1.本发明属于生物材料
技术领域：
：，具体涉及一种多孔明胶微载体的制备方法及其应用。
背景技术：
：：2.微载体是指直径在60～250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠，其主要由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。自vanwezel用deae-sephadexa50研制的第一种微载体问世以来，国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、phema微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。在众多微载体中，明胶微载体由于其良好的细胞粘附性能，而备受关注。3.明胶是一种由胶原分子降解而制得的多肽混合物，共有十八种不同氨基酸组成了明胶肽链，3’端的羧基5’端的氨基。明胶是由α-氨基酸缩合而成，其主链单元为ch-co-nh-，侧链中极性基团可分为酸性、碱性和中性基团。4.目前已有通过明胶制备多孔微载体的方法。cn113750076a公开了一种基于几丁质-明胶复合多孔微球作为药物载体及其制备方法与应用，所述制备方法包括：合成明胶微球；制备几丁质溶液并调节ph值至中性；合成几丁质-明胶复合多孔微球(将几丁质溶液和明胶微球以质量比为1:10～5:10混合，滴加至油相中，水浴反应)；降温至0±2℃，加入戊二醛进行交联反应；静置，去上清液；加入石油醚洗去多余的液体石蜡，静置，去上层白色乳液；再加入去离子水洗涤，直至上层没有油滴为止，冻干后即得。cn107073165b提供了一种能够获得具有特有的性质及粒度分布的多孔微载体的调制方法，并提供一种具有优异的细胞增殖特性的明胶多孔微载体。根据本发明，提供一种包括使用了具有特定hlb值的乳化剂的含量的乳化工序的基因重组明胶多孔微载体的调制方法及具有特定的空隙的明胶多孔微载体。5.上述专利拓展了多孔明胶微载体的制备方法，但存在制备过程复杂，方法可控程度低，需特制乳化剂或改性明胶带来的高成本等技术问题。由此，研发一种制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，生物安全性高，易于工业化生产制备多孔明胶微载体的方法，具有极高的价值。技术实现要素：6.本发明的目的在于提供一种多孔明胶微载体的制备方法，所述方法制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，生物安全性高，易于工业化生产。7.基于上述目的，本发明通过提供一种多孔明胶微载体的制备方法来满足本领域内的这种需要。8.一方面，本发明涉及一种多孔明胶微载体的制备方法，其包括向明胶溶液中添加碱性溶液制备多孔明胶微载体；所述碱性溶液为能电离出oh－的溶液；以体积计，所述碱性溶液与明胶溶液的配比为1:10～40。9.进一步地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法中，所述碱性溶液包括naoh溶液。10.进一步地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法中，所述碱性溶液中oh－浓度为0.25mol/l。11.进一步地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法中，所述明胶包括a型明胶或b型明胶；所述明胶溶液的质量百分浓度为5％～20％。12.进一步地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法中，所述向明胶溶液中添加碱性溶液后，添加质量百分浓度为2.5％～25％的交联剂进行交联固定1～24h；所述交联剂为饱和直链脂肪族二元醛；以体积计，所述交联剂与所述明胶溶液的配比为1:10。13.进一步地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法中，选用质量百分浓度为2.5％的戊二醛作为所述交联剂；所述交联固定时长为1～12h。14.进一步地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法中，所述方法还包括：所述交联固定完成后得到水相溶液，将所述水相溶液与有机相溶液混合，搅拌乳化生成w/o型液滴，室温反应24h，收集乳液并清洗冷冻干燥灭菌。15.进一步地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法中，所述有机相溶液为食用油，所述食用油包括葵花籽油。16.具体地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法包括：17.水浴加热60℃～80℃，添加明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为5％～20％。待温度降到37℃，添加oh－浓度为0.25mol/l的碱性溶液，加入预混液中搅拌，然后添加交联剂进行交联固定，得到水相溶液；18.以体积计，所述碱性溶液与明胶溶液的配比为1:10～40；明胶选用a型明胶或b型明胶；所述明胶溶液的质量百分浓度为5％～20％；碱性溶液选用naoh溶液；交联剂选用饱和直链脂肪族二元醛，质量百分浓度为2.5％～25％，以体积比计，交联剂与明胶溶液的配比为1:10，交联时间为1～24h；优选地，交联剂选用戊二醛，质量百分浓度为2.5％，以体积比计，戊二醛与明胶溶液的配比为1:10，交联时间为1～12h。19.将有机相溶液以转速700rpm机械搅拌1h，除去溶液中产生的气泡；有机相溶液选用食用油；优选地，有机相溶液选用葵花籽油。将所述水相溶液与有机相溶液混合，搅拌速率1000rpm，充分搅拌30min生成w/o型液滴；以体积计，水相溶液与有机相溶液的配比为1:100。室温反应24h，收集乳液，将上层有机相滤除，收集微载体。将收集的微载体用清洗剂进行清洗，去除微载体材料的表面有机相。冷冻干燥灭菌，得到所述多孔明胶微载体。20.本发明采用添加碱性溶液制备多孔明胶微载体，已达到控制孔径和孔隙率的目的。所得多孔明胶微载体经干细胞微组织培养试验，得到的干细胞微组织更致密，更接近动物组织性状。由此，本发明进一步请求保护采用上述方法制备的一种微载体与该微载体在细胞培养中的应用。21.本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：22.本发明提供了一种多孔明胶微载体的制备方法。该方法通过添加碱性溶液，控制明胶溶液形成凝胶的反应速率，进而控制凝胶的交联度及交联时间，实现均一地调控多孔明胶微载体的孔径和孔隙率。该方法所述制备过程无需对明胶进行改性或采用特制试剂，制备方法简单易行，方法可控，成本低廉，生物安全性高，易于工业化生产。附图说明23.图1为实施例1制得多孔明胶微载体的tem图。24.图2为实施例2制得多孔明胶微载体的tem图。25.图3为实施例3制得多孔明胶微载体的tem图。26.图4为实施例4制得多孔明胶微载体的tem图。27.图5为培养5天牛脐带来源干细胞微组织he切片图像。图5a为市售微载体培养5天牛脐带来源干细胞微组织he切片图像；图5b为实施例4制得多孔明胶微载体培养5天牛脐带来源干细胞微组织he切片图像。具体实施方式28.下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。29.实施例130.本实施例提供了以a型明胶为原料的多孔明胶微载体制备试验。31.本试验中，明胶溶液的配制为水浴加热60℃～80℃，添加a型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为5％；碱性溶液选用0.25m的naoh溶液；交联剂选用质量百分浓度为2.5％的戊二醛；有机相选用葵花籽油。32.水浴加热60℃～80℃，添加a型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为5％。待温度降到37℃，添加明胶溶液体积的1/40，0.25m的naoh溶液搅拌。然后添加明胶溶液体积的1/10，2.5％戊二醛进行交联固定1h，得到水相溶液。33.将葵花籽油以转速700rpm进行机械搅拌1h，除去溶液中产生的气泡，得到有机相溶液。34.以体积计，水相溶液与有机相溶液的配比为1:100，将水相溶液与有机相溶液混合，搅拌速率1000rpm，充分搅拌30min生成w/o型液滴。室温反应24h，收集乳液，将上层有机相滤除，收集微载体。