一种具有抗炎活性成分烟籽油的制备方法及抗炎活性评价方法及应用与流程

1.本发明属于烟草产品技术领域，具体涉及一种具有抗炎活性成分烟籽油的制备方法及抗炎活性评价方法及应用。


背景技术：

2.烟籽是烟草的种子，长期以来，烟籽的应用主要集中于品种选育及工商业原料生产，因此，针对烟籽的研究工作主要围绕提高种子产质量展开。而有关烟籽多功能探索、原料及产品开发前景、市场应用范围等方面的研究工作十分稀少，技术缺口明显。同时，大田生产中，烟草种子繁殖系数高，烟籽产量远远超过工商业烟叶生产原料需求，富余烟籽量很大。技术不足和库存过剩，很大程度上限制了烟籽资源的利用。近年来，针对废弃烟叶、烟杆等资源进行利用研究的报道较多，但对烟籽综合利用的研究报道确很少。
3.烟籽富含脂肪油，是一种很好的脂肪油原料，油脂含量高达40％～50％，从烟籽中经物理压榨出的烟籽油在油脂化学工业上有多种用途，如在制皂工业中用于制备皂类制品，在制漆工业中作为原料制备醇酸树脂漆，但是经物理压榨出的烟籽油无法进行精细应用。烟籽作为烟草产品的一种，具备巨大的科研及应用潜力，因此，开发一种烟籽油并对其功能应用进行探索十分重要。
4.鉴于以上情况，有必要研究一种具有抗炎活性成分烟籽油的制备方法及抗炎活性评价方法及应用用于解决上述技术问题。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种具有抗炎活性成分烟籽油的制备方法，本发明的第二个目的在于提供烟籽油的抗炎活性评价方法，本发明的第三个目的在于提供具有抗炎活性成分烟籽油的应用。
6.本发明的第一个目的是这样实现的，一种具有抗炎活性成分烟籽油的制备方法，包括如下步骤：
7.(1)原料选取：采集成熟的烟草蒴果，晾晒至烟草蒴果干燥；将烟草蒴果进行脱粒后风选获得饱满烟草籽，将所述饱满烟草籽洗净后干燥至含水率降至8％～10％，备用；
8.(2)将步骤(1)中干燥后的饱满烟草籽经破碎后进行冷压榨，获得冷压榨后的烟籽初油；
9.(3)将步骤(2)中的烟籽初油以7000-8000r/min离心分离后弃固相物质，获得烟籽初油；
10.(4)将步骤(3)中的烟籽初油中加入生物吸附剂，置于恒温摇床中振荡吸附反应6-8h；
11.(5)待步骤(4)反应结束后，用微孔滤膜分离过滤除去生物吸附剂，获得烟籽油半成品；
12.(6)将步骤(5)中的烟籽油半成品放入分子蒸馏仪中，在90-100℃、100pa条件下进行第一次分子蒸馏，冷凝后获到第一馏分为一级轻组分的烟籽油l1；将第一次蒸馏剩余物在100-110℃、10pa条件下继续进行第二次分子蒸馏，冷凝得到的第二馏分为二级轻组分的烟籽油l2；将第二次蒸馏剩余物在120-130℃、1pa条件下继续进行三级分子蒸馏，冷凝后获得第三馏分为三级轻组分的烟籽油l3；
13.(7)将步骤(6)中的烟籽油l1、烟籽油l2和烟籽油l3合并，即获得具有抗炎活性成分的烟籽油。
14.优选地，步骤(2)中所述冷压榨为将饱满烟草籽破碎至粒度为60-70目后，在70℃以下进行冷压榨。
15.优选地，步骤(4)中所述生物吸附剂优选为酵母粉末，所述酵母粉末与烟籽初油的质量比为1:20。
16.优选地，步骤(5)中所述微孔滤膜的孔径为0.32μm。
17.优选地，步骤(6)中所述分子蒸馏仪的进料速度为50ml/h，转子转速为120r/min。
18.本发明的第二个目的是这样实现的，一种烟籽油的抗炎活性评价方法，包括以下步骤：
19.s1：将权利要求1-5任一项所述的具有抗炎活性成分的烟籽油进行gc-ms检测，检测出所述具有抗炎活性成分烟籽油中的脂肪酸含量和挥发性成分含量；
20.s2：以地塞米松为阳性对照，测定10μm地塞米松对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量；
21.s3：选取25-100μg/ml的烟籽油，测定不同浓度烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量；
22.s4：将步骤s2中的10μm地塞米松对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量与步骤s3中对应的不同浓度烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量进行对比，确定烟籽油的抗炎活性能力；
23.s5：结合步骤s4中确定的烟籽油抗炎活性能力、步骤s1中的烟籽油脂肪酸含量和挥发性成分含量，对烟籽油的抗炎活性能力进行综合评价。
24.优选地，步骤s1中所述脂肪酸含量的gc-ms检测条件为：
25.gc检测条件：进样口温度240℃；载气为99.999％高纯氦气，流速为1ml/min，不分流进样；色谱柱型号为hp-5的30m
×
0.32mm
×
0.25μm石英毛细管柱，程序升温条件：柱温箱初始温度40℃，然后以1℃/min的速度增加到80℃；再以20℃/min的速率增加到250℃，保持10min；
26.ms检测条件：离子源为ei源，电子能量70ev，接口温度250℃，离子源温度230℃，质量扫描范围30-540m/z，溶剂延迟3min，全扫描模式。
