一种检测黄芩成分的方法与流程

1.本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种检测黄芩成分的方法。


背景技术：

2.传统中药中的黄芩为唇形科植物黄芩scutellaria baicalensis georgi.的干燥根，味苦、性寒，有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，临床上用于治疗上呼吸道炎、急性支气管炎、肺炎所引起的咳嗽等。
3.黄酮类化合物为黄芩中的主要化学成分和有效成分，主要以苷或苷元形式存在，其中以黄芩苷含量最高，2020年版中国药典(一部)收载的黄芩含量测定项下是以黄芩苷为指标进行质量控制，因此黄芩药材或与黄芩相关的制剂均是以黄芩苷为指标进行质量控制。但鉴于中药材及其制剂所含成分复杂,而药效发挥为各化学成分的综合作用,因此仅用某单一成分作为指标衡量其质量是不完善的,不利于黄芩药材及其制剂的质量控制以及黄芩使用的安全性和稳定性。
4.研究表明，黄芩中的黄酮类苷元成分，如黄芩素、汉黄芩素、千层纸素a等具有非常强的抗菌、消炎、解热、镇痛等生物活性，远较其苷类的生物活性强，在人体内的吸收是苷类的数倍至数十倍，且毒副作用更低。因此，对其进行定性定量检测是评价黄芩药材质量较理想的方法。
5.目前关于黄芩多成分的含量测定方法已有文献报道，例如，阚红玉等采用梯度洗脱(流动相为含0.1％甲酸的乙腈-水溶液)的高相液相色谱方法分离并检测了黄芩饮片中的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a的含量，5种成分与其他组分均能达到基线分离，保留时间分别为10.03、16.27、20.93、26.54、27.82min(hplc法同时测定黄芩中5种黄酮类成分的含量《中国药房》2010.21(11))。李云静等采用hplc法，c18色谱柱，流动相为乙腈-0.5％甲酸水溶液，梯度洗脱，对黄芩药材中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素a进行测定，五种成分都能达到基线分离，最后出峰的千层纸素a的保留时间为34min(不同产地黄芩药材中黄芩苷等5黄酮类成分含量的比较《时珍国医国药》2016.27(12))。田甜等对黄芩药材进行超声提取后，采用hplc法，c18色谱柱，流动相为甲醇-0.22％磷酸溶液，梯度洗脱，测定黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素a四种成分的含量，均能得到良好分离，但是最后出峰的千层纸素a的保留时间为65min，分离时间较长(不同产地和不同年限黄芩hplc指纹图谱研究《浙江农业科学》，2018，59(3))。
6.目前关于同时测定黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a的报道，大都采用的是梯度洗脱，分析时间较长，或流动相配制复杂，需要调节ph，操作繁琐且无法高效快速地完成检测。


技术实现要素：

7.针对上述问题，本发明的发明人在实验中发现，采用高效液相色谱法检测黄芩成分的过程中，能够在保持流动相洗脱比例固定不变的条件下，实现黄芩苷、黄芩素、汉黄芩
素和千层纸素a的有效分离、鉴定和含量测定，从而进行相关组合物或制剂的质量控制。
8.有鉴于此，本发明提供了一种可同时检测黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a的方法，可用于对黄芩药材、饮片、提取物及其制剂中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a的检测。
9.本发明主要通过以下技术方案来实现：
10.本发明提供的同时检测黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a的方法，包括下述步骤：
11.1)制备待测黄芩样品溶液和对照品溶液；
12.所述对照品溶液为含黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品、千层纸素a对照品的混合对照品溶液；
13.2)采用高效液相色谱法进行检测；
14.所述高效液相色谱法采用的色谱条件为：
15.流动相：甲醇与质量分数0.1％-0.4％的磷酸水溶液的混合溶液，其中，甲醇的体积百分含量为65-70％，即甲醇与磷酸水溶液的体积比为65:35-70:30；
16.洗脱方式：等度洗脱。
17.在本发明的一些实施方式中，所述流动相中有机溶剂的体积百分含量为65-70％，即甲醇与磷酸的比例为65:35-70:30时，四种成分能实现良好分离。优选地，所述流动相中甲醇的体积百分含量为65％，即流动相中甲醇与磷酸的比例为65:35时，四成分能在20分钟内良好分离且分离度大于1.5。
18.在本发明的一些实施方式中，所述磷酸水溶液中磷酸的质量百分含量为0.1％-0.4％，优选为0.1％-0.2％。发明人发现磷酸水溶液的质量百分含量为0.1％-0.4％的范围内时，与上述有机溶剂混合作为流动相，不仅能保证色谱柱的使用性能不受影响，还能在等度洗脱的条件下实现四种成分的良好分离，分离度均能达到1.5以上且四种成分实现完全分离的时间不超过20min。