35.对收集的微载体进行清洗。首先使用石油醚进行超声清洗，第二次使用充分预冷的丙酮超声清洗，收集沉淀下来的微载体颗粒，37℃烘干，再次添加去离子水超声清洗，共超声清洗5次。将经过清洗后的微载体润湿在少量水中，并转移至-20℃的冷冻装置中进行预先冷冻，冷冻后转移至冻干机内-40℃冷冻干燥24h。用co60辐照灭菌。36.得到的多孔明胶微载体上微孔的孔径为1～20微米，孔隙率达到75～85％，其图像如图1所示。37.实施例238.本实施例提供了碱性溶液与明胶溶液的配比为1:20的多孔明胶微载体制备试验。39.本试验中，明胶溶液的配制为水浴加热60℃～80℃，添加a型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为20％；碱性溶液选用0.25m的naoh溶液；交联剂选用质量百分浓度为25％的戊二醛；有机相选用葵花籽油。40.水浴加热60℃～80℃，添加a型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为20％。待温度降到37℃，添加明胶溶液体积的1/20，0.25m的naoh溶液搅拌。然后添加明胶溶液体积的1/10，25％戊二醛进行交联固定24h，得到水相溶液。41.将葵花籽油以转速700rpm进行机械搅拌1h，除去溶液中产生的气泡，得到有机相溶液。42.以体积计，水相溶液与有机相溶液的配比为1:100，将水相溶液与有机相溶液混合，搅拌速率1000rpm，充分搅拌30min生成w/o型液滴。室温反应24h，收集乳液，将上层有机相滤除，收集微载体。43.对收集的微载体进行清洗。首先使用石油醚进行超声清洗，第二次使用充分预冷的丙酮超声清洗，收集沉淀下来的的微载体颗粒，37℃烘干，再次添加去离子水超声清洗，共超声清洗5次。将经过清洗后的微载体润湿在少量水中，并转移至-20℃的冷冻装置中进行预先冷冻，冷冻后转移至冻干机内-40℃冷冻干燥24h。用co60辐照灭菌。44.得到的多孔明胶微载体上微孔的孔径为20～60微米，孔隙率达到85～95％，其图像如图2所示。45.实施例346.本实施例提供了明胶溶液的质量百分浓度为10％的多孔明胶微载体制备试验。47.本试验中，明胶溶液的配制为水浴加热60℃～80℃，添加a型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为10％；碱性溶液选用0.25m的naoh溶液；交联剂选用质量百分浓度为2.5％的戊二醛；有机相选用葵花籽油。48.水浴加热60℃～80℃，添加a型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为10％。待温度降到37℃，添加明胶溶液体积的1/10，0.25m的naoh溶液搅拌。然后添加明胶溶液体积的1/10，2.5％戊二醛进行交联固定12h，得到水相溶液。49.将葵花籽油以转速700rpm进行机械搅拌1h，除去溶液中产生的气泡，得到有机相溶液。50.以体积计，水相溶液与有机相溶液的配比为1:100，将水相溶液与有机相溶液混合，搅拌速率1000rpm，充分搅拌30min生成w/o型液滴。室温反应24h，收集乳液，将上层有机相滤除，收集微载体。51.对收集的微载体进行清洗。首先使用石油醚进行超声清洗，第二次使用充分预冷的丙酮超声清洗，收集沉淀下来的微载体颗粒，37℃烘干，再次添加去离子水超声清洗，共超声清洗5次。将经过清洗后的微载体润湿在少量水中，并转移至-20℃的冷冻装置中进行预先冷冻，冷冻后转移至冻干机内-40℃冷冻干燥24h。用co60辐照灭菌。52.得到的多孔明胶微载体上微孔的孔径为50～100微米，孔隙率达到85～95％，其图像如图3所示。53.实施例454.本实施例提供了以b型明胶为原料的多孔明胶微载体制备试验。55.本试验中，明胶溶液的配制为水浴加热60℃～80℃，添加b型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为10％；碱性溶液选用0.25m的naoh溶液；交联剂选用质量百分浓度为25％的戊二醛；有机相选用葵花籽油。56.水浴加热60℃～80℃，添加b型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为10％。