BCAR3抑制剂及其在预防和治疗纤维化疾病中的用途

bcar3抑制剂及其在预防和治疗纤维化疾病中的用途
技术领域
1.本发明涉及具有预防或治疗各种纤维化疾病及病状的药物，属于疾病预防及治疗技术领域，具体地涉及一种bcar3抑制剂及其在预防和治疗纤维化疾病中的用途。


背景技术：

2.bcar3，英文全称breast cancer anti-estrogen resistance 3，又称and-34或nsp2，属nsp家族的一员，如makkinje a,et al.,2009,cell signal,21:1423-35中记载。虽然已有大量研究结果表明，bcar3作为几个生长因子受体下游的衔接蛋白促进细胞的增殖、迁移，参与多种疾病，如子宫内膜异位症(meng x,et al.,2019，mol cell endocrinol,494:110486.)及乳腺癌、卵巢癌、内膜癌等肿瘤(arras j,et al.,2021,am j cancer res,11:4768-4787)的发病，但尚不清楚bcar3在纤维化疾病的发病进程中发挥的作用。
3.纤维化定义为器官内成纤维细胞过度增殖，并伴有大量沉积细胞外基质聚集，破坏组织结构。在多种疾病，如病毒性肝炎、慢性肾炎、硬皮病等的病程晚期，器官均会发生纤维化，并最终导致器官衰竭。常见的纤维化疾病包括肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化和皮肤纤维化。大量研究表明，巨噬细胞在白介素4(il-4)、白介素13(il-13)等刺激下激活为替代活化型巨噬细胞(wang y,et al.,2021sci adv,7:eabb6075)。肺组织中m2的数目与ipf患者的临床症状负相关，m2可产生和分泌转化生长因子-β，tgf-β和血小板来源的生长因子pdgf，诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞分泌过量的纤维状ecm蛋白，包括i型胶原蛋白和纤连蛋白，导致病理基质沉积和纤维化的发生(liu p et al.,2020,respir res,21；58；wang q,et al.,2020,biomed pharmacother,131；110715)。减少m2数目和/或降低成纤维细胞的分化均能有效治疗多种诱因所致的肺纤维化模型(yao y et al.,2016，molecular therapy,24:915-925；hu y et al.,2022，nature communications,13:114)。尽管目前研究表明巨噬细胞极化和成纤维细胞分化在肺纤维化进程中发挥着重要的作用，但是目前仍缺少能有效阻断此行为，进而阻止或逆转肺纤维化进程的药物。
4.目前，纤维化疾病的治疗手段主要包括药物治疗及器官移植。器官移植作为纤维化疾病患者仅能选择的最终治疗手段，其应用推广受限于供体获取困难、手术风险高、手术费用昂贵。而现有药物无法逆转纤维化病程，其临床治疗效果和安全性均无法满足治疗需求。因此，亟需深入研究纤维化疾病发生机制，寻找新的治疗靶点，充分结合创新的医药发展趋势，开发新型的可有效治疗纤维化疾病且安全性高的药物。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明公开了一种bcar3抑制剂及其在预防和治疗纤维化疾病中的用途。通过探究bcar3抑制剂在纤维化疾病中可能发挥的机理，为纤维化疾病的预防和治疗提供了新选择。
6.为实现上述技术目的，本发明公开了一种用于预防和/或治疗个体纤维化疾病的抑制剂，所述抑制剂为影响bcar3基因的表达水平或/和功能的物质。
7.进一步地，所述抑制剂是以bcar3为靶标的sirna、shrna或mirna中的至少一种。
8.进一步地，所述基因bcar3的上下游引物序列为5'-gat gcc tat caa gac gtg tct a-3和5'-cct gaa gat gaa gtt ttc ccc t-3'。
9.进一步地，所述抑制剂用来抑制m2型巨噬细胞极化和成纤维细胞的分化，进而减缓纤维化进程。
