企鹅珍珠贝Mitf基因的启动子及其应用

企鹅珍珠贝mitf基因的启动子及其应用
技术领域
1.本发明属于水产科学和基因工程技术领域，更具体地，涉及企鹅珍珠贝mitf基因的启动子及其应用。


背景技术：

2.企鹅珍珠贝(pteria penguin)是一种用于培育大型海水珍珠的优质母贝，其黑色素的表达水平可影响珍珠质的色泽，进而影响珍珠质量。为培育色彩特异的珍珠，可通过调控企鹅珍珠贝黑色素合成信号通路基因的表达水平来调控黑色素的合成，从而影响企鹅珍珠贝珍珠质色泽及壳色，为突破珍珠贝色泽优化关键技术和稀有色泽珍珠的培育奠定基础。
3.企鹅珍珠贝黑色素的合成具有复杂的信号通路。其中，酪氨酸酶(tyr)是关键的限速酶，能够催化黑色素合成的三个关键步骤。小眼畸形相关转录因子(mitf)是哺乳动物黑色素合成的核心转录因子，mitf可结合到tyr基因启动子的m-box或e-box上激活tyr表达，促进黑色素形成。如果说tyr是命令的行使者，mitf则是运筹帷幄的决策者。mitf作为黑色素合成核心转录因子，自身也被其他上游基因调控，这些上游基因是黑色素合成信号通路的重要因子，可通过调控mitf的表达，影响tyr的表达，最终影响黑色素合成水平。因此，挖掘mitf的转录因子，对于黑色素合成通路的构建具有重要理论意义，对于突破珍珠贝色泽优化关键技术具有重要生产意义。而为便于筛选鉴定相关的转录因子，有必要提供一种筛选鉴定企鹅珍珠贝mitf的转录因子的方法。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种企鹅珍珠贝mitf基因的启动子及其应用。
5.本发明的第一个目的是提供一种企鹅珍珠贝mitf基因的启动子。
6.本发明的第二个目的是提供一种含有企鹅珍珠贝mitf基因的启动子的重组载体。
7.本发明的第三个目的是提供一种含有企鹅珍珠贝mitf基因的启动子的重组载体的重组细胞。
8.本发明的第四个目的是提供所述启动子，所述重组载体和/或所述重组细胞在筛选/鉴定企鹅珍珠贝mitf基因的转录因子中的应用。
9.本发明的第五个目的是提供一种筛选/鉴定企鹅珍珠贝mitf基因的转录因子的方法。
10.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
11.本发明提供了一种企鹅珍珠贝mitf基因的启动子，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
12.本发明通过构建seq id no.1所示启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体，验证了该启动子为mitf基因的强启动子。在此基础上，本发明利用构建所得的启动子驱动的
荧光素酶报告基因重组载体，构建了mitf基因的转录因子的筛选鉴定方法，克服了目前尚未有用于筛选鉴定企鹅珍珠贝mitf的转录因子的启动子及方法的缺陷。
13.因此，本发明申请保护所述企鹅珍珠贝mitf基因的启动子，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
14.本发明还申请保护一种重组载体，所述载体中含有seq id no.1所示启动子的核苷酸序列。
15.为便于测定seq id no.1所示启动子的活性，或利用该重组载体进行mitf基因的转录因子的筛选与鉴定，所述重组载体为带有荧光素报告基因的载体。
16.具体地，所述载体为seq id no.1所示启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体。
17.在本发明的实施例中，所用载体为pgl3-basic荧光素报告基因载体。
18.本发明还申请保护一种重组细胞，所述细胞中含有上述任一所述重组载体。
19.具体地，所用细胞为293t细胞。传统认为贝类启动子要在贝类细胞中表达才最有效，而本发明发现mitf启动子可以在293t细胞中表达且能用于筛选。
20.通过将本发明所构建的seq id no.1所示启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体，与含待鉴定的目的基因(转录因子)序列的表达载体共转染293t细胞系，或将含待鉴定的目的基因序列的表达载体转染至含有本发明所构建的seq id no.1所示启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体的重组细胞，通过测定细胞中的荧光素酶活性，即可以通过比较荧光素酶活性判断所鉴定的目的基因是否为mitf基因的转录因子。
21.因此，本发明还申请保护所述启动子、重组载体、重组细胞在筛选/鉴定企鹅珍珠贝mitf基因的转录因子中的应用。
22.本发明还提供了一种筛选/鉴定企鹅珍珠贝mitf基因的转录因子的方法，包含以下步骤：
23.s1.构建含待鉴定目的基因的重组载体；
24.s2.将步骤s1所得重组载体与本发明所构建的seq id no.1所示启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体共同转染细胞，收集细胞进行双荧光素酶报告分析；
25.s3.结果判定，若过表达目的基因的细胞的荧光素酶活性高于对照，则表明所鉴定的目的基因为企鹅珍珠贝mitf基因的转录因子。
26.具体地，步骤s1所用表达载体为pcdna3.1。
27.具体地，步骤s3结果判定中以pcdna3.1空载体和本发明所构建的seq id no.1所示启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体共转染的细胞作为阴性对照。