27.优选地，步骤s2或步骤s3中，地塞米松或烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量的测定方法均为：
28.培养raw264.7细胞并接种于培养基中，待raw264.7细胞完全贴壁生长后，移除培养基；加入25-100μg/ml烟籽油和10μm地塞米松处理raw264.7细胞，处理结束后移除上清液，利用pbs清洗raw264.7细胞后重新加入lps继续培养；培养结束后收集裂解液，按试剂盒
说明书测定raw264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量。
29.本发明的第三个目的是这样实现的，一种具有抗炎活性成分烟籽油的应用，所述具有抗炎活性成分的烟籽油经抗炎活性评价合格后添加于凡士林中作为抗炎膏霜、或添加于蜂蜡中作为唇炎唇膏、或直接作为抗炎精油。
30.与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
31.1、本发明通过先将烟草籽利用冷压榨法榨取烟籽初油，再将经生物吸附剂吸附及微孔滤膜分离过滤后的烟籽半成品油进行三次分子蒸馏，使其抗炎活性成分富集，获得具有抗炎活性成分的功能性烟籽油。
32.2、本发明通过采用酵母粉作为生物吸附剂吸附，采用微孔滤膜分离过滤烟籽初油，能有效去除烟草籽冷压榨时产生的重金属、盐分、色素及杂质等。
33.3、本发明通过将烟籽油半成品在不同温度和压强下进行三次分子蒸馏，通过严格控制蒸馏温度，不仅能有效保留烟籽油的抗炎活性成分，还能再次分离出烟籽油中的杂质成分，通过三次分子蒸馏获得了具有抗炎活性成分的高纯度功能性烟籽油。
34.4、本发明通过将烟籽油的抗炎活性进行综合评价，确定烟籽油具有抗炎活性成分；将经抗炎活性评价合格的烟籽油添加于凡士林中作为抗炎膏霜、或添加于蜂蜡中作为唇炎唇膏、或直接作为抗炎精油，发挥烟籽油的抗炎活性。
35.5、本发明不仅提高了烟草资源的利用率，还拓宽了烟籽油的用途及市场应用前景。
附图说明
36.图1为本发明实施例1中的香料烟保山4号烟籽油细胞毒性测定；
37.图2为本发明实施例1中香料烟保山4号烟籽油及10μm地塞米松(dxm)对lps诱导raw 264.7细胞中一氧化氮(no)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素6(il-6)含量测定；
38.图中，k：空白对照组；m：lps组；y：阳性组(地塞米松)
#
p《0.05vs k组，*p《0.05、**p《0.01vs m组；
39.图3为本发明实施例2中的野生烟rustica烟籽油细胞毒性测定；
40.图4为本发明实施例2中野生烟rustica烟籽油及10μm地塞米松(dxm)对lps诱导raw 264.7细胞中一氧化氮(no)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素6(il-6)含量测定；
41.图中，k：空白对照组；m：lps组；y：阳性组(地塞米松)
#
p《0.05vs k组，*p《0.05、**p《0.01vs m组；
42.图5为本发明实施例3中的烤烟nc89烟籽油细胞毒性测定；
43.图6为本发明实施例3中烤烟nc89烟籽油及10μm地塞米松(dxm)对lps诱导raw 264.7细胞中一氧化氮(no)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素6(il-6)含量测定；
44.图中，k：空白对照组；m：lps组；y：阳性组(地塞米松)
#
p《0.05vs k组，*p《0.05、**p《0.01vs m组。
具体实施方式
45.下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
46.实施例1
47.本实施例以香料烟中的保山4号品种为例。
48.1.1一种具有抗炎活性成分烟籽油的制备方法，包括如下步骤：
49.(1)原料选取：采集成熟的保山4号烟草蒴果，晾晒至保山4号烟草蒴果干燥；将烟草蒴果进行脱粒后风选获得饱满的保山4号烟草籽，将所述饱满烟草籽洗净后干燥至含水率降至9％，备用；
50.(2)将干燥后的饱满保山4号烟草籽破碎至粒度为60目后，在70℃以下进行冷压榨，获得冷压榨后的烟籽初油；
51.(3)将冷压榨后的烟籽初油以7500r/min离心分离后弃固相物质，获得烟籽初油；
52.(4)将烟籽初油中加入酵母粉末生物吸附剂，酵母粉末与烟籽初油的质量比为1:20，置于恒温摇床中振荡吸附反应7h；
53.(5)待步骤(4)反应结束后，用0.32μm微孔滤膜分离过滤除去酵母粉末生物吸附剂，获得烟籽油半成品；
54.(6)将烟籽油半成品放入分子蒸馏仪中，分子蒸馏仪的进料速度为50ml/h，转子转速为120r/min；在95℃、100pa条件下进行第一次分子蒸馏，冷凝后获到第一馏分为一级轻组分的烟籽油l1；将第一次蒸馏剩余物在105℃、10pa条件下继续进行第二次分子蒸馏，冷凝得到的第二馏分为二级轻组分的烟籽油l2；将第二次蒸馏剩余物在125℃、1pa条件下继续进行三级分子蒸馏，冷凝后获得第三馏分为三级轻组分的烟籽油l3；
55.(7)将烟籽油l1、烟籽油l2和烟籽油l3合并，即获得具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油。
56.1.2将具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油进行gc-ms检测，测定出烟籽油中的脂肪酸含量和挥发性成分含量。
57.1.2.1脂肪酸含量的测定方法：采用顶空固相微萃取法(hs-spme)萃取和富集保山4号烟籽油样品，萃取纤维头型号为50/30μm dvb/car/pdms。萃取纤维每次使用之前，均需在240℃的gc-ms进样口老化3min。准确称取3ml具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油加入到20ml的顶空瓶中立即密封，在40℃的条件下萃取20min。萃取完成后，取出固相微萃取纤维针，然后插入gc注射口进行解吸附(3min，240℃)及后续gc-ms分析。
58.具体的，gc检测条件为：进样口温度240℃；载气为99.999％高纯氦气，流速为1ml/min，不分流进样；色谱柱型号为hp-5的30m
×
0.32mm
×
0.25μm石英毛细管柱，程序升温条件：柱温箱初始温度40℃，然后以1℃/min的速度增加到80℃；再以20℃/min的速率增加到250℃，保持10min；
59.具体的，ms检测条件为：离子源为ei源，电子能量70ev，接口温度250℃，离子源温度230℃，质量扫描范围30-540m/z，溶剂延迟3min，全扫描模式。
60.具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油的主要脂肪酸成分如表1所示。
[0061][0062][0063]
表1
[0064]
1.2.2挥发性成分含量的测定：
[0065]
检测条件：以氮气为载气，流速为2ml/min，进样量为1μl，分流比为1:29.5，进样口温度和检测器温度分别为270℃和280℃；初始柱温100℃保持3min，以20℃/min升至170℃，保持10min，再以10℃/min升至200℃，保持5min，最后以2℃/min升至230℃，保持5min；其余与脂肪酸含量的测定方法一致。
[0066]
具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油的挥发性主要成分及占比如表2所示。
[0067][0068]
表2
[0069]
1.3保山4号烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量影响测定。
[0070]
1.3.1保山4号烟籽油细胞毒性测定，通过保山4号烟籽油细胞毒性测定结果获取烟籽油的具体浓度开展细胞抗炎实验。
[0071]
具体测定方法为：
[0072]
(1)细胞消化：将raw 264.7细胞在含10％胎牛血清(fbs)、1％双抗(青霉素(100u/ml)、链霉素(100mg/ml)的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中进行培养；培养条件：37℃、5％co2、95％空气条件细胞培养箱。
[0073]
(2)将对数生长期的raw 264.7细胞按(1)中的消化方法进行消化离心得到raw 264.7细胞，通过细胞计数仪计数并调整细胞密度至1.0
×
105个/ml，接板于96孔中贴壁生长，贴壁处理24h后，分别用烟籽油400、200、100、50、25μg/ml处理细胞20h。培养结束后移除培养基，加入200μl、0.50mg/ml mtt试剂继续培养。细胞处理4h后，吸走上清，重新加入200μl dmso，暗处充分震荡完全溶解结晶紫，使用酶标仪测定490nm吸光值，计算细胞存活率。
[0074]
细胞存活率(％)＝(od
样品组-od
空白组
)/(od
对照组-od
空白组
)
×
100％。
[0075]
不同浓度保山4号烟籽油对raw 264.7细胞存活率的测定结果如图1所示。
[0076]
由图1可知，不同浓度的保山4号烟籽油对raw 264.7细胞存活率影响均较小，其中浓度25～100μg/ml的保山4号烟籽油对raw 264.7细胞没有显著的细胞毒性。因此，选取25、50、100μg/ml作为保山4号烟籽油浓度开展细胞抗炎实验。
[0077]
1.3.2保山4号烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质含量、tnf-α炎性因子含量、il-1β炎性因子含量、il-6炎性因子含量的测定
[0078]
以地塞米松为阳性对照，测定地塞米松及保山4号烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量。
[0079]
培养raw264.7细胞，按1.3.1中的方法以1.0
×
105个/ml进行接板；待细胞完全贴壁生长后，移除培养基，分别加入25、50、100μg/ml浓度保山4号烟籽油和10μm地塞米松(dxm)处理raw264.7细胞4h(空白和模型孔更换培养基)，处理结束后移除上清；pbs清洗细胞后重新加入1μg/ml的lps继续培养20h，裂解细胞后收集裂解液；按试剂盒说明书测定细胞中一氧化氮(no)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素6(il-6)含量。
