一种基于脂质体递送mrna的免疫细胞培养及特异性负载激活方法
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种基于脂质体递送细胞因子mrna的免疫细胞培养方法，以及一种基于脂质体递送多元组合串联肿瘤抗原mrna的免疫细胞特异性负载激活方法。
2.
背景技术：
3.人体的免疫细胞能够清除感染、凋亡、衰老、病变乃至癌变的异常细胞，守护着人体的健康。在肿瘤患者体内，和肿瘤细胞正面交锋的免疫细胞就数杀伤性t淋巴细胞。交锋的关键在于肿瘤基因突变被抗原呈递细胞识别为新抗原，新抗原成功激发肿瘤特异性的杀伤性cd8 t细胞。当机体免疫力正常，这一过程通常可以在发展到临床症状之前实现肿瘤细胞的免疫清除，但是因为免疫逃逸也会存在无法有效激活cd8
t细胞的情况。因此在体外培养免疫细胞，经过培养扩增、抗原激活、回输进行过继细胞治疗成为一种治疗肿瘤的有效手段。免疫细胞的培养扩增需要添加血清或细胞因子，例如培养t淋巴细胞时需要加入il2和il15细胞因子，培养巨噬细胞或树突细胞（dc cell）加入gm-csf和il4细胞因子，并用肿瘤抗原进行特异性负载激活。但是当下血清和细胞因子的提取工艺复杂，成本高昂，且不利于实验的重复性、批次间生产的稳定性。特别是某些细胞因子的蛋白溶解性差或蛋白不稳定、需要翻译后修饰，生产工艺、提取工艺和保存工艺需要个性化摸索。
4.使用细胞因子的mrna能够减少生产环节、省去复杂的差异化的蛋白生产提取工艺，更易于批量生产，更易于做质量控制，且成本更低、使用更方便。例如对于肿瘤浸润淋巴细胞的体外培养，需要高达6000iu/ml的细胞因子使用量，而使用微量的rna即可以使得细胞持续产生细胞因子。但是rna的一个致命缺点是容易降解，储藏条件较为苛刻。随着各种临床应用级脂质体的出现，使用按照一定比例配制的脂质体，可以将mrna包裹在脂质体中受到保护，并能够有效递送到细胞释放有效成分，实现对免疫细胞进行体外高效培养激活扩增。
5.
技术实现要素：
6.本发明提供一种基于脂质体递送mrna的免疫细胞培养及特异性负载激活方法，旨在解决现有技术存在的问题。
7.本发明是这样实现的，一种基于脂质体递送细胞因子mrna的免疫细胞培养方法，包括以下步骤：s1、设计细胞因子dna模板，合成基因构建于pires2-egfp载体，用于模板扩增和保存；s2、体外转录生产mrna；
s3、配制脂质体，进行mrna包装并生成脂质体颗粒；s4、将步骤s3获得的脂质体添加到免疫细胞；s5、进行基于脂质体递送细胞因子mrna的免疫细胞体外培养。
8.本发明还提供一种基于脂质体递送肿瘤抗原mrna的免疫细胞特异性负载激活方法，包括：将多元组合串联肿瘤抗原负载免疫细胞或dc细胞，对免疫细胞进行肿瘤抗原靶向性激活；s1、设计多元组合串联肿瘤抗原dna模板，合成基因构建于pires2-egfp载体，用于模板扩增和保存；s2、体外转录生产mrna；s3、配制脂质体，进行mrna包装并生成脂质体颗粒；s4、将步骤s3获得的脂质体添加到免疫细胞；s5、进行基于脂质体递送肿瘤抗原mrna的免疫细胞特异性负载激活。
9.优选的，所述构设计细胞因子dna模板，具体包括：对目标细胞因子进行全基因合成设计，合成序列包括t7启动子序列、通用5’utr序列、细胞因子编码区orf序列、通用5’utr序列、100bp的聚合腺嘌呤序列：t7启动子序列：taatacgactcactataggg；通用5’utr序列：agaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccacc；通用3’utr序列：taagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggc；poly（a）序列：aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。
10.优选的，所述体外转录生产mrna，具体包括：使用t7 rna聚合酶体外转录生成mrna，在转录体系中同时加入arca【3
′‑
o-me-m7g(5
′
)ppp(5
′
)g】用于产生帽子结构；mrna产物最终溶解在10mm柠檬酸盐/150mmnacl中，ph值为4.5。
11.优选的，所述配制脂质体，进行mrna包装并生成脂质体颗粒，具体包括：把脂质体原材料dotap（一种阳离子脂质）、dope（一种pe类助脂质）、胆固醇、peg脂质溶解在乙醇中，根据摩尔比5：3.75：3.75：0.65进行混合；上述mrna产物和脂质体混合物再以4：1的体积比，以脂质体快速注射到mrna溶液的方式进行混合形成包埋目标mrna的脂质体，mrna终浓度0.2 mg/ml，无菌过滤后溶解在pbs溶液中待用。
12.优选的，将脂质体与60 mg/ml 的d
ꢀ‑
蔗糖混合进行冻干，然后在
−
80
ꢁ°
c条件下保存。
13.优选的，所述将步骤s3获得的脂质体添加到免疫细胞，具体包括：将分离的免疫细胞接种在细胞培养皿，加入rpmi1640培养基或x-vivo 15培养基；上述mnra脂质体以每106细胞加入3
µ
g mrna的比例加入培养基；对于肿瘤浸润淋
巴细胞，将il2 mnra脂质体以每106细胞加入3
µ
g mrna的比例加入培养基，培养5天后更换一半培养基并加入1.5
µ
g mrna，随后每2-3天进行细胞传代培养，培养14-21天后细胞数量达到10
10
级后收集细胞。
14.优选的，所述rpmi1640培养基或x-vivo 15培养基的成分包括10%人ab型血清、2
ꢁ
mmol谷氨酰胺、25
ꢁ
mmhepes、10μg/ml庆大霉素。
15.优选的，所述进行基于脂质体递送肿瘤抗原mrna的dc细胞培养，具体包括：在dc细胞的体外培养过程中，加入gm-csf/il4细胞因子和tlr配体复合物刺激未分化的dc细胞；对未分化的dc细胞进行串联肿瘤抗原特异性负载，串联肿瘤抗原的基因合成序列如下：将信号肽片段（mrvtaprtlilllsgalaltetwags）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原afp片段（gvalqtmkq）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原afp片段（llnqhacav）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原ny-eso-1片段（sllmwitqc）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原gp100片段（ylepgpvta）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原melan-a片段（eaagigiltv）、连接子（ggslggggsg）、mitd结构域（ivgivaglavlavvvigavvatvmcrrkssggkggsysqaassdsaqgsdvslta）按照顺序拼接，使用peptide2.0软件翻译成核苷酸编码序列，基因合成；并按照上述步骤包装成肿瘤抗原脂质体颗粒；同时选取hla-a*0201型dc细胞，体外培养7天后加入脂质体，再次培养2-3天后收获肿瘤抗原刺激的成熟dc细胞。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的一种基于脂质体递送mrna的免疫细胞培养及特异性负载激活方法，mrna形态的细胞因子能够有效扩增体外培养免疫细胞，mrna形态的多元组合串联肿瘤抗原能够个性化特异性负载有效激活免疫细胞，解决过继细胞治疗体外免疫细胞培养所需要的细胞量大、体外细胞培养扩增困难、细胞因子成本高、靶向特异性差的难题。
附图说明
17.图1为本发明的产生细胞因子mrna的dna模板的示意图。
18.具体实施方式
19.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
20.本发明提供一种技术方案：一种基于脂质体递送细胞因子mrna的免疫细胞培养方法，包括以下步骤：s1、设计细胞因子dna模板，合成基因构建于pires2-egfp载体，请参阅图1，用于模板扩增和保存：对目标细胞因子进行全基因合成设计，合成序列包括t7启动子序列、通用5’utr序列、细胞因子编码区orf序列、通用5’utr序列、100bp的聚合腺嘌呤序列：
t7启动子序列：taatacgactcactataggg；通用5’utr序列：agaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccacc；通用3’utr序列：taagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggc；poly（a）序列：aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。
21.s2、体外转录生产mrna：使用t7 rna聚合酶体外转录生成mrna，在转录体系中同时加入arca【3
′‑
o-me-m7g(5
′
)ppp(5
′
)g】用于产生帽子结构。
22.mrna产物最终溶解在10mm柠檬酸盐/150mmnacl中，ph值为4.5。注意通过该技术方法生成的mrna不需要进行poly(a)聚合酶进行加尾的实验步骤，且保证了所有的mnra均具有相同长度的poly(a)，便于后续mrna的均一性质量控制。另外根据需求决定是否掺入修饰碱基假尿苷和/或5甲基胞嘧啶。
23.s3、配制脂质体，进行mrna包装并生成脂质体颗粒：把脂质体原材料dotap（一种阳离子脂质）、dope（一种pe类助脂质）、胆固醇、peg脂质溶解在乙醇中，根据摩尔比5：3.75：3.75：0.65进行混合。脂质体原材料可为阳离子或可离子化脂质。磷脂可为pc或pe类助脂质。peg脂质为c
122o49
nh
247
。
24.上述mrna产物和脂质体混合物再以4：1的体积比，以脂质体快速注射到mrna溶液的方式进行混合形成包埋目标mrna的脂质体，mrna终浓度0.2 mg/ml，无菌过滤后溶解在pbs溶液中待用。
25.需要长期保存的可以将脂质体与60mg/ml的d-蔗糖混合进行冻干，然后在
−
80
ꢁ°
c条件下保存。
26.s4、将步骤s3获得的脂质体添加到免疫细胞：将分离的免疫细胞接种在细胞培养皿，加入rpmi1640培养基（不用使用无血清培养基，10% 人ab型血清、 2
ꢁ
mmol谷氨酰胺、25
ꢁ
mm hepes、10 μg/ml庆大霉素）。在其它实施方式中，可以采用x-vivo 15培养基，并且x-vivo 15培养基成分包括10%人ab型血清、2
ꢁ
mmol谷氨酰胺、25
ꢁ
mmhepes、10μg/ml庆大霉素。
27.上述mnra脂质体以每106细胞加入3
µ
g mrna的比例加入培养基；对于肿瘤浸润淋巴细胞，将il2 mnra脂质体以每106细胞加入3
µ
g mrna的比例加入培养基，培养5天后更换一半培养基并加入1.5
µ
g mrna，随后每2-3天进行细胞传代培养，培养14-21天后细胞数量达到10
10
级后收集细胞。
28.其中，免疫细胞从外周血或肿瘤组织中分离获得。
29.s5、进行基于脂质体递送肿瘤抗原mrna的dc细胞培养：在dc细胞的体外培养过程中，加入gm-csf/il4细胞因子和tlr配体复合物刺激未分化的dc细胞。
30.我们尝试进一步负载肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen）、或肿瘤特异性
新抗原（tumor-specific neoantigen），以获得更具靶向性的dc细胞。我们同样采用脂质体包埋mrna的方式递送到免疫细胞即负载dc细胞，不同的是该mrna编码不是细胞因子，而是多元组合的串联肿瘤抗原（tandem tumor antigen）。
31.对未分化的dc细胞进行串联肿瘤抗原特异性负载，串联肿瘤抗原的基因合成序列如下：将信号肽片段（mrvtaprtlilllsgalaltetwags）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原afp片段（gvalqtmkq）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原afp片段（llnqhacav）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原ny-eso-1片段（sllmwitqc）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原gp100片段（ylepgpvta）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原melan-a片段（eaagigiltv）、连接子（ggslggggsg）、mitd结构域（ivgivaglavlavvvigavