伪狂犬病毒的纯化方法，纯化未灭活伪狂犬病毒，以tcid50为检测手段，病毒收率达到85-95％，与传统分子筛层析法相当，杂蛋白去除效率高达90％，而上样量是分子筛法的几十至一百倍，且不必对样品进行超滤浓缩处理，避免造成病毒损失。gb抗原western bolt检测表明纯化过程几乎没有gb抗原的损失，gd抗原的收率至少为50％以上，显著高于分子筛层析的收率(约为20％左右)。