[0080]
25、50、100μg/ml浓度保山4号烟籽油及10μm地塞米松(dxm)对lps诱导raw 264.7细胞中一氧化氮(no)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素6(il-6)
含量的测定结果如图2所示，图2中，k：空白对照组；m：lps组；y：阳性组(地塞米松)
#
p《0.05vs k组，*p《0.05、**p《0.01vs m组。
[0081]
由图2的试验结果可知：lps显著诱导raw264.7细胞中的炎症介质(no)以及炎性因子(tnf-α、il-1β、il-6)的产生(p《0.05)。保山4号烟籽油以剂量依赖的方式显著抑制raw264.7细胞中炎症介质(no)和炎性因子(tnf-α、il-1β、il-6)的产生(p《0.05、p《0.01)，其中100μg/ml的保山4号烟籽油具有最好的抑制效果，与阳性组(地塞米松)抑制效果相当，可以起到良好的细胞抗炎作用。
[0082]
1.4具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油的应用
[0083]
结合1.2中测定出的保山4号烟籽油脂肪酸含量和挥发性成分含量、1.3中的保山4号烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量影响测定，可知保山4号烟籽油具有较强的抗炎活性能力。保山4号烟籽油可添加于凡士林中作为抗炎膏霜、或添加于蜂蜡中作为唇炎唇膏、或直接作为抗炎精油，使其具有较佳的抗炎活性能力。
[0084]
实施例2
[0085]
本实施例以野生烟中的rustica品种为例。
[0086]
2.1一种具有抗炎活性成分烟籽油的制备方法，包括如下步骤：
[0087]
(1)原料选取：采集成熟的rustica烟草蒴果，晾晒至rustica烟草蒴果干燥；将烟草蒴果进行脱粒后风选获得饱满的rustica烟草籽，将所述饱满烟草籽洗净后干燥至含水率降至9％，备用；
[0088]
(2)将干燥后的饱满rustica烟草籽破碎至粒度为65目后，在70℃以下进行冷压榨，获得冷压榨后的烟籽初油；
[0089]
(3)将冷压榨后的烟籽初油以7500r/min离心分离后弃固相物质，获得烟籽初油；
[0090]
(4)将烟籽初油中加入酵母粉末生物吸附剂，酵母粉末与烟籽初油的质量比为1:20，置于恒温摇床中振荡吸附反应6h；
[0091]
(5)待步骤(4)反应结束后，用0.32μm微孔滤膜分离过滤除去酵母粉末生物吸附剂，获得烟籽油半成品；
[0092]
(6)将烟籽油半成品放入分子蒸馏仪中，分子蒸馏仪的进料速度为50ml/h，转子转速为120r/min；在90℃、100pa条件下进行第一次分子蒸馏，冷凝后获到第一馏分为一级轻组分的烟籽油l1；将第一次蒸馏剩余物在100℃、10pa条件下继续进行第二次分子蒸馏，冷凝得到的第二馏分为二级轻组分的烟籽油l2；将第二次蒸馏剩余物在120℃、1pa条件下继续进行三级分子蒸馏，冷凝后获得第三馏分为三级轻组分的烟籽油l3；
[0093]
(7)将烟籽油l1、烟籽油l2和烟籽油l3合并，即获得具有抗炎活性成分的rustica烟籽油。
[0094]
2.2将具有抗炎活性成分的rustica烟籽油进行gc-ms检测，测定出烟籽油中的脂肪酸含量和挥发性成分含量。
[0095]
脂肪酸含量的测定方法与挥发性成分含量的测定方法与实施例1中的一致。
[0096]
具有抗炎活性成分的rustica烟籽油的主要脂肪酸成分如表3所示。
[0097][0098]
表3
[0099]
具有抗炎活性成分的rustica烟籽油的挥发性主要成分及占比如表4所示。
[0100][0101]
表4
[0102]
2.3rustica烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量
[0103]
2.3.1rustica烟籽油细胞毒性测定，通过rustica烟籽油细胞毒性测定结果获取烟籽油的具体浓度开展细胞抗炎实验；具体测定方法与实施例1中的一致。
[0104]
不同浓度rustica烟籽油对raw 264.7细胞存活率的测定结果如图3所示。
[0105]
由图3可知，25～100μg/ml的rustica烟籽油对raw 264.7细胞没有显著的细胞毒性。因此，选取25、50、100μg/ml作为rustica烟籽油浓度开展细胞抗炎实验。
[0106]
2.3.2rustica烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质含量、tnf-α炎性因子含量、il-1β炎性因子含量、il-6炎性因子含量的测定，具体测定方法与实施例1中的一致。
[0107]
以地塞米松为阳性对照，测定地塞米松及rustica烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量，检测结果如图4所示。图4中，k：空白对照组；m：lps组；y：阳性组(地塞米松)，小写字母表示各处理间差异显著性(p《0.05)。
