一种由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23及其应用

一种由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一种由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23及其应用。


背景技术：

2.由荔枝霜疫霉(peronophythora litchii)引起的荔枝霜疫病是荔枝生产与贮运过程中危害最严重的病害，该病害目前主要分布在泰国、澳大利亚、越南、巴布亚新几内亚等国家。荔枝霜疫病常常引起大量的落花落果，严重影响荔枝的产量和质量。除此之外，即使采摘时看似健康完好的果实，在运输过程中也可能发病，造成严重的经济损失。
3.效应蛋白是病原菌在侵染寄主植物过程中分泌的一类毒力分子，其能破坏植物细胞的免疫系统，从而促进病原菌的侵染。rxlr效应蛋白(r代表精氨酸，l代表亮氨酸，x代表任意氨基酸)是植物病原卵菌特有的，作用于寄主植物胞内的一类重要致病因子。通过鉴定荔枝霜疫霉分泌的新型植物免疫激活蛋白，研究其与植物互作机理，可为开发新型防控策略及荔枝抗病育种提供理论依据。


技术实现要素：

4.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23。
5.本发明的另一目的在于提供所述由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23的编码基因。
6.本发明的再一目的在于提供所述由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23的应用。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23，其氨基酸序列选自如下任一序列：
9.(a)如seq id no：1所示的氨基酸序列(plavh23蛋白)；
10.(b)如seq id no：4所示的氨基酸序列(plavh23蛋白突变体：plavh23
24-331
)；
11.(c)如seq id no：6所示的氨基酸序列(plavh23蛋白突变体：plavh23
63-331
)。
12.所述的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23的编码基因，其核苷酸序列选自如下任一序列：
13.(d)如seq id no：2所示的核苷酸序列(plavh23的编码基因)；
14.(e)如seq id no：5所示的核苷酸序列(plavh23蛋白突变体的编码基因：plavh23
24-331
)；
15.(f)如seq id no：7所示的核苷酸序列(plavh23蛋白突变体的编码基因：plavh23
63-331
)。
16.含有所述由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌。
17.所述的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23在提高植物抗病能力、提高植物防御能力(诱导植物防御反应)、和/或提高植物对病原菌抗性(减少病原菌的侵染)中的应用。
18.所述的植物为烟草或荔枝；优选为本氏烟草。
19.所述的病原菌为疫霉菌；优选为辣椒疫霉和荔枝霜疫霉中的至少一种。
20.所述的提高植物抗病能力、提高植物防御能力及提高植物对病原菌抗性通过过表达由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23的方式实现；具体包括如下步骤：
21.(1)将上述由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23的编码基因连接到植物表达载体上，然后转化大肠杆菌，获得重组质粒；
22.(2)将重组质粒转入农杆菌，并在植物上瞬时表达。
23.步骤(1)中所述的植物表达载体优选为pvx载体。
24.步骤(1)中所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌jm109。
25.步骤(2)中所述的农杆菌优选为农杆菌gv3101。
26.所述的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23在诱导植物活性氧积累，诱导植物胼胝质积累，和/或上调植物防卫相关基因的表达方面的应用，可通过过表达由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23的方式实现。
27.所述的植物为烟草或荔枝；优选为本氏烟草。
28.所述的植物防卫相关基因包括nbpr1、nbpr2、nblox和nberf1中的至少一种。