10.本发明的目的之二是公开保护一种上述抑制剂在制备用于预防和/或治疗个体纤维化疾病药物中的应用。
11.进一步地，所述纤维化疾病包括肺纤维化、肾纤维化、心肌纤维化、肝纤维化或皮肤纤维化中的一种或两种及两种以上。
12.进一步地，所述纤维化疾病为肺纤维化。
13.进一步地，所述纤维化疾病为特发性肺纤维化。
14.进一步地，所述个体为哺乳动物。
15.有益效果：
16.本发明探究了bcar3抑制剂通过抑制m2型巨噬细胞极化和成纤维细胞的分化，进而减缓纤维化进程，为纤维化疾病提供了一种新的靶向bcar3的治疗策略，进一步为开发出新型的可有效治疗纤维化疾病且安全性高的药物奠定基础。
附图说明
17.图1为气道注射bcar3 sirna小鼠和气道注射scr sirna小鼠的肺组织的h&e、天狼星红、马松三色法染色结果图；
18.图2为气道注射bcar3 sirna小鼠和气道注射scr sirna小鼠的纤维化的阿什克罗夫特得分，其中，**p《0.01；
19.图3为经fitc诱导纤维化后，气道注射bcar3 sirna小鼠和气道注射scr sirna小鼠中纤连蛋白(fibronectin)、i型胶原(col1a1)、α-sma和bcar3的western blot结果，其中，**p《0.01；***p《0.001；
20.图4为经fitc诱导纤维化后，气道注射bcar3 sirna小鼠和气道注射scr sirna小鼠中纤连蛋白(fn1)、i型胶原(col1a1)、α-sma(acta2)和bcar3的定量rt-pcr结果，其中，*p《0.05；**p《0.01；
21.图5为经fitc诱导纤维化后，气道注射bcar3 sirna小鼠和野生型小鼠中羟脯氨酸的定量结果，其中，**p《0.01；
22.图6为小鼠原代骨髓巨噬细胞转染bcar3 sirna敲减bcar3后，stat6信号通路的活化情况，其中，**p《0.01；
23.图7为小鼠原代骨髓巨噬细胞转染bcar3 sirna敲减bcar3后，m2型巨噬细胞极化情况，其中，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
24.图8为小鼠肺成纤维细胞转染bcar3 sirna敲减bcar3后，成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的情况，其中，*p《0.05；**p《0.01。
具体实施方式
25.目前，纤维化疾病的治疗手段主要包括药物治疗及器官移植。器官移植作为纤维
化疾病患者仅能选择的最终治疗手段，其应用推广受限于供体获取困难、手术风险高、手术费用昂贵。而现有药物无法逆转纤维化病程，其临床治疗效果和安全性均无法满足治疗需求。因此，亟需深入研究纤维化疾病发生机制，寻找新的治疗靶点，充分结合创新的医药发展趋势，开发新型的可有效治疗纤维化疾病且安全性高的药物。
26.术语的定义和使用
27.纤维化疾病：在本发明中，纤维化疾病包括肺纤维化、肾纤维化、心肌纤维化、肝纤维化和皮肤纤维化。其中，肝纤维化是指由各种致病因子所致肝脏内结缔组织异常增生，肝脏内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。多种因素均可引起肝纤维化，如病毒感染、炎症反应、氧化应激和酗酒等。肝纤维化的病理特点为汇管区和肝小叶内有大量纤维组织增生和沉积，但尚未形成小叶内间隔，肝硬化则有假小叶形成，中心静脉区和汇管区出现间隔，肝的正常结构遭到破坏，肝纤维化进一步发展即为肝硬化。我国的慢性肝病以病毒性肝炎为主，慢性病毒性肝炎引起的肝组织纤维化与肝内炎症、坏死、病毒复制等有关，该病程在早期是可逆的。因此，将抗病毒、调节机体免疫功能等治疗方案有机结合，可在一定程度上控制肝纤维化进程。
28.肺纤维化主要病理特点包括肺组织间充质细胞增殖、细胞外基质增生沉积及肺实质的重构等。目前主要采用抗炎、抗氧化、抗成纤维细胞增殖和胶原沉积及肺移植等措施治疗肺纤维化。