[0108]
由图4可知，lps显著诱导raw264.7细胞中的炎症介质(no)以及炎性因子(tnf-α、il-1β、il-6)的产生，rustica烟籽油以剂量依赖的方式显著抑制raw264.7细胞中炎症介质(no)和炎性因子(tnf-α、il-1β、il-6)的产生。与阳性组(地塞米松)抑制效果相比，一定浓度下，rustica烟籽油可以起到良好的细胞抗炎作用。
[0109]
2.4具有抗炎活性成分的rustica烟籽油的应用
[0110]
结合2.2中测定出的rustica烟籽油脂肪酸含量和挥发性成分含量、2.3中的rustica烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量影响测定，可知rustica烟籽油具有较强的抗炎活性能力。rustica烟籽油可添加于凡士林中作为抗炎膏霜、或添加于蜂蜡中作为唇炎唇膏、或直接作为抗炎精油，使其具有较佳的抗炎活性能力。
[0111]
实施例3
[0112]
本实施例以烤烟中的nc89品种为例。
[0113]
3.1一种具有抗炎活性成分烟籽油的制备方法，包括如下步骤：
[0114]
(1)原料选取：采集成熟的nc89烟草蒴果，晾晒至nc89烟草蒴果干燥；将烟草蒴果
进行脱粒后风选获得饱满的nc89烟草籽，将所述饱满烟草籽洗净后干燥至含水率降至9％，备用；
[0115]
(2)将干燥后的饱满nc89烟草籽破碎至粒度为70目后，在70℃以下进行冷压榨，获得冷压榨后的烟籽初油；
[0116]
(3)将冷压榨后的烟籽初油以7500r/min离心分离后弃固相物质，获得烟籽初油；
[0117]
(4)将烟籽初油中加入酵母粉末生物吸附剂，酵母粉末与烟籽初油的质量比为1:20，置于恒温摇床中振荡吸附反应8h；
[0118]
(5)待步骤(4)反应结束后，用0.32μm微孔滤膜分离过滤除去酵母粉末生物吸附剂，获得烟籽油半成品；
[0119]
(6)将烟籽油半成品放入分子蒸馏仪中，分子蒸馏仪的进料速度为50ml/h，转子转速为120r/min；在100℃、100pa条件下进行第一次分子蒸馏，冷凝后获到第一馏分为一级轻组分的烟籽油l1；将第一次蒸馏剩余物在110℃、10pa条件下继续进行第二次分子蒸馏，冷凝得到的第二馏分为二级轻组分的烟籽油l2；将第二次蒸馏剩余物在130℃、1pa条件下继续进行三级分子蒸馏，冷凝后获得第三馏分为三级轻组分的烟籽油l3；
[0120]
(7)将烟籽油l1、烟籽油l2和烟籽油l3合并，即获得具有抗炎活性成分的nc89烟籽油。
[0121]
3.2将具有抗炎活性成分的nc89烟籽油进行gc-ms检测，测定出烟籽油中的脂肪酸含量和挥发性成分含量。
[0122]
脂肪酸含量的测定方法与挥发性成分含量的测定方法与实施例1中的一致。
[0123]
具有抗炎活性成分的nc89烟籽油的主要脂肪酸成分如表5所示。
[0124]
[0125][0126]
表5
[0127]
具有抗炎活性成分的nc89烟籽油的挥发性主要成分及占比如表6所示。
[0128][0129]
表6
[0130]
3.3 nc89烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β
炎性因子、il-6炎性因子的含量
[0131]
3.3.1 nc89烟籽油细胞毒性测定，通过nc89烟籽油细胞毒性测定结果获取烟籽油的具体浓度开展细胞抗炎实验；具体测定方法与实施例1中的一致。
[0132]
不同浓度nc89烟籽油对raw 264.7细胞存活率的测定结果如图5所示。
[0133]
由图5可知，25～100μg/ml的nc89烟籽油对raw 264.7细胞没有显著的细胞毒性。因此，选取25、50、100μg/ml作为nc89烟籽油浓度开展细胞抗炎实验。
[0134]
3.3.2nc89烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质含量、tnf-α炎性因子含量、il-1β炎性因子含量、il-6炎性因子含量的测定，具体测定方法与实施例1中的一致。
[0135]
以地塞米松为阳性对照，测定地塞米松及nc89烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量，测定结果如图6所示，图中，k：空白对照组；m：lps组；y：阳性组(地塞米松)
#
p《0.05vs k组，*p《0.05、**p《0.01vs m组。
[0136]
由图6可知，lps显著诱导raw264.7细胞中的炎症介质(no)以及炎性因子(tnf-α、il-1β、il-6)的产生，nc89烟籽油以剂量依赖的方式显著抑制raw264.7细胞中炎症介质(no)和炎性因子(tnf-α、il-1β、il-6)的产生。与阳性组(地塞米松)抑制效果相比，一定浓度下，nc89烟籽油可以起到良好的细胞抗炎作用。
[0137]
3.4具有抗炎活性成分的nc89烟籽油的应用
[0138]
结合3.2中测定出的nc89烟籽油脂肪酸含量和挥发性成分含量、3.3中的nc89烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量影响测定，可知nc89烟籽油具有较强的抗炎活性能力。nc89烟籽油可添加于凡士林中作为抗炎膏霜、或添加于蜂蜡中作为唇炎唇膏、或直接作为抗炎精油，使其具有较佳的抗炎活性能力。