29.所述的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23在防治植物病原菌或植物育种(培育抗病植株)方面的应用。
30.所述的植物为烟草或荔枝；优选为本氏烟草。
31.所述的病原菌为疫霉菌；优选为辣椒疫霉和荔枝霜疫霉中的至少一种。
32.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
33.(1)本发明鉴定到一个新的荔枝霜疫霉rxlr类效应蛋白plavh23，其可以被植物识别从而激发植物免疫反应，该植物免疫激活蛋白n端拥有典型的信号肽及rxlr-deer基序，并且预测得到三个lwy-domain，第一个lwy-domain在66-133aa，第二个lwy-domain在133-224aa，第三个lwy-domain在225-291aa。
34.(3)本发明中的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白plavh23能够诱导植物产生免疫反应，减少病原菌的侵染，plavh233个lwy-domain对其引起的免疫反应至关重要，该发明为提高植物抗性提供了新途径，可以应用于荔枝霜疫病的防治。
附图说明
35.图1为实施例2中在烟草叶片上瞬时表达plavh23后引起烟草叶片过敏性坏死的照片图。
36.图2为实施例2中在烟草叶片上瞬时表达plavh23后促进烟草叶片活性氧产生和胼胝质积累的照片图。
37.图3为实施例2中在烟草叶片上注射表达plavh23效应蛋白0h、12h及24h后诱导植
物防卫相关基因(nbpr1、nbpr2、nblox、nberf1)的表达情况图。
38.图4为实施例2中在烟草叶片上瞬时表达plavh23后诱导烟草对辣椒疫霉抗性反应的结果图。
39.图5为实施例3中利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达，筛选获得plavh23诱导坏死反应的最短片段plavh23
63-331
。
具体实施方式
40.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
41.本发明实施例中涉及的荔枝霜疫霉(peronophythora litchii chen ex ko et al.)和辣椒疫霉(phytophthora capsici)为常规植物病原卵菌，可通过商业途径或自然界分离获得。
42.本发明实施例中涉及的表达载体、大肠杆菌jm109感受态细胞和农杆菌gv3101可以通过常规市售获得。
43.实施例1：编码基因的克隆及表达载体构建
44.一、plavh23编码基因的克隆
45.根据all-in-one dna/rna/protein mini
–
preps kit(生工bbi)操作说明提取荔枝霜疫霉总mrna并用primescript
tm rt reagent kit with gdna eraser(takara)反转录成cdna，以cdna为模板，pcr扩增去除信号肽后的plavh23编码基因(蛋白序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示)。其中，pcr扩增引物序列如下：
46.上游引物pvx-plavh23-f：
[0047]5’‑
cagctagcatcgattcccgggatcgactcgaagatcgctgt-3’；
[0048]
下游引物pvx-plavh23-r：
[0049]5’‑
aatctctagaggatccccgggctacgagcgtctaggggcta-3’。
[0050]
pcr扩增反应体系(50μl)：2
×
phanta max buffer 25μl，dntp mix(10mm each)1μl，上游引物(10μm)2μl，下游引物(10μm)2μl，phanta max super-fidelity dna polymerase 1μl，模板cdna 50～100ng，加水至50μl；
[0051]
pcr扩增程序：预变性95℃，3min；变性95℃，15s，退火58℃，15s，延伸72℃，60s，进行30个循环，72℃延伸5min。用琼脂糖凝胶电泳及goldenview染色检测所得条带是否为目的条带，并根据gel extraction kit(omega)操作说明进行切胶回收。
[0052]
plavh23基因全长蛋白序列(seq id no.1)：
[0053]
mrslrfvlvvaailfvgattsvaidskiavpdfrpftteqnsastkrllraqvaskendderafpgldkitaplkasaskmaesvklniwlgkgksasdvlaklklnegvdrtlaspklnildnyvdmlnkkhperqvsllgtlttsydevalakafvlakrhehskdiatklqtqqlegwlnsqksvddvfnllkikddgvlsmisrkletmeeyiklfnaknprhetnlfralrngfgedqfalmvsramdnpytsvaaskyqnelfkrwikedydpmsvlievfkvdnrnlaaasareksiiaaykpiyyrakrlnqvgnvvaprrs；
[0054]
plavh23基因全长核苷酸序列(seq id no.2)：
[0055]
atgcgatcactccgtttcgtgctagtagttgccgccattctgttcgtaggtgctactacctcagtggccatcgactcgaagatcgctgtacccgacttccgtccgttcactactgagcaaaacagtgcttctaccaagaggttgttaagggctcaagtcgcgtcaaaagaaaatgacgatgagagggcgtttcctggtttggacaagatcacagccccattgaaagcaagcgcatcgaagatggctgagtctgtgaagttgaacatttggctggggaagggaaaatccgcgtccgatgttctggctaagctgaagcttaatgaaggagtggacaggactcttgctagtccaaaactgaatatcctagacaactacgtggacatgttgaacaaaaagcaccctgaaaggcaagtgtcgttgctcgggacgctcacgacaagttacgatgaagttgctctggcaaaggcgttcgtgctagcaaaacggcacgaacattccaaagacatcgcgacgaagttgcagacgcagcagttggagggatggttaaacagccagaagtctgttgacgatgtctttaacctactcaagatcaaggatgatggcgtcctatccatgataagccggaaactggagacgatggaagagtacattaagctgttcaacgcaaagaacccccgtcatgaaacaaatttgttcagagctttaaggaacgggtttggtgaagatcagttcgctctcatggtttcgagggcaatggataatccatatacgtctgtagcagcctcgaaataccaaaatgagctgtttaagcgatggatcaaggaagactacgacccaatgagtgttctcatcgaggtgttcaaggttgataaccgcaatttggctgctgctagtgctcgggaaaagtccattatagccgcgtacaaaccaatctactaccgggcaaagagactcaatcaagtgggtaacgtcgtagcccctagacgctcgtag。
[0056]
二、表达载体构建
[0057]
根据clonexpressii one step cloning kit(vazyme)操作说明，将回收后的plavh23与pvx酶切载体(又名pgr107，genbank:ay297843.1)连接(连接位点：smaⅰ)，转入大肠杆菌感受态jm109中，在lb平板(含卡那霉素(kanamycin)50μg/ml)上，37℃培养12～16h后用green tag mix(vazyme)进行菌落pcr验证，按照质粒提取试剂盒(aidlab)操作说明提取质粒，送广州生工公司测序，获得重组质粒pvx：：plavh23-ha。
[0058]
实施例2：在烟草叶片上瞬时表达plavh23诱导植物防卫反应的产生
[0059]
(1)农杆菌的培养
[0060]
将pvx：：plavh23-ha质粒转入农杆菌gv3101中，涂于lb(含kanamycin 50μg/ml)平板上，28℃培养2～3d后，用green tag mix(vazyme)进行菌落pcr验证，挑取正确克隆进行后续实验。
[0061]
另外获取阴性克隆—转染了pvx::gfp-ha质粒(pvx::gfp-ha质粒的构建方法参考实施例1，将如seq id no.3所示的rfp基因序列构建到pvx载体上，酶切位点同上)的农杆菌gv3101单菌落，以及阳性克隆—转染了inf1质粒(genbank:ay830094.1)的农杆菌gv3101单菌落。
[0062]
rfp碱基序列(seq id no.3)：
[0063]
atggcctcctccgaggacgtcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttccagtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagatgaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgccgaggtcaagaccacctacatggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaagaccgacatcaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgcgccgagggccgccactccaccggcgcct
aa。
[0064]
分别将含有pvx：：plavh23-ha重组质粒、阴性克隆、阳性克隆的gv3101菌株于2ml lb(含50μg/ml kanamycin和50μg/ml利福平(rifampicin，rif)中，28℃、180r
·
min-1
培养2d。4000r
·
min-1
离心4min收集菌体后，用mgcl2缓冲液重悬，再次以4000r
·
min-1
离心4min收集菌体，重复3次，调整菌液od600为0.4～0.6。
[0065]
(2)烟草叶片瞬时表达plavh23
[0066]
将上述配制好的农杆菌菌液分别用1ml去针头注射器注射到5～8周龄本氏烟草苗叶片背面，叶片选从顶部数第3～5片，注射后的烟草于温室(22℃，16h光照/8h黑暗)培养。三次重复。
[0067]
(3)过敏性坏死反应的检测
[0068]
农杆菌注射表达5天后，观察烟草叶片的坏死情况，待出现明显表型后，采集叶片进行拍照。
[0069]
(4)活性氧与胼胝质积累的检测
[0070]
活性氧积累检测：将待检测的本氏烟草叶片按照叶背向下的方式浸泡于新鲜配制的dab(1mg/ml二氨基联苯胺(3,3
’‑
diaminobenzidine)，调ph值至3.8)染液中，26℃，黑暗静置8～12h。再将叶片取出再浸泡到无水乙醇中煮沸10min脱色，取出压干后即可观察拍照。
[0071]
胼胝质积累检测：将待检测的本氏烟草叶片按照叶背向下的方式浸泡于新鲜配制的苯胺蓝染液(0.1mg/ml苯胺蓝，0.1m nah2po4，调ph值至9)中，黑暗静置1～2h，即可在显微镜下观察拍照。
[0072]
(5)诱导防卫相关基因表达的检测
[0073]
农杆菌注射本氏烟草叶片后，收取注射0h、12h及24h的样品，根据all-in-one dna/rna/protein mini
–
preps kit(生工bbi)操作说明提取rna，并用primescript
tm rt reagent kit with gdna eraser(takara)反转录生成cdna，取适量的反转录产物利用rt-qpcr检测防卫相关基因(nbpr1、nbpr2、nblox、nberf1)表达情况。其中，实时定量pcr引物序列如下：
[0074]
nbpr1定量上游引物f：5
’‑
ccgccttccctcaactcaac-3’；
[0075]
nbpr1定量下游引物r：5
’‑
gcacaaccaagacgtactgag-3’；
[0076]
nbpr2定量上游引物f：5
’‑
catcacagggttcgtttagga-3’；
[0077]
nbpr2定量下游引物r：5
’‑
gggttcttgttgttctcatca-3’；
[0078]
nblox定量上游引物f：5
’‑
ccttaagaggagatggaact-3’；
[0079]
nblox定量下游引物r：5
’‑
tctaagctcataagcaatgg-3’；
[0080]
nberf1定量上游引物f：5
’‑
ggcgaattttccgggagact-3’；
[0081]
nberf1定量下游引物r：5
’‑
ggctccgattttacttcgcc-3’。
[0082]
实时定量pcr反应：
[0083]
pcr反应体系(20μl)：sybr premix ex taq ii(takara)10μl，cdna20ng,前后引物各0.8μl，加ddh2o至20μl。反应程序：i：95℃30s；ii：95℃30s，60℃30s；程序ii 40个循环。溶解曲线分析程序是：95℃15s，60℃1min，95℃15s。
[0084]
(6)plavh23对辣椒疫霉抗性的诱导
[0085]
分别将含有pvx：：plavh23-ha重组质粒、阴性克隆pvx::gfp-ha的gv3101菌株于2ml lb(含50μg/ml kanamycin和50μg/ml rif)中，28℃、180r
·
min-1
培养2d。4000r
·
min-1
离心4min收集菌体后，用mgcl2缓冲液重悬，再次以4000r
·
min-1
离心4min收集菌体，重复3次，调整菌液od600为0.1。将配制好的农杆菌菌液用1ml去针头注射器注射到5～8周龄本氏烟草苗叶片背面，同一片叶片左半侧注射含有pvx：：plavh23-ha重组质粒的农杆菌，右半侧注射pvx::gfp-ha为对照，注射后的烟草于温室(22℃，16h光照/8h黑暗)培养，24h后将注射烟草叶片剪下，置于湿润的滤纸中进行保湿。用灭菌的5mm打孔器在辣椒疫霉菌落边缘打取菌龄一致的菌饼，在叶背面左右两侧分别接种一块菌饼，重复20次。于25℃保湿放置，48h后拍照并测量左右两侧病斑直径。