待温度降到37℃，添加明胶溶液体积的1/10，0.25m的naoh溶液搅拌。然后添加明胶溶液体积的1/10，2.5％戊二醛进行交联固定12h，得到水相溶液。57.将葵花籽油以转速700rpm进行机械搅拌1h，除去溶液中产生的气泡，得到有机相溶液。58.以体积计，水相溶液与有机相溶液的配比为1:100，将水相溶液与有机相溶液混合，搅拌速率1000rpm，充分搅拌30min生成w/o型液滴。室温反应24h，收集乳液，将上层有机相滤除，收集微载体。59.对收集的微载体进行清洗。首先使用石油醚进行超声清洗，第二次使用充分预冷的丙酮超声清洗，收集沉淀下来的微载体颗粒，37℃烘干，再次添加去离子水超声清洗，共超声清洗5次。将经过清洗后的微载体润湿在少量水中，并转移至-20℃的冷冻装置中进行预先冷冻，冷冻后转移至冻干机内-40℃冷冻干燥24h。用co60辐照灭菌。60.得到的多孔明胶微载体上微孔的孔径为50～100微米，孔隙率达到85～95％，其图像如图4所示。61.实施例562.本实施例提供了实施例4所得多孔明胶微载体与市售微载体的细胞微组织培养对比试验。63.市售微载体型号为f01-100/3dtable微载片曲将实施例4制备的微载体用co60辐照灭菌后，选取125ml细胞反应器，将实验分为两组：64.实验组1：100mg市售微载体 2.5×104cells/ml牛脐带间充质干细胞 50ml含5％牛血小板裂解液的α-mem培养液；实验组2：100mg实施例4制备的微载体 2.5×104cells/ml牛脐带间充质干细胞 50ml含5％牛血小板裂解液的α-mem培养液进行细胞培养。培养120h后，细胞形成致密团簇结构，细胞数量大。继续培养5天后，将得到的干细胞微组织进行he切片染色，he染色结果如图5所示。65.图5所示微组织he切片表明，本发明提供的微载体(图5b)与市售微载体(图5a)相比，本发明提供的微载体培养得到的干细胞微组织更致密，更接近动物组织性状。66.如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：，具体涉及一种多孔明胶微载体的制备方法及其应用。
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：：2.微载体是指直径在60～250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠，其主要由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。自vanwezel用deae-sephadexa50研制的第一种微载体问世以来，国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、phema微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。在众多微载体中，明胶微载体由于其良好的细胞粘附性能，而备受关注。3.明胶是一种由胶原分子降解而制得的多肽混合物，共有十八种不同氨基酸组成了明胶肽链，3’端的羧基5’端的氨基。明胶是由α-氨基酸缩合而成，其主链单元为ch-co-nh-，侧链中极性基团可分为酸性、碱性和中性基团。4.目前已有通过明胶制备多孔微载体的方法。cn113750076a公开了一种基于几丁质-明胶复合多孔微球作为药物载体及其制备方法与应用，所述制备方法包括：合成明胶微球；制备几丁质溶液并调节ph值至中性；合成几丁质-明胶复合多孔微球(将几丁质溶液和明胶微球以质量比为1:10～5:10混合，滴加至油相中，水浴反应)；降温至0±2℃，加入戊二醛进行交联反应；静置，去上清液；加入石油醚洗去多余的液体石蜡，静置，去上层白色乳液；再加入去离子水洗涤，直至上层没有油滴为止，冻干后即得。cn107073165b提供了一种能够获得具有特有的性质及粒度分布的多孔微载体的调制方法，并提供一种具有优异的细胞增殖特性的明胶多孔微载体。根据本发明，提供一种包括使用了具有特定hlb值的乳化剂的含量的乳化工序的基因重组明胶多孔微载体的调制方法及具有特定的空隙的明胶多孔微载体。5.上述专利拓展了多孔明胶微载体的制备方法，但存在制备过程复杂，方法可控程度低，需特制乳化剂或改性明胶带来的高成本等技术问题。