[0139]
实施例4
[0140]
本实施例以香料烟中的保山4号品种为例。
[0141]
4.1一种具有抗炎活性成分烟籽油的制备方法，包括如下步骤：
[0142]
(1)原料选取：采集成熟的保山4号烟草蒴果，晾晒至保山4号烟草蒴果干燥；将烟草蒴果进行脱粒后风选获得饱满的保山4号烟草籽，将所述饱满烟草籽洗净后干燥至含水率降至8％，备用；
[0143]
(2)将干燥后的饱满保山4号烟草籽破碎至粒度为65目后，在70℃以下进行冷压榨，获得冷压榨后的烟籽初油；
[0144]
(3)将冷压榨后的烟籽初油以7000r/min离心分离后弃固相物质，获得烟籽初油；
[0145]
(4)将烟籽初油中加入酵母粉末生物吸附剂，酵母粉末与烟籽初油的质量比为1:20，置于恒温摇床中振荡吸附反应7h；
[0146]
(5)待步骤(4)反应结束后，用0.32μm微孔滤膜分离过滤除去酵母粉末生物吸附剂，获得烟籽油半成品；
[0147]
(6)将烟籽油半成品放入分子蒸馏仪中，分子蒸馏仪的进料速度为50ml/h，转子转速为120r/min；在90℃、100pa条件下进行第一次分子蒸馏，冷凝后获到第一馏分为一级轻组分的烟籽油l1；将第一次蒸馏剩余物在100℃、10pa条件下继续进行第二次分子蒸馏，冷凝得到的第二馏分为二级轻组分的烟籽油l2；将第二次蒸馏剩余物在120℃、1pa条件下继
续进行三级分子蒸馏，冷凝后获得第三馏分为三级轻组分的烟籽油l3；
[0148]
(7)将烟籽油l1、烟籽油l2和烟籽油l3合并，即获得具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油。
[0149]
4.2将具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油进行gc-ms检测，测定出烟籽油中的脂肪酸含量和挥发性成分含量。
[0150]
4.2.1脂肪酸含量的测定方法：采用顶空固相微萃取法(hs-spme)萃取和富集保山4号烟籽油样品，萃取纤维头型号为50/30μm dvb/car/pdms。萃取纤维每次使用之前，均需在240℃的gc-ms进样口老化3min。准确称取3ml具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油加入到20ml的顶空瓶中立即密封，在40℃的条件下萃取20min。萃取完成后，取出固相微萃取纤维针，然后插入gc注射口进行解吸附(3min，240℃)及后续gc-ms分析。
[0151]
具体的，gc检测条件为：进样口温度240℃；载气为99.999％高纯氦气，流速为1ml/min，不分流进样；色谱柱型号为hp-5的30m
×
0.32mm
×
0.25μm石英毛细管柱，程序升温条件：柱温箱初始温度40℃，然后以1℃/min的速度增加到80℃；再以20℃/min的速率增加到250℃，保持10min；
[0152]
具体的，ms检测条件为：离子源为ei源，电子能量70ev，接口温度250℃，离子源温度230℃，质量扫描范围30-540m/z，溶剂延迟3min，全扫描模式。
[0153]
具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油的主要脂肪酸成分如表1所示。
[0154]
[0155][0156]
表7
[0157]
4.2.2挥发性成分含量的测定：
[0158]
检测条件：以氮气为载气，流速为2ml/min，进样量为1μl，分流比为1:29.5，进样口温度和检测器温度分别为270℃和280℃；初始柱温100℃保持3min，以20℃/min升至170℃，保持10min，再以10℃/min升至200℃，保持5min，最后以2℃/min升至230℃，保持5min；其余与脂肪酸含量的测定方法一致。
[0159]
具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油的挥发性主要成分及占比如表2所示。
[0160][0161]
表8
[0162]
4.3保山4号烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量影响测定。
[0163]
4.3.1保山4号烟籽油细胞毒性测定，通过保山4号烟籽油细胞毒性测定结果获取烟籽油的具体浓度开展细胞抗炎实验。
[0164]
具体测定方法为：
[0165]
(1)细胞消化：将raw 264.7细胞在含10％胎牛血清(fbs)、1％双抗(青霉素(100u/ml)、链霉素(100mg/ml)的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中进行培养；培养条件：37℃、5％co2、95％空气条件细胞培养箱。
[0166]
(2)将对数生长期的raw 264.7细胞按(1)中的消化方法进行消化离心得到raw 264.7细胞，通过细胞计数仪计数并调整细胞密度至1.0
×