29.肾纤维化表现为大量细胞外基质和结缔组织在肾脏聚集，导致肾脏结构改变和功能受损的病理过程。几乎所有肾疾病进展到终末期均会伴有肾纤维化的发生，并最终导致肾脏衰竭。肾纤维化过程涉及炎症反应，肾小管上皮细胞的凋亡以及多种可调控纤维化的细胞因子失衡等，故可通过抗炎症、抗凋亡和针对纤维化细胞因子治疗等途径防治肾纤维化。
30.心肌纤维化以成纤维细胞的增殖和细胞外基质在心肌正常组织结构中沉积为主要特征。目前认为主要由高血压性心脏病、缺血性心肌病、扩张性心肌病、病毒性心肌炎、糖尿病心肌病等所致。心肌纤维化引起心脏硬度增加，顺应性降低，影响心脏的正常舒张和收缩功能，是心血管疾病预后的关键性因素。
31.皮肤纤维化形成瘢痕组织。瘢痕组织是肉芽组织经改建成熟形成的老化阶段的纤维结缔组织。创伤等情况下，成纤维细胞分裂、增殖，向受损部位迁移，产生细胞外基质，形成瘢痕组织，修复创伤。
32.bcar3抑制剂：在本发明中，bcar3抑制剂是指：1)所述抑制剂为影响bcar3基因的表达水平或/功能的物质，其可以包括能够抑制bcar3表达的sirna、shrna和mirna，含有上述sirna、shrna和/或mirna的载体以及含有上述载体的宿主细胞，但本发明不限于此；
33.2)使bcar3活性降低或失活的物质；
34.3)促使bcar3降解的物质，诸如引起降解的bcar3抗体。
35.个体：在本发明中，术语“个体”指哺乳动物，包括但不限于大鼠、小鼠、非人灵长类、人、犬、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊。优选为人或小鼠。
36.预防和治疗：
37.本发明所述“预防”是指在可能的促纤维因素的存在下，使用后防止或降低纤维化的产生。本发明所述“治疗”是指降低纤维化的程度，或者治愈纤维化使之正常化，或者减缓
纤维化的进程。
38.本发明通过以下实施例证实了通过抑制成纤维细胞中bcar3表达，可显著降低m2型巨噬细胞的极化和减少成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。其中，m2型巨噬细胞的极化和成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化在包括肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化和皮肤纤维化等纤维化疾病的发病中发挥了极其重要的作用。
39.本发明还公开了一种包括bcar3抑制剂的药物组合物，它包括上述的bcar3抑制剂及药学上可接受的载体，该药物组合物可为注射型、胶囊、片剂、喷鼻剂或气雾剂等，以个体可接受的方式，如注射、口服、喷鼻等各种方式给与受试个体。
40.本发明还保护一种药盒，它包括上述的bcar3抑制剂和使用说明书。
41.为更好的解释本发明，以下结合具体实施例进行详细说明。
42.实施例1气道注射bcar3 sirna对肺部纤维化程度的影响；
43.实验动物及材料：
44.1.实验动物：
45.来源：繁育于同济医学院动物房的野生型小鼠(wt，c57bl/6)；
46.育龄：8～10周龄；
47.2.实验方法：
48.采用1％的戊巴比妥钠(70mg/kg)腹腔注射麻醉野生型小鼠，随后通过气道注射终浓度0.021mg/kg的fitc，其中，fitc购自sigma，且使用时溶于生理盐水中，使用气道注射相同体积scr sirna的的小鼠用作对照。施用fitc后第14天及17天，再次分别气道注射bcar3 sirna和scr sirna，21天后处死小鼠，分析各小鼠肺部纤维化程度。
49.由两位病理学家使用阿什克罗夫特评分系统以盲评的方式对每个连续区域的间质纤维化严重程度进行独立评估。
50.3.实验结果：
51.具体的，野生型小鼠的肺组织的h&e、天狼星红、马松三色法染色结果如图1所示，结合图1可知，经fitc诱导后，相较于气道注射scr sirna的小鼠，气道注射bcar3 sirna的小鼠中肺损伤和纤维化明显减轻。
52.阿什克罗夫特评分结果如图2所示，由图2可知，气道注射bcar3sirna的小鼠的阿什克罗夫得分较气道注射scr sirna的小鼠更低，说明其肺纤维化的程度大大减轻。