19.在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱法采用的检测波长为272-278nm。所述高效液相色谱法使用的固定相选自硅胶，氧化铝，十八烷基硅烷键合硅胶、八烷基硅烷键合硅胶和酰胺基键合硅胶中的一种或其组合，优选为十八烷基硅烷键合硅胶。具体可采用diamonsil c18(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱。
20.在本发明的一些实施方式中，所述高效液相色谱法采用的色谱柱的柱温控制在20-35℃时，四种成分均能得到良好分离；柱温为25℃时，分离效果最好，分离度达到1.5以上。温度过低会影响分离效果，温度过高时会影响色谱柱性能从而影响分离效果。
21.在本发明的一些实施方式中，在洗脱过程中流动相的流速为0.75-1.5ml/min，优选为1.0ml/min。洗脱过程中流动相流速过快会导致各成分色谱峰分离不开，柱压不稳定且影响色谱柱寿命；流速过慢会使分离时间延长，降低检测方法效率。
22.在本发明的一些实施方式中，所述黄芩可为黄芩药材、黄芩饮片、黄芩提取物、含有黄芩的组合物或黄芩制剂。
23.在本发明的一些实施方式中，以黄芩饮片为例，待测黄芩样品溶液的制备方法如下：精密称取黄芩饮片粉末(过20目筛)0.2g，于具塞锥形瓶中，加入体积分数70％的甲醇水溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷至室温，用体积分数70％的甲醇水溶液补足重
量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。
24.对照品溶液的制备：精密称取各对照品适量，加甲醇制成每1ml含黄芩苷对照品1.58975mg、黄芩素对照品54.39μg、汉黄芩素对照品21.04μg、千层纸素a对照品11.83μg的混合对照品溶液。
25.本发明的再一个目的是提供一种同时检测黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a含量的方法，是采用高效液相色谱进行测定，包括下述步骤：
26.1)标准曲线的制备
27.取一系列浓度的含黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a的混合标准品溶液，按照上述的高效液相色谱法进行检测，并分别记录黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a在每个浓度下对应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以对应的对照品的质量为横坐标，进行线性回归，分别得到黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a的回归方程；
28.2)待测黄芩样品中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a的含量测定
29.将待测黄芩样品按照上述的样品制备方法制备待测黄芩样品溶液，然后按照上述的高效液相色谱法进行检测，并分别记录黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a对应的峰面积；将每种药物的峰面积值分别代入该药物对应的回归方程中，计算得到所述黄芩样品中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a的含量。
30.一方面，本发明的检测方法能够实现对黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a四种成分的同时检测，采用本发明的检测方法可使所述黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素和千层纸素a的色谱峰均达到基线分离且分离度大于1.5。另一方面，本发明以有机溶剂-磷酸水溶液为流动相，固定洗脱比例，色谱峰峰形好，分离度高，准确度高，成本低，检测时间缩短，提高了分析效率，减少了流动相的消耗。该方法操作简单、方便，耐用性、精密度、重复性和稳定性良好，便于样品中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a四种成分的同时检测。
附图说明
31.图1是实施例1中混合对照品溶液的高效液相色谱图(275nm，1为黄芩苷，2为黄芩素，3为汉黄芩素，4为千层纸素a)；
32.图2是实施例1中供试品溶液的高效液相色谱图(275nm，1为黄芩苷，2为黄芩素，3为汉黄芩素，4为千层纸素a)；
33.图3是本发明检测方法检测黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素a的标准曲线，其中(a)为黄芩苷，(b)为黄芩素，(c)为汉黄芩素，(d)为千层纸素a。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
35.通过这些示例性说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
36.这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
37.此外，下面所描述的本发明不同实施方式中涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
38.实施例1、供试品和对照品溶液制备与检测
39.(1)供试品溶液的制备：精密称取黄芩饮片粉末(过20目筛)0.2g，于具塞锥形瓶中，加入体积分数70％的甲醇水溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷至室温，用体积分数70％的甲醇水溶液补足重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。
40.(2)对照品溶液的制备：精密称取各对照品适量，加甲醇制成每1ml含黄芩苷对照品1.58975mg、黄芩素对照品54.39μg、汉黄芩素对照品21.04μg、千层纸素a对照品11.83μg的混合对照品溶液。
41.(3)高效液相色谱检测：采用diamonsil c18(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱，流动相甲醇-0.2％磷酸水溶液(65:35，v/v)，等度洗脱25min，流速每分钟1.0ml，柱温为25℃，检测波长275nm，分别吸取对照品溶液和供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，得到黄芩有效成分的色谱图(图1-2)，各成分出峰时间约为：黄芩苷5.074min、黄芩素10.274min、汉黄芩素16.385min、千层纸素a19.000min。
42.千层纸素a出峰时间为19.000min，表明本发明的检测方法能在20min内完成对这四种成分的分离检测，与现有技术相比，大大缩短了检测时间。
43.表1对照品和供试品溶液中4种成分的保留时间
[0044][0045]
实施例2、流动相洗脱比例考察
[0046]
根据实施例1的方法制备得到供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱进行测定。
[0047]
色谱条件：采用diamonsil c18(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱，流动相甲醇-0.2％磷酸水溶液，等度洗脱25min，流速每分钟1.0ml，柱温为25℃，检测波长275nm，进样量10μl。
[0048]
控制流动相洗脱比例(甲醇：0.2％磷酸水溶液，v/v)分别为55:45、65:35、70:30、75:25，记录4种成分的分离度和保留时间，结果如表2-3。
[0049]
表2流动相洗脱比例对分离效果的影响
[0050][0051]
表3流动相洗脱比例考察中4种成分的保留时间
[0052][0053][0054]
结果表明，当流动相洗脱比例为55：45时，无法检测到千层纸素a，四个成分达不到完全基线分离；当流动相洗脱比例为75：25时，四个成分无法良好分离。当流动相洗脱比例为65:35时，四个成分的色谱峰在20min内得到良好分离，分离度大于1.5；当流动相洗脱比例为70：30时，四个成分的色谱峰在13min内得到良好分离，分离度能达到1.3以上。
[0055]
实施例3、柱温考察
[0056]
根据实施例1的方法制备得到供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱进行测定。
[0057]
色谱条件：采用diamonsil c18(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱，流动相甲醇-0.2％磷酸水溶液，甲醇与磷酸水溶液的体积配比为65:35，等度洗脱25min，流速每分钟1.0ml，检测波长为275nm，进样量10μl，控制色谱柱温分别为20、25、35℃，记录4种成分的分离度和保留时间，结果如表4-5。
[0058]
表4控制柱温分别为20、25、35℃时对4种成分分离效果的影响
[0059][0060]
表5柱温考察中4种成分的保留时间
[0061][0062]
结果表明，控制柱温在20-35℃时，四种成分均能得到良好分离；柱温为25℃时，分
离效果最好，分离度达到1.5以上。本发明的检测方法中色谱柱柱温控制在20-35℃比较适宜，25℃为最适宜温度，此时分离效果最好。
[0063]
实施例4、流动相中磷酸水溶液浓度考察
[0064]
根据实施例1的方法制备得到供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱进行测定。
[0065]
色谱条件：采用diamonsil c18(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱，流动相甲醇-磷酸水溶液，甲醇与磷酸水溶液的体积配比为65:35，等度洗脱25min，流速每分钟1.0ml，柱温为25℃，检测波长275nm，进样量10μl。
[0066]
调整磷酸水溶液中磷酸的浓度分别为0％、0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.4％，记录4种成分的分离效果和保留时间，结果如表6-7。
[0067]
表6流动相中磷酸浓度对4种成分分离效果的影响
[0068][0069]
表7流动相中磷酸浓度对4种成分的保留时间
[0070][0071][0072]
结果表明，流动相中磷酸浓度在0.05％以下时，无法检测到四种成分或者四种成分的色谱峰重叠无法分离；流动相中磷酸浓度在0.1％-0.4％时，四个成分的色谱峰能得到良好分离，分离度均达到1.5以上；流动相中磷酸浓度超过0.4％时，流动相ph过低，影响色谱柱使用性能。
[0073]
实施例5、流速考察
[0074]
根据实施例1的方法制备得到供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱进行测定。
[0075]
色谱条件：采用diamonsil c18(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱，流动相甲醇-0.2％磷酸水溶液，甲醇与磷酸水溶液的体积配比为65:35，等度洗脱25min，柱温为25℃，检测波长275nm，进样量10μl。
[0076]
控制流动相流速分别为每分钟0.75、1.0、1.5ml，记录4种成分的分离度和保留时间，结果如表8-9。
[0077]
表8流动相流速对4种成分分离效果的影响
[0078][0079]
表9流动相流速考察中4种成分的保留时间
[0080][0081]
实施例6、方法学验证
[0082]
为了对上述实验的可靠性和线性回归方程的精准性进行检测，设定下述精密度试验、稳定性试验、重复性试验和加样回收率试验，通过各试验的rsd值对试验方法的稳定性和可靠性进行检测，但是应声明，下述试验并不影响本发明测试方法及结果。
[0083]
(1)线性关系考察
[0084]
精密移取黄芩苷储备液2ml、黄芩素储备液1ml、汉黄芩素储备液1ml、千层纸素a储备液0.5ml置于5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得混合对照品溶液a。精密移取混合对照品溶液a3ml于5ml量瓶中，逐级稀释4次，甲醇定容，分别得到混合对照品溶液b-e。按实施例1步骤(3)中色谱条件分别进样，记录峰面积，以峰面积为纵坐标(y)，以对照品的量为横坐标(x，μg)，计算回归方程及线性范围。其线性特征及回归方程如下表5所示，标准曲线如图3所示。
[0085]
表10及图3表明，黄芩苷在2.60-15.897μg范围内线性关系良好，黄芩素在0.070-0.544μg范围内线性关系良好；汉黄芩素在0.027-0.210μg范围内线性关系良好；千层纸素a在0.015-0.118μg范围内线性关系良好。
[0086]
表10线性关系考察结果
[0087][0088][0089]
(2)精密度试验
[0090]
精密吸取混合对照品溶液10μl，按实施例1中步骤(3)的色谱条件分别连续进样6次。测得混合对照品溶液中四个成分的峰面积rsd分别为0.09％，0.17％，0.14和0.14％。结果表明该仪器的精密度良好，实验结果见表11。
[0091]
表11精密度试验数据结果
[0092][0093]
(3)稳定性试验
[0094]
取黄芩饮片粉末，按照实施例1中步骤(1)方法制备供试品溶液，按实施例1中步骤(3)色谱条件分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，测得黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素a的色谱峰峰面积rsd值分别为0.22％、0.31％、0.75％、0.42％(表12)，表明供试品溶液在24小时内稳定。
[0095]
表12稳定性试验数据结果
[0096][0097][0098]
(4)重复性试验
[0099]
取同一批次样品6份，依照供试品溶液的制备方法制备样品，按实施例1中步骤(3)色谱条件测得四个指标含量rsd值分别为1.81％、2.17％、2.60％、2.82％，表明该方法的重复性良好，实验结果见表13。
[0100]
表13重复性试验数据结果
[0101][0102][0103]
(5)加样回收率试验
[0104]
取已知含量的黄芩样品0.1g，共6份，分别加入黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素a对照品溶液适量，按照供试品溶液的制备方法，按实施例1中步骤(3)色谱方法检测黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素a色谱峰峰面积，计算回收率及rsd值，实验结果见表14。
[0105]
表14加样回收率试验数据结果
[0106][0107][0108]
上述精密度试验，稳定性试验、重复性试验和加样回收率试验的结果表明，本发明的检测方法具有很好地稳定性、重复性和准确性，能够实现黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素a四种成分快速有效的分离检测。
[0109]
以上结合了优选的实施方式对本发明进行了说明，不过这些实施方式仅是范例性的，仅起到说明性的作用。在此基础上，可以对本发明进行多种替换和改进，这些均落入本发明的保护范围内。