105个/ml，接板于96孔中贴壁生长，贴壁处理24h后，分别用烟籽油400、200、100、50、25μg/ml处理细胞20h。培养结束后移除培养基，加入200μl、0.50mg/ml mtt试剂继续培养。细胞处理4h后，吸走上清，重新加入200μl dmso，暗处充分震荡完全溶解结晶紫，使用酶标仪测定490nm吸光值，计算细胞存活率。
[0167]
细胞存活率(％)＝(od
样品组-od
空白组
)/(od
对照组-od
空白组
)
×
100％。
[0168]
不同浓度保山4号烟籽油对raw 264.7细胞存活率的测定结果如图1所示。
[0169]
由图1可知，不同浓度的保山4号烟籽油对raw 264.7细胞存活率影响均较小，其中浓度25～100μg/ml的保山4号烟籽油对raw 264.7细胞没有显著的细胞毒性。因此，选取25、50、100μg/ml作为保山4号烟籽油浓度开展细胞抗炎实验。
[0170]
4.3.2保山4号烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质含量、tnf-α炎性因子含量、il-1β炎性因子含量、il-6炎性因子含量的测定
[0171]
以地塞米松为阳性对照，测定地塞米松及保山4号烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量。
[0172]
培养raw264.7细胞，按1.3.1中的方法以1.0
×
105个/ml进行接板；待细胞完全贴壁生长后，移除培养基，分别加入25、50、100μg/ml浓度保山4号烟籽油和10μm地塞米松(dxm)处理raw264.7细胞4h(空白和模型孔更换培养基)，处理结束后移除上清；pbs清洗细胞后重新加入1μg/ml的lps继续培养20h，裂解细胞后收集裂解液；按试剂盒说明书测定细胞中一氧化氮(no)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素6(il-6)含量。
[0173]
保山4号烟籽油以剂量依赖的方式显著抑制raw264.7细胞中炎症介质(no)和炎性因子(tnf-α、il-1β、il-6)的产生(p《0.05、p《0.01)，其中100μg/ml的保山4号烟籽油具有最好的抑制效果，与阳性组(地塞米松)抑制效果相当，可以起到良好的细胞抗炎作用。
[0174]
4.4具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油的应用
[0175]
结合4.2中测定出的保山4号烟籽油脂肪酸含量和挥发性成分含量、4.3中的保山4号烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量影响测定，可知保山4号烟籽油具有较强的抗炎活性能力。保山4号烟籽油可添加于凡士林中作为抗炎膏霜、或添加于蜂蜡中作为唇炎唇膏、或直接作为抗炎精油，使其具有较佳的抗炎活性能力。
[0176]
实施例5
[0177]
本实施例以香料烟中的保山4号品种为例。
[0178]
5.1一种具有抗炎活性成分烟籽油的制备方法，包括如下步骤：
[0179]
(1)原料选取：采集成熟的保山4号烟草蒴果，晾晒至保山4号烟草蒴果干燥；将烟草蒴果进行脱粒后风选获得饱满的保山4号烟草籽，将所述饱满烟草籽洗净后干燥至含水率降至10％，备用；
[0180]
(2)将干燥后的饱满保山4号烟草籽破碎至粒度为70目后，在70℃以下进行冷压榨，获得冷压榨后的烟籽初油；
[0181]
(3)将冷压榨后的烟籽初油以8000r/min离心分离后弃固相物质，获得烟籽初油；
[0182]
(4)将烟籽初油中加入酵母粉末生物吸附剂，酵母粉末与烟籽初油的质量比为1:20，置于恒温摇床中振荡吸附反应7h；
[0183]
(5)待步骤(4)反应结束后，用0.32μm微孔滤膜分离过滤除去酵母粉末生物吸附剂，获得烟籽油半成品；
[0184]
(6)将烟籽油半成品放入分子蒸馏仪中，分子蒸馏仪的进料速度为50ml/h，转子转速为120r/min；在100℃、100pa条件下进行第一次分子蒸馏，冷凝后获到第一馏分为一级轻组分的烟籽油l1；将第一次蒸馏剩余物在110℃、10pa条件下继续进行第二次分子蒸馏，冷凝得到的第二馏分为二级轻组分的烟籽油l2；将第二次蒸馏剩余物在130℃、1pa条件下继续进行三级分子蒸馏，冷凝后获得第三馏分为三级轻组分的烟籽油l3；
[0185]
(7)将烟籽油l1、烟籽油l2和烟籽油l3合并，即获得具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油。
[0186]
5.2将具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油进行gc-ms检测，测定出烟籽油中的脂肪酸含量和挥发性成分含量。
[0187]
5.2.1脂肪酸含量的测定方法：采用顶空固相微萃取法(hs-spme)萃取和富集保山4号烟籽油样品，萃取纤维头型号为50/30μm dvb/car/pdms。萃取纤维每次使用之前，均需在240℃的gc-ms进样口老化3min。准确称取3ml具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油加入到20ml的顶空瓶中立即密封，在40℃的条件下萃取20min。萃取完成后，取出固相微萃取纤维针，然后插入gc注射口进行解吸附(3min，240℃)及后续gc-ms分析。