28.具体地，共转染所用细胞为293t细胞。
29.除将构建的含目的基因的表达载体与seq id no.1所示启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体共转染细胞以筛选鉴定mitf基因的转录因子外，还可通过将含目的基因的表达载体转染含有本发明所构建的seq id no.1所示启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体的重组细胞，通过对细胞进行双荧光素酶报告分析，判断所鉴定的目的基因是否为mitf基因的转录因子。
30.本发明具有以下有益效果：
31.本发明提供了一种企鹅珍珠贝mitf基因的启动子，通过将该启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体与含有待鉴定的目的基因(转录因子)序列的表达载体共转染至细胞
中，通过测定细胞中荧光素酶活性，即可确定所鉴定的目的基因是否为mitf的转录因子。本发明克服了目前尚未有用于筛选鉴定企鹅珍珠贝mitf的转录因子的启动子及方法的缺陷，对mitf的转录因子的筛选鉴定、珍珠贝色泽优化关键技术的突破及稀有色泽珍珠的培育具有重要意义。
附图说明
32.图1为基因组步移扩增mitf基因的启动子的单个dna片段的电泳图。
33.图2为本发明所述启动子的电泳图。
34.图3为本发明所述启动子的序列分析结果。
35.图4为本发明所述启动子的活性分析结果。
36.图5为creb2基因调控mitf基因表达的结果。
37.注：图4和5中的**代表p《0.01。
具体实施方式
38.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
39.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
40.实施例1启动子序列的克隆及分析
41.1、基因组步移扩增mitf基因的启动子序列
42.本发明利用e.z.n.a.组织dna试剂盒(omega)从企鹅珍珠贝中提取基因组dna，构建了基因组walker文库，具体实验过程参照试剂盒说明书的操作步骤进行。在此基础上，本发明设计了三个引物(mitf-pro-sp1、mitf-pro-sp2和mitf-pro-sp3)，通过基因组步移扩增了mitf基因的启动子的单个dna片段。将3个dna片段拼接后，使用引物对mitf-pro-f和mitf-pro-r验证拼接序列是否正确。上述引物的核苷酸序列如表1所示。
43.表1克隆及验证mitf的启动子区域所用引物
[0044][0045]
染色体步移分三步进行，pcr反应体系和程序如下：
[0046]
(1)第一轮pcr反应
[0047]
以基因组dna作为模板，以ap primer作为上游引物，mitf-pro-sp1为下游引物，进行第一轮pcr反应。
[0048]
第一轮pcr反应体系
[0049][0050]
第一轮pcr反应程序
[0051][0052]
(2)第二轮pcr反应
[0053]
将第一轮pcr反应的反应液稀释100倍后，取1μl作为第二轮pcr反应的模板，以pad1 primer为上游引物，mitf-pro-sp2为下游引物，进行第二轮pcr反应。
[0054]
第二轮pcr反应体系
[0055][0056]
第二轮pcr反应程序
[0057][0058]
(3)第三轮pcr反应
[0059]
将第二轮pcr反应的反应液稀释100倍后，取1μl作为第三轮pcr反应的模板，以pad2 primer为上游引物，mitf-pro-sp3为下游引物，进行第三轮pcr反应，反应条件和程序同第二轮pcr反应。
[0060]
每轮pcr反应液各5μl，使用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测；然后紫外灯下切胶清晰的电泳条带，用胶回收试剂盒(omega)回收目的片段，目的片段的电泳检测结果如图1所示。将3个dna片段拼接后，使用引物对mitf-pro-f和mitf-pro-r进行验证，结果显示拼接序列正确。
[0061]
2、mitf基因启动子序列的测序分析
[0062]
以企鹅珍珠贝的基因组为模板，扩增mitf基因的启动子序列，所用引物为mitf-pro-f和mitf-pro-r。pcr扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，所用marker为dl 2000，电泳结果如图2所示，由图可知，扩增得到了大小为2000bp左右的单一条带。将扩增产物送公司测序后对其进行比对分析。
[0063]
本发明扩增所得mitf基因启动子的核苷酸序列如下(seq id no.1)所示：gagagggggtgaaggttgattgactgattattgtggagatggggcgttttctagattgaacttaccacagggttttcattttgcaccttttcctattgaaataccaataatagatcgcttggtattataatagagaggggggtgaaggttgattgactaattattgttttacgtcaagtgctgcacgatttttaacgtctgtggttatagcatctctctgatgcattgatagaggttcatgcctttgcaacagacccacaggccgaagcagccagggatcgtttacgtgccacacttattttgacactatacat
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[0064]