由此，研发一种制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，生物安全性高，易于工业化生产制备多孔明胶微载体的方法，具有极高的价值。技术实现要素：6.本发明的目的在于提供一种多孔明胶微载体的制备方法，所述方法制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，生物安全性高，易于工业化生产。7.基于上述目的，本发明通过提供一种多孔明胶微载体的制备方法来满足本领域内的这种需要。8.一方面，本发明涉及一种多孔明胶微载体的制备方法，其包括向明胶溶液中添加碱性溶液制备多孔明胶微载体；所述碱性溶液为能电离出oh－的溶液；以体积计，所述碱性溶液与明胶溶液的配比为1:10～40。9.进一步地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法中，所述碱性溶液包括naoh溶液。10.进一步地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法中，所述碱性溶液中oh－浓度为0.25mol/l。11.进一步地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法中，所述明胶包括a型明胶或b型明胶；所述明胶溶液的质量百分浓度为5％～20％。12.进一步地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法中，所述向明胶溶液中添加碱性溶液后，添加质量百分浓度为2.5％～25％的交联剂进行交联固定1～24h；所述交联剂为饱和直链脂肪族二元醛；以体积计，所述交联剂与所述明胶溶液的配比为1:10。13.进一步地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法中，选用质量百分浓度为2.5％的戊二醛作为所述交联剂；所述交联固定时长为1～12h。14.进一步地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法中，所述方法还包括：所述交联固定完成后得到水相溶液，将所述水相溶液与有机相溶液混合，搅拌乳化生成w/o型液滴，室温反应24h，收集乳液并清洗冷冻干燥灭菌。15.进一步地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法中，所述有机相溶液为食用油，所述食用油包括葵花籽油。16.具体地，本技术提供的多孔明胶微载体的制备方法包括：17.水浴加热60℃～80℃，添加明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为5％～20％。待温度降到37℃，添加oh－浓度为0.25mol/l的碱性溶液，加入预混液中搅拌，然后添加交联剂进行交联固定，得到水相溶液；18.以体积计，所述碱性溶液与明胶溶液的配比为1:10～40；明胶选用a型明胶或b型明胶；所述明胶溶液的质量百分浓度为5％～20％；碱性溶液选用naoh溶液；交联剂选用饱和直链脂肪族二元醛，质量百分浓度为2.5％～25％，以体积比计，交联剂与明胶溶液的配比为1:10，交联时间为1～24h；优选地，交联剂选用戊二醛，质量百分浓度为2.5％，以体积比计，戊二醛与明胶溶液的配比为1:10，交联时间为1～12h。19.将有机相溶液以转速700rpm机械搅拌1h，除去溶液中产生的气泡；有机相溶液选用食用油；优选地，有机相溶液选用葵花籽油。将所述水相溶液与有机相溶液混合，搅拌速率1000rpm，充分搅拌30min生成w/o型液滴；以体积计，水相溶液与有机相溶液的配比为1:100。室温反应24h，收集乳液，将上层有机相滤除，收集微载体。将收集的微载体用清洗剂进行清洗，去除微载体材料的表面有机相。冷冻干燥灭菌，得到所述多孔明胶微载体。20.本发明采用添加碱性溶液制备多孔明胶微载体，已达到控制孔径和孔隙率的目的。所得多孔明胶微载体经干细胞微组织培养试验，得到的干细胞微组织更致密，更接近动物组织性状。由此，本发明进一步请求保护采用上述方法制备的一种微载体与该微载体在细胞培养中的应用。21.本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：22.