[0086]
(7)结果：
[0087]
结果如图1～4所示：从图1可以看出，与对照(阴性克隆)相比，注射了含有pvx::plavh23-ha质粒农杆菌的烟草叶片，培养5天后，出现明显的过敏性坏死反应；从图2可以看出，plavh23能促进烟草活性氧产生和胼胝质积累；从图3可以看出，plavh23在表达24h时，水杨酸、茉莉酸及乙烯通路上的marker基因均表达上调；从图4可以看出，辣椒疫霉在表达plavh23的本氏烟草叶片中，侵染面积较对照显著减小，表明plavh23的表达诱导本氏烟草对辣椒疫霉的抗性。说明plavh23在烟草叶片中瞬时表达后，能够诱导植物防卫反应和抗性的产生。
[0088]
实施例3plavh23
63-331
诱导植物防卫反应的产生
[0089]
(1)缺失突变体片段的克隆
[0090]
以plavh23(seq id no.2)全长为模板，分别扩增plavh23
24-331
、plavh23
24-62
、plavh23
63-331
、plavh23
24-65，134-331
，plavh23
24-132，225-331
，plavh23
24-224、292-331
序列。
[0091]
pcr扩增引物序列如下：
[0092]
plavh23
24-331
上游引物f：
[0093]5’‑
agaggatccgtcgaccccgggatcgactcgaagatcgctgt-3’；
[0094]
plavh23
24-331
下游引物r：
[0095]5’‑
ctgtacaagggtacccccgggctacgagcgtctaggggcta-3’；
[0096]
plavh23
24-62
上游引物f：
[0097]5’‑
agaggatccgtcgaccccgggatcgactcgaagatcgctgt-3’；
[0098]
plavh23
24-62
下游引物r：
[0099]5’‑
ctgtacaagggtacccccgggctacctctcatcgtcatttt-3’；
[0100]
plavh23
63-331
上游引物f：
[0101]5’‑
agaggatccgtcgaccccgggatggcgtttcctggtttgga-3’；
[0102]
plavh23
63-331
下游引物r：
[0103]5’‑
ctgtacaagggtacccccgggctacgagcgtctaggggcta-3’；
[0104]
plavh23
24-65，134-331
片段1上游引物f：
[0105]5’‑
agaggatccgtcgaccccgggatcgactcgaagatcgctgt-3’；
[0106]
plavh23
24-65，134-331
片段1下游引物r：
[0107]5’‑
aacgacacttgcctttcagggctgtgatcttgtccaaacc-3’；
[0108]
plavh23
24-65，134-331
片段2上游引物f：
[0109]5’‑
ggtttggacaagatcacagccctgaaaggcaagtgtcgtt-3’；
[0110]
plavh23
24-65，134-331
片段2下游引物r：
[0111]5’‑
ctgtacaagggtacccccgggctacgagcgtctaggggcta-3’；
[0112]
plavh23
24-132，225-331
片段1上游引物f：
[0113]5’‑
agaggatccgtcgaccccgggatcgactcgaagatcgctgt-3’；
[0114]
plavh23
24-132，225-331
片段1下游引物r：
[0115]5’‑
aaatttgtttcatgacggggctttttgttcaacatgtcca-3’；
[0116]
plavh23
24-132，225-331
片段2上游引物f：
[0117]5’‑
tggacatgttgaacaaaaagccccgtcatgaaacaaattt-3’；
[0118]
plavh23
24-132，225-331
片段2下游引物r：
[0119]5’‑
ctgtacaagggtacccccgggctacgagcgtctaggggcta-3’；
[0120]
plavh23
24-224、292-331
片段1上游引物f：
[0121]5’‑
agaggatccgtcgaccccgggatcgactcgaagatcgctgt-3’；
[0122]
plavh23
24-224、292-331
片段1下游引物r：
[0123]5’‑
ctagcagcagccaaattgcggttctttgcgttgaacagct-3’；
[0124]
plavh23
24-224、292-331