[0188]
具体的，gc检测条件为：进样口温度240℃；载气为99.999％高纯氦气，流速为1ml/min，不分流进样；色谱柱型号为hp-5的30m
×
0.32mm
×
0.25μm石英毛细管柱，程序升温条件：柱温箱初始温度40℃，然后以1℃/min的速度增加到80℃；再以20℃/min的速率增加到250℃，保持10min；
[0189]
具体的，ms检测条件为：离子源为ei源，电子能量70ev，接口温度250℃，离子源温度230℃，质量扫描范围30-540m/z，溶剂延迟3min，全扫描模式。
[0190]
具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油的主要脂肪酸成分如表1所示。
[0191][0192][0193]
表9
[0194]
5.2.2挥发性成分含量的测定：
[0195]
检测条件：以氮气为载气，流速为2ml/min，进样量为1μl，分流比为1:29.5，进样口温度和检测器温度分别为270℃和280℃；初始柱温100℃保持3min，以20℃/min升至170℃，保持10min，再以10℃/min升至200℃，保持5min，最后以2℃/min升至230℃，保持5min；其余与脂肪酸含量的测定方法一致。
[0196]
具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油的挥发性主要成分及占比如表2所示。
[0197][0198]
表10
[0199]
5.3保山4号烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量影响测定。
[0200]
5.3.1保山4号烟籽油细胞毒性测定，通过保山4号烟籽油细胞毒性测定结果获取烟籽油的具体浓度开展细胞抗炎实验。
[0201]
具体测定方法为：
[0202]
(1)细胞消化：将raw 264.7细胞在含10％胎牛血清(fbs)、1％双抗(青霉素(100u/ml)、链霉素(100mg/ml)的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中进行培养；培养条件：37℃、5％co2、95％空气条件细胞培养箱。
[0203]
(2)将对数生长期的raw 264.7细胞按(1)中的消化方法进行消化离心得到raw 264.7细胞，通过细胞计数仪计数并调整细胞密度至1.0
×
105个/ml，接板于96孔中贴壁生长，贴壁处理24h后，分别用烟籽油400、200、100、50、25μg/ml处理细胞20h。培养结束后移除培养基，加入200μl、0.50mg/ml mtt试剂继续培养。细胞处理4h后，吸走上清，重新加入200μl dmso，暗处充分震荡完全溶解结晶紫，使用酶标仪测定490nm吸光值，计算细胞存活率。
[0204]
细胞存活率(％)＝(od
样品组-od
空白组
)/(od
对照组-od
空白组
)
×
100％。
[0205]
5.3.2保山4号烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质含量、tnf-α炎性因子含量、il-1β炎性因子含量、il-6炎性因子含量的测定
[0206]
以地塞米松为阳性对照，测定地塞米松及保山4号烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎性因子的含量。
[0207]
培养raw264.7细胞，按1.3.1中的方法以1.0
×
105个/ml进行接板；待细胞完全贴壁生长后，移除培养基，分别加入25、50、100μg/ml浓度保山4号烟籽油和10μm地塞米松(dxm)处理raw264.7细胞4h(空白和模型孔更换培养基)，处理结束后移除上清；pbs清洗细胞后重新加入1μg/ml的lps继续培养20h，裂解细胞后收集裂解液；按试剂盒说明书测定细胞中一氧化氮(no)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素6(il-6)含量。
[0208]
保山4号烟籽油以剂量依赖的方式显著抑制raw264.7细胞中炎症介质(no)和炎性因子(tnf-α、il-1β、il-6)的产生(p《0.05、p《0.01)，其中100μg/ml的保山4号烟籽油具有最好的抑制效果，与阳性组(地塞米松)抑制效果相当，可以起到良好的细胞抗炎作用。
[0209]
5.4具有抗炎活性成分的保山4号烟籽油的应用
[0210]
结合5.2中测定出的保山4号烟籽油脂肪酸含量和挥发性成分含量、5.3中的保山4号烟籽油对lps诱导raw 264.7细胞中no炎症介质、tnf-α炎性因子、il-1β炎性因子、il-6炎
性因子的含量影响测定，可知保山4号烟籽油具有较强的抗炎活性能力。保山4号烟籽油可添加于凡士林中作为抗炎膏霜、或添加于蜂蜡中作为唇炎唇膏、或直接作为抗炎精油，使其具有较佳的抗炎活性能力。
[0211]
所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。