本发明提供了一种多孔明胶微载体的制备方法。该方法通过添加碱性溶液，控制明胶溶液形成凝胶的反应速率，进而控制凝胶的交联度及交联时间，实现均一地调控多孔明胶微载体的孔径和孔隙率。该方法所述制备过程无需对明胶进行改性或采用特制试剂，制备方法简单易行，方法可控，成本低廉，生物安全性高，易于工业化生产。附图说明23.图1为实施例1制得多孔明胶微载体的tem图。24.图2为实施例2制得多孔明胶微载体的tem图。25.图3为实施例3制得多孔明胶微载体的tem图。26.图4为实施例4制得多孔明胶微载体的tem图。27.图5为培养5天牛脐带来源干细胞微组织he切片图像。图5a为市售微载体培养5天牛脐带来源干细胞微组织he切片图像；图5b为实施例4制得多孔明胶微载体培养5天牛脐带来源干细胞微组织he切片图像。具体实施方式28.下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。29.实施例130.本实施例提供了以a型明胶为原料的多孔明胶微载体制备试验。31.本试验中，明胶溶液的配制为水浴加热60℃～80℃，添加a型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为5％；碱性溶液选用0.25m的naoh溶液；交联剂选用质量百分浓度为2.5％的戊二醛；有机相选用葵花籽油。32.水浴加热60℃～80℃，添加a型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为5％。待温度降到37℃，添加明胶溶液体积的1/40，0.25m的naoh溶液搅拌。然后添加明胶溶液体积的1/10，2.5％戊二醛进行交联固定1h，得到水相溶液。33.将葵花籽油以转速700rpm进行机械搅拌1h，除去溶液中产生的气泡，得到有机相溶液。34.以体积计，水相溶液与有机相溶液的配比为1:100，将水相溶液与有机相溶液混合，搅拌速率1000rpm，充分搅拌30min生成w/o型液滴。室温反应24h，收集乳液，将上层有机相滤除，收集微载体。35.对收集的微载体进行清洗。首先使用石油醚进行超声清洗，第二次使用充分预冷的丙酮超声清洗，收集沉淀下来的微载体颗粒，37℃烘干，再次添加去离子水超声清洗，共超声清洗5次。将经过清洗后的微载体润湿在少量水中，并转移至-20℃的冷冻装置中进行预先冷冻，冷冻后转移至冻干机内-40℃冷冻干燥24h。用co60辐照灭菌。36.得到的多孔明胶微载体上微孔的孔径为1～20微米，孔隙率达到75～85％，其图像如图1所示。37.实施例238.本实施例提供了碱性溶液与明胶溶液的配比为1:20的多孔明胶微载体制备试验。39.本试验中，明胶溶液的配制为水浴加热60℃～80℃，添加a型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为20％；碱性溶液选用0.25m的naoh溶液；交联剂选用质量百分浓度为25％的戊二醛；有机相选用葵花籽油。40.水浴加热60℃～80℃，添加a型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为20％。待温度降到37℃，添加明胶溶液体积的1/20，0.25m的naoh溶液搅拌。然后添加明胶溶液体积的1/10，25％戊二醛进行交联固定24h，得到水相溶液。41.将葵花籽油以转速700rpm进行机械搅拌1h，除去溶液中产生的气泡，得到有机相溶液。42.以体积计，水相溶液与有机相溶液的配比为1:100，将水相溶液与有机相溶液混合，搅拌速率1000rpm，充分搅拌30min生成w/o型液滴。室温反应24h，收集乳液，将上层有机相滤除，收集微载体。43.对收集的微载体进行清洗。首先使用石油醚进行超声清洗，第二次使用充分预冷的丙酮超声清洗，收集沉淀下来的的微载体颗粒，37℃烘干，再次添加去离子水超声清洗，共超声清洗5次。将经过清洗后的微载体润湿在少量水中，并转移至-20℃的冷冻装置中进行预先冷冻，冷冻后转移至冻干机内-40℃冷冻干燥24h。用co60辐照灭菌。44.得到的多孔明胶微载体上微孔的孔径为20～60微米，孔隙率达到85～95％，其图像如图2所示。45.实施例346.本实施例提供了明胶溶液的质量百分浓度为10％的多孔明胶微载体制备试验。47.本试验中，明胶溶液的配制为水浴加热60℃～80℃，添加a型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为10％；碱性溶液选用0.25m的naoh溶液；交联剂选用质量百分浓度为2.5％的戊二醛；有机相选用葵花籽油。48.水浴加热60℃～80℃，添加a型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为10％。待温度降到37℃，添加明胶溶液体积的1/10，0.25m的naoh溶液搅拌。然后添加明胶溶液体积的1/10，2.5％戊二醛进行交联固定12h，得到水相溶液。49.将葵花籽油以转速700rpm进行机械搅拌1h，除去溶液中产生的气泡，得到有机相溶液。50.以体积计，水相溶液与有机相溶液的配比为1:100，将水相溶液与有机相溶液混合，搅拌速率1000rpm，充分搅拌30min生成w/o型液滴。室温反应24h，收集乳液，将上层有机相滤除，收集微载体。51.对收集的微载体进行清洗。首先使用石油醚进行超声清洗，第二次使用充分预冷的丙酮超声清洗，收集沉淀下来的微载体颗粒，37℃烘干，再次添加去离子水超声清洗，共超声清洗5次。将经过清洗后的微载体润湿在少量水中，并转移至-20℃的冷冻装置中进行预先冷冻，冷冻后转移至冻干机内-40℃冷冻干燥24h。用co60辐照灭菌。52.得到的多孔明胶微载体上微孔的孔径为50～100微米，孔隙率达到85～95％，其图像如图3所示。53.实施例454.本实施例提供了以b型明胶为原料的多孔明胶微载体制备试验。55.本试验中，明胶溶液的配制为水浴加热60℃～80℃，添加b型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为10％；碱性溶液选用0.25m的naoh溶液；交联剂选用质量百分浓度为25％的戊二醛；有机相选用葵花籽油。56.水浴加热60℃～80℃，添加b型明胶溶胀，使用去离子水充分溶解，终浓度为10％。待温度降到37℃，添加明胶溶液体积的1/10，0.25m的naoh溶液搅拌。然后添加明胶溶液体积的1/10，2.5％戊二醛进行交联固定12h，得到水相溶液。57.将葵花籽油以转速700rpm进行机械搅拌1h，除去溶液中产生的气泡，得到有机相溶液。58.以体积计，水相溶液与有机相溶液的配比为1:100，将水相溶液与有机相溶液混合，搅拌速率1000rpm，充分搅拌30min生成w/o型液滴。室温反应24h，收集乳液，将上层有机相滤除，收集微载体。59.对收集的微载体进行清洗。首先使用石油醚进行超声清洗，第二次使用充分预冷的丙酮超声清洗，收集沉淀下来的微载体颗粒，37℃烘干，再次添加去离子水超声清洗，共超声清洗5次。将经过清洗后的微载体润湿在少量水中，并转移至-20℃的冷冻装置中进行预先冷冻，冷冻后转移至冻干机内-40℃冷冻干燥24h。用co60辐照灭菌。60.得到的多孔明胶微载体上微孔的孔径为50～100微米，孔隙率达到85～95％，其图像如图4所示。61.实施例562.本实施例提供了实施例4所得多孔明胶微载体与市售微载体的细胞微组织培养对比试验。63.市售微载体型号为f01-100/3dtable微载片曲将实施例4制备的微载体用co60辐照灭菌后，选取125ml细胞反应器，将实验分为两组：64.实验组1：100mg市售微载体 2.5×104cells/ml牛脐带间充质干细胞 50ml含5％牛血小板裂解液的α-mem培养液；实验组2：100mg实施例4制备的微载体 2.5×104cells/ml牛脐带间充质干细胞 50ml含5％牛血小板裂解液的α-mem培养液进行细胞培养。培养120h后，细胞形成致密团簇结构，细胞数量大。继续培养5天后，将得到的干细胞微组织进行he切片染色，he染色结果如图5所示。65.图5所示微组织he切片表明，本发明提供的微载体(图5b)与市售微载体(图5a)相比，本发明提供的微载体培养得到的干细胞微组织更致密，更接近动物组织性状。66.如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。当前第1页12当前第1页12
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