片段2上游引物f：
[0125]5’‑
agctgttcaacgcaaagaac cgcaatttggctgctgctag-3’[0126]
plavh23
24-224、292-331
片段2下游引物r：
[0127]5’‑
ctgtacaagggtacccccgggctacgagcgtctaggggcta-3’；
[0128]
pcr扩增50μl反应体系：2
×
phanta max buffer 25μl，dntp mix(10mm each)1μl，上游引物(10μm)2μl，下游引物(10μm)2μl，phanta max super-fidelity dna polymerase 1μl，模板cdna 50～100ng，加水至50μl。pcr扩增程序：预变性95℃，3min，变性95℃，15s，退火58℃，15s，延伸72℃，60s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。用琼脂糖凝胶电泳及goldenview染色检测所得条带是否为目的条带，并根据gel extraction kit(omega)操作说明进行切胶回收。
[0129]
根据clonexpressii one step cloning kit(vazyme)操作说明，将回收后的产物与pbin-gfp(pbin-gfp载体可通过常规市购获得)酶切载体连接(连接位点：smaⅰ)，分别转入大肠杆菌感受态jm109中，在lb平板(含kanamycin 50μg/ml)上，37℃培养12～16h后用green tag mix(vazyme)进行菌落pcr验证，按照质粒提取试剂盒(aidlab)操作说明提取质粒，送广州生工公司测序，得到5个重组质粒，分别命名为：pbin-gfp：：plavh23
24-331-gfp(plavh23)、pbin-gfp：：plavh23
24-62-gfp(m1)、pbin-gfp：：plavh23
63-331-gfp(m2)、pbin-gfp：：plavh23
24-65，134-331-gfp(m3)，pbin-gfp::plavh23
24-132，225-331-gfp(m4)，pbin-gfp::plavh23
24-224、292-331-gfp(m5)重组质粒。
[0130]
(2)农杆菌的培养
[0131]
将重组质粒分别转入农杆菌gv3101中，涂于lb(含kanamycin 50μg/ml)平板上，28℃培养2～3d后，用green tag mix(vazyme)进行菌落pcr验证，挑取正确克隆进行后续实验。
[0132]
分别将上述正确克隆在2ml含50μg/ml kanamycin和50μg/ml rif的lb液体培养基中28℃、180r
·
min-1
培养2d。4000r
·
min-1
离心4min收集菌体，用mgcl2缓冲液进行重悬浮，
再次以4000r
·
min-1
离心4min收集菌体，重复3次，将od600调至0.4～0.6。
[0133]
(3)烟草叶片瞬时表达plavh23突变体
[0134]
将上述配制好的农杆菌菌液用1ml去针头的注射器分别注射到5～8周龄本氏烟草苗叶片背面，叶片选从顶部数第3～5片，注射后的烟草于温室(22℃，16h光照/8h黑暗)培养。
[0135]
(4)过敏性坏死反应的检测
[0136]
农杆菌注射表达5天后，观察烟草叶片的坏死情况，待出现明显表型后，采集叶片进行拍照。
[0137]
结果：只有表达保留完整wyl结构域(wyl-domain)的突变体，即plavh23
24-331
(plavh23)和plavh23
63-331
(m2)，能够诱导植物防卫反应的产生，结果如图5所示。
[0138]
plavh23
24-331
(plavh23)蛋白序列(seq id no.4)：
[0139]
idskiavpdfrpftteqnsastkrllraqvaskendderafpgldkitaplkasaskmaesvklniwlgkgksasdvlaklklnegvdrtlaspklnildnyvdmlnkkhperqvsllgtlttsydevalakafvlakrhehskdiatklqtqqlegwlnsqksvddvfnllkikddgvlsmisrkletmeeyiklfnaknprhetnlfralrngfgedqfalmvsramdnpytsvaaskyqnelfkrwikedydpmsvlievfkvdnrnlaaasareksiiaaykpiyyrakrlnqvgnvvaprrs；
[0140]
plavh23
24-331
(plavh23)核苷酸序列(seq id no.5)：
[0141]
atcgactcgaagatcgctgtacccgacttccgtccgttcactactgagcaaaacagtgcttctaccaagaggttgttaagggctcaagtcgcgtcaaaagaaaatgacgatgagagggcgtttcctggtttggacaagatcacagccccattgaaagcaagcgcatcgaagatggctgagtctgtgaagttgaacatttggctggggaagggaaaatccgcgtccgatgttctggctaagctgaagcttaatgaaggagtggacaggactcttgctagtccaaaactgaatatcctagacaactacgtggacatgttgaacaaaaagcaccctgaaaggcaagtgtcgttgctcgggacgctcacgacaagttacgatgaagttgctctggcaaaggcgttcgtgctagcaaaacggcacgaacattccaaagacatcgcgacgaagttgcagacgcagcagttggagggatggttaaacagccagaagtctgttgacgatgtctttaacctactcaagatcaaggatgatggcgtcctatccatgataagccggaaactggagacgatggaagagtacattaagctgttcaacgcaaagaacccccgtcatgaaacaaatttgttcagagctttaaggaacgggtttggtgaagatcagttcgctctcatggtttcgagggcaatggataatccatatacgtctgtagcagcctcgaaataccaaaatgagctgtttaagcgatggatcaaggaagactacgacccaatgagtgttctcatcgaggtgttcaaggttgataaccgcaatttggctgctgctagtgctcgggaaaagtccattatagccgcgtacaaaccaatctactaccgggcaaagagactcaatcaagtgggtaacgtcgtagcccctagacgctcgtag；
[0142]
plavh23
63-331
蛋白序列(seq id no.6)：
[0143]
afpgldkitaplkasaskmaesvklniwlgkgksasdvlaklklnegvdrtlaspklnildnyvdmlnkkhperqvsllgtlttsydevalakafvlakrhehskdiatklqtqqlegwlnsqksvddvfnllkikddgvlsmisrkletmeeyiklfnaknprhetnlfralrngfgedqfalmvsramdnpytsvaaskyqnelfkrwikedydpmsvlievfkvdnrnlaaasareksiiaaykpiyyrakrlnqvgnvvaprrs；
[0144]
plavh23
63-331
核苷酸序列(seq id no.7)：
[0145]
gcgtttcctggtttggacaagatcacagccccattgaaagcaagcgcatcgaagatggctgagtctgtgaagttgaacatttggctggggaagggaaaatccgcgtccgatgttctggctaagctgaagcttaatgaaggagtggacaggactcttgctagtccaaaactgaatatcctagacaactacgtggacatgttgaacaaaaagcaccctgaaa
ggcaagtgtcgttgctcgggacgctcacgacaagttacgatgaagttgctctggcaaaggcgttcgtgctagcaaaacggcacgaacattccaaagacatcgcgacgaagttgcagacgcagcagttggagggatggttaaacagccagaagtctgttgacgatgtctttaacctactcaagatcaaggatgatggcgtcctatccatgataagccggaaactggagacgatggaagagtacattaagctgttcaacgcaaagaacccccgtcatgaaacaaatttgttcagagctttaaggaacgggtttggtgaagatcagttcgctctcatggtttcgagggcaatggataatccatatacgtctgtagcagcctcgaaataccaaaatgagctgtttaagcgatggatcaaggaagactacgacccaatgagtgttctcatcgaggtgttcaaggttgataaccgcaatttggctgctgctagtgctcgggaaaagtccattatagccgcgtacaaaccaatctactaccgggcaaagagactcaatcaagtgggtaacgtcgtagcccctagacgctcgtag。
[0146]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。