恩贝酸在联合奥沙利铂治疗微卫星不稳定的大肠癌中的应用

1.本发明涉及恩贝酸在联合奥沙利铂治疗微卫星不稳定的大肠癌中的应用，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，也是引起癌症患者死亡的主要癌种之一。目前，手术切除后根据肿瘤分期进行辅助性化疗是最常用的治疗策略之一。对于不可手术切除的晚期结直肠癌患者，治疗方案包括化疗，靶向和免疫治疗。其中以奥沙利铂为主的化疗是一线治疗方案，与5-氟尿嘧啶(5-fu)和亚叶酸钙(lv)联合使用(folfox），治疗转移性结直肠癌的有效率》50%，中位生存期接近2年，在晚期结直肠癌患者治疗中占据主要地位。然而，很大一部分接受化疗的患者无可避免会发展为耐药的患者，极大的影响晚期结直肠癌治疗效果。
3.微卫星不稳定(msi)，是指由于基因复制错误引起基因组中重复序列次数的增加或丢失，导致微卫星片段长度发生了缩短或延长。根据结直肠癌中msi被检测出的频率，可以将结直肠癌分为3类：微卫星高度不稳定（msi-h）、微卫星低度不稳定性（msi-l）和微卫星稳定（mss）。msi-h出现在15%~20%的ii期和iii期crc患者中，与mss患者相比有更好的预后，但是在转移性结直肠患者中约5%存在msi-h且预后较差。因此，需要新颖的方法来增强化学疗法的抗肿瘤反应，以延长晚期大肠癌患者的生存时间。