扩增所得启动子序列的分析结果如图3所示，由图3可知，本发明扩增得到了起始密码子(atg)上游2000bp的基因组序列；mitf基因的转录起始位点位于atg上游的96bp处，被指定为 1位；转录起始位点上游的2000bp序列被认为是一个推测的启动子。本发明扩增所得启动子序列中存在5个典型的camp反应元件(cre)，分别位于该序列的第1832～1824位、第1075～1066位、第976～967位、第740～728位和第61～53位；此外还含有4个保守的pax3结合位点。
[0065]
实施例2启动子的活性测定
[0066]
1、构建启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体
[0067]
为验证实施例1扩增所得mitf基因的启动子的功能，本发明构建了该启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体(mitf-promoter-luc)，具体过程如下所述：
[0068]
使用引物mitf-pro-luc-f(cttacgcgtgagagggggtgaaggttg)和mitf-pro-luc-r(cgcagatctcatttcgttctttatttgtc)将实施例1所述启动子序列扩增出来，并在启动子序列的5’端引入酶切位点为mluⅰ，在启动子序列的3’端引入酶切位点bgl iⅰ，使用pgl3-basic载体，将启动子序列和pgl3-basic载体同时酶切后，回收酶切后片段，按照表2中的连接体系混合，50℃水浴连接15min，连接产物用上海生工公司的大肠杆菌dh5α感受态细胞进行转
化。
[0069]
表2启动子与pgl3-basic载体的连接体系
[0070][0071][0072]
取出-80℃保存的感受态大肠杆菌，立即静置于冰中；将适量体积的连接产物(每100μl感受态细胞加入50ng dna，体积不超过感受态细胞体积的5％)与感受态细胞轻轻混匀，冰上静置20min；42℃热激90s，然后冰上放置2～3min；加入900μl的lb液体培养基(不含抗生素)，37℃150rpm振荡培养1～1.5h；培养结束后5000rpm离心3min，弃上清，用100μl lb液体培养基重悬浮菌体。将重悬液涂于含氨苄青霉素抗性的lb平板上，37℃倒置培养12～20h。选取单菌落，用引物tyr-pro-luc-f和tyr-pro-luc-r进行菌落pcr鉴定，提取鉴定合格的菌液中的重组载体，并对所得tyr-promoter-luc重组载体进行测序，测序结果表明，获得的重组表达载体中的启动子序列正确，与seq id no.1所示序列相同，表明本发明成功构建了启动子驱动的荧光素酶报告基因重组载体(mitf-promoter-luc)，可利用双荧光素酶报告子法测定mitf启动子的活性。
[0073]
2、启动子活性测定
[0074]
取293t细胞在添加有10％胎牛血清(fcs)的dmem培养基中，于37℃培养，然后将0.4μg的mitf-promoter-luc重组载体和0.04μg的prl-cmv载体与1μl的lipofectamine 2000(invitrogen)混合，在24孔板中转染入细胞，同时转染pgl3-basic空载体和prl-cmv载体作为阴性对照。48h后，收集细胞并使用双荧光素酶报告分析系统(promega)进行裂解，具体操作步骤参照系统说明书进行，荧光强度用junior-lb9509光度计测定，荧光素酶活性以萤火虫荧光与renilla荧光的相对光单位(rlu)表示。
[0075]
荧光素酶活性检测结果如图4所示，转染pgl3-basic空载体的细胞显示低水平的荧光素酶活性，而转染mitf-promoter-luc重组载体的细胞显示高荧光素酶活性，差异极显著(p《0.01)，表明本发明所得mitf-promoter是一个强启动子。
[0076]
实施例3 mitf基因的转录因子的鉴定
[0077]
下面以鉴定creb2是否为mitf基因的转录因子为例，说明本发明所得mitf基因的启动子在筛选鉴定mitf基因的转录因子中的应用。
[0078]
以企鹅珍珠贝总rna逆转录所得cdna为模板，用引物creb2-f(gcggctagcatgatggatttttcagtaga)和creb2-r(gcgctcgagttaataatttttgttcttaaacgta)扩增creb2基因序列。然后将扩增所得目的片段与质粒pcdna3.1连接，构建creb2-pcdna3.1重组表达载体。creb基因序列的上游酶切位点为nheⅰ，下游酶切位点为xhoⅰ。随后将creb2-pcdna3.1重组载体和mitf-promoter-luc重组载体共转染进293t细胞系，另外将pcdna3.1和mitf-promoter-luc重组载体共转染进293t细胞系作为阴性对照。48h后，收集细胞并使用双荧光素酶报告分析系统进行裂解，检测双荧光素酶的试剂和方法同实施例2。
[0079]
creb2基因调控mitf基因表达的结果如图5所示，由图5可知，过表达creb2基因的细胞表现出高荧光素酶活性，显著高于pcdna3.1细胞荧光素酶活性(p《0.01)，结果表明creb2对mitf具有明显的调控作用，证实creb2是mitf的上游转录因子，能激活mitf的表达。
[0080]
使用相同的方法，可以筛选鉴定企鹅珍珠贝中的其它黑色素相关基因是否为mitf的转录因子。
[0081]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。