53.综上所述，气道注射bcar3 sirna，有利于预防或治疗小鼠的肺部纤维化。
54.实施例2气道注射bcar3 sirna对纤连蛋白、i型胶原、α-sma的蛋白、bcar3的蛋白及mrna水平的影响；
55.为进一步评价各小鼠经fitc注射后肺部的纤维化程度，本发明分别通过western blot及rt-pcr方式检测了各小鼠肺组织中纤连蛋白、i型胶原、α-sma的蛋白、bcar3的蛋白及mrna水平。
56.具体是收集实施例1实验后小鼠肺组织，通过ripa裂解液提取组织中的蛋白，并通过western blot检测目的蛋白，如纤连蛋白、i型胶原和α-sma、bcar3的蛋白表达量，结果如图3所示。其中，所述western blot的具体方法参考hu y et al.,2022，nature communications,13:114。
57.同时，使用sybr premix ex taq(takara)进行荧光定量rt-pcr，并以β-肌动蛋白
作为内参，标准化每个目的基因的相对表达，结果如图4所示。而每个目的基因所对应的引物列于下表1中。其中，具体测试测试表达方法如chen et al.,2015,international journal of clinical and experimental pathology 8:6700-6707中记载。
58.表1目的基因所对应的引物列表
[0059][0060]
结合图3和图4可知，相较于气道注射scr sirna的小鼠，气道注射bcar3 sirna的小鼠的纤连蛋白、i型胶原和α-sma的转录水平及蛋白表达水平均降低，再次验证了气道注射bcar3 sirna的小鼠肺部纤维化得到较大程度的减轻。
[0061]
实施例3气道注射bcar3 sirna对羟脯氨酸水平的影响；
[0062]
1.实验材料：
[0063]
羟脯胺酸检测试剂盒：南京建成生物科技有限公司。
[0064]
2.实验方法：
[0065]
采用羟脯胺酸检测试剂盒对实施例1中各组小鼠肺组织中的羟脯氨酸的表达水平进行测定。
[0066]
测定结果如图5所示，结合图5可知，如上述实施例2的表达结果一致，相较于气道注射bcar3 sirna的小鼠，气道注射scr sirna小鼠经fitc诱导后，其纤维化程度更为严重，肺组织中羟脯氨酸水平显著上调。
[0067]
实施例4敲减bcar3对stat6信号通路的影响
[0068]
鉴于stat6信号通路在肺部纤维化病程中的作用，接下来检测了小鼠原代骨髓巨噬细胞中敲减bcar3后p-stat的表达变化情况。如图6所示，敲减bcar3后，p-stat6表达水平显著下调。
[0069]
实施例5敲减bcar3对m2型巨噬细胞极化的影响
[0070]
越来越多的证据表明，m2型巨噬细胞极化这一过程，对于维持肺纤维化是必须的。因此我们进一步检测了bcar3对于经il-4刺激后m2型巨噬细胞极化的影响。
[0071]
如图7所示，western blot及rt-pcr结果表明，相较于转染scr sirna的细胞，采用10ng/ml il-4刺激后转染bcar3 sirna的小鼠原代骨髓巨噬细胞的m2型表型蛋白表达显著降低。
[0072]
实施例6敲减bcar3对成纤维细胞分化的影响
[0073]
成纤维细胞分化为肌成纤维细胞对纤维化的发生至关重要。因此我们进一步检测了bcar3对tgf-β诱导的成纤维细胞分化的影响。
[0074]
如图8所示，western blot结果表明，相较于转染scr sirna的细胞，采用10ng/ml tgf-β刺激后转染bcar3 sirna的小鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的标志蛋白显著降低。
[0075]
综上所述，上述数据表明抑制bcar3可抑制m2型巨噬细胞极化和成纤维细胞分化，进而减缓肺纤维化进程。而m2型巨噬细胞极化和成纤维细胞分化在肾纤维化，心肌纤维化、肝纤维化和皮肤纤维化中亦发挥重要的作用，故抑制bcar3可减缓上述纤维化的发病，为其治疗提供新的靶点。