技术实现要素：

4.本发明提供一种恩贝酸在联合奥沙利铂治疗微卫星不稳定的大肠癌中的应用，来增强化学疗法的抗肿瘤反应，以延长晚期大肠癌患者的生存时间。
5.本发明采取以下技术方案来实现：恩贝酸在联合奥沙利铂治疗微卫星不稳定的大肠癌中的应用。
6.作为优选实例，恩贝酸在制备治疗微卫星不稳定的大肠癌的药物中的应用。
7.作为优选实例，所述恩贝酸可以增加微卫星不稳定的大肠癌对化疗药物奥沙利铂的敏感性，在体外可以抑制大肠癌细胞的增殖，诱导大肠癌细胞的凋亡，在体内显著抑制大肠癌的生长。
8.作为优选实例，所述恩贝酸的给药浓度为15mg/kg，腹腔/尾静脉注射；所述奥沙利铂的给药浓度为5mg/kg，腹腔/尾静脉注射。
9.作为优选实例，所述恩贝酸是从日本矮地茶草药中分离出的天然产物，作为x连锁的凋亡蛋白抑制剂的抑制剂，能够诱导大肠癌细胞的凋亡，抑制大肠癌生长。
10.本发明的有益效果是：恩贝酸（embelin）是从矮地茶中分离的一种醌类化合物，属于天然产物类药物，目前已通过fda批准进入抗肿瘤治疗的临床前研究阶段；本发明的研究结果显示，恩贝酸能够显著增加微卫星不稳定的大肠癌对化疗药物奥沙利铂的敏感性，基于此本发明首次提出了一种基于恩贝酸和奥沙利铂药物治疗的微卫星不稳定的大肠癌联
合协同治疗新策略，这将有助于提高大肠癌化学药物治疗水平，增加恩贝酸在肿瘤治疗中的适应范围。
附图说明
11.图1为本发明的药物剂量－反应曲线；图2为本发明评估联合治疗的协同效果示意图；图3为恩贝酸对细胞凋亡的影响示意图；图4为恩贝酸对大肠癌细胞株rko-oxpt、sw1463体内生长的影响示意图。
具体实施方式
12.为了对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
13.通过实验发现恩贝酸在奥沙利铂治疗微卫星不稳定的大肠癌中的作用，实验的具体操作步骤如下：1. 细胞活力测定采用cck8法检测细胞活力，将细胞接种在96孔板中（103个细胞，每孔100μl），并根据分组进行处理。72小时后，向每个孔中加入10μl cck8试剂，37℃孵育2小时后用分光光度计测量450 nm处的吸光度。使用calcusyn软件程序通过chou和talalay11的等效线照相法评估联合治疗的协同效果。ci》 1表示拮抗作用，ci 《1表示协同作用。
14.2. 凋亡检测annexin v-fitc细胞凋亡检测试剂盒（bd pharmingen）被用于通过流式细胞仪检测细胞表面annexin v的表达和碘化丙啶（pi）的摄取。收集细胞，用冰冷的pbs洗涤两次，并悬浮在100μl结合缓冲液中。 用3
ꢀµ
l annexin v-fitc和5
ꢀµ
l碘化丙啶（pi）在室温下于黑暗中染色细胞15分钟。 使用facs calibur系统通过流式细胞术分析细胞凋亡。
15.3. 裸鼠皮下成瘤实验将呈稳定生长的结直肠癌细胞制备成无血清悬液，取 4-6 周龄雄性裸鼠小鼠，分别于小鼠右下腹注射肿瘤细胞。奥沙利铂和恩贝酸通过尾静脉/腹腔注射给药。恩贝酸的给药浓度为15mg/kg，奥沙利铂的给药浓度为5mg/kg。每隔2天用游标卡尺测量瘤体直径，连续观察2周。
16.下面通过具体的实施例详细说明本发明。
17.实施例1恩贝酸对大肠癌细胞株rko、hct116、ht29生长的影响。
18.（1）实验对象：微卫星不稳定（msi-h）的结直肠癌细胞株rko和hct116， 微卫星稳定（mss）的结直肠癌细胞株ht29。
19.（2）检测步骤：将细胞接种在96孔板中（103个细胞，每孔100μl），分别用奥沙利铂、恩贝酸、奥沙利铂 恩贝酸处理。恩贝酸和奥沙利铂的给药浓度为0、0.25、0.5、1、3、6、13、25、50、100μm。72小时后，向每个孔中加入10μl cck8试剂，37℃孵育2小时后用分光光度计测量450 nm处的吸光度。绘制药物剂量－反应曲线（图1），使用calcusyn软件程序通过chou和talalay11的等效线照相法评估联合治疗的协同效果（图2）。ci》 1表示拮抗作用，ci 《1
表示协同作用。
20.（3）检测结果：恩贝酸联合奥沙利铂治疗对rko和hct116具有明显的协同作用，恩贝酸联合奥沙利铂治疗对ht29无明显协同作用（图2）。
21.实施例2恩贝酸对大肠癌细胞株rko、hct116、ht29细胞凋亡的影响。
22.（1）实验对象：微卫星不稳定（msi-h）的结直肠癌细胞株rko和hct116， 微卫星稳定（mss）的结直肠癌细胞株ht29。
23.（2）检测步骤：将细胞接种在12孔板中（104个细胞，每孔500μl），分别用奥沙利铂、恩贝酸、奥沙利铂 恩贝酸处理。恩贝酸的给药浓度为20μm，奥沙利铂的给药浓度为10μm。24小时后，收集细胞，用冰冷的pbs洗涤两次，并悬浮在100μl结合缓冲液中。 用3
ꢀµ
l annexin v-fitc和5
ꢀµ
l碘化丙啶（pi）在室温下于黑暗中染色细胞15分钟。 使用facs calibur系统通过流式细胞术分析细胞凋亡。
24.（3）检测结果：与单药治疗相比，恩贝酸联合奥沙利铂治疗能够显著增加rko和hct116的细胞凋亡，恩贝酸联合奥沙利铂治疗不能显著增加ht29的细胞凋亡（图3）。
25.实施例3恩贝酸对大肠癌细胞株rko、sw1463体内生长的影响。
26.（1）实验对象：体外诱导的微卫星不稳定（msi-h）的结直肠癌细胞株rko的奥沙利铂耐药株，对奥沙利铂治疗具有一定抗性。微卫星稳定（mss）的结直肠癌细胞株sw1463。
27.（2）检测步骤：将细胞制备成无血清悬液，取 4-6 周龄雄性裸鼠小鼠，分别于小鼠右下腹注射肿瘤细胞。分为4组，即对照组、奥沙利铂组、恩贝酸组、奥沙利铂 恩贝酸组处理。恩贝酸的给药浓度为15mg/kg，奥沙利铂的给药浓度为5mg/kg。奥沙利铂和恩贝酸通过尾静脉/腹腔注射给药，分别在注射细胞后在第5，7，9，12天给药，并用游标卡尺测量瘤体直径，连续观察2周。
28.（3）检测结果：在微卫星稳定（mss）的结直肠癌细胞株sw1463中，与单药治疗相比，恩贝酸联合奥沙利铂治疗不能够显著抑制sw1463的生长。在微卫星不稳定（msi-h）的结直肠癌细胞株rko中，与单药治疗相比，恩贝酸联合奥沙利铂治疗能够显著抑制rko耐药株的生长（图4）。
29.综上所述，恩贝酸（embelin）是从日本矮地茶（ardisia）草药中分离出的天然产物，因其药理特性和无毒性质在癌症研究领域中受到关注。作为x连锁的凋亡蛋白抑制剂（xiap）的抑制剂，embelin与iap家族共享的bir3结构域结合，能够抑制naip、ciap1、ciap2、xiap的功能，从而诱导各种类型癌细胞的凋亡，达到抑制癌细胞生长，增殖和迁移的目的。
30.凋亡蛋白抑制剂 (iap) 家族包含一组进化上保守的凋亡抑制因子，抑制细胞凋亡是肿瘤细胞抵抗奥沙利铂等化疗药物的杀伤作用的重要机制之一。恩贝酸通过抑制iap的功能，恢复奥沙利铂诱导的肿瘤细胞的凋亡，达到增加肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性的效果。在微卫星不稳定的大肠癌中，存在过度激活的ciap2分子信号通路。恩贝酸通过抑制ciap2的抗凋亡功能，恢复奥沙利铂诱导的细胞凋亡，因此恩贝酸联合奥沙利铂在治疗微卫星不稳定的大肠癌中具有良好的效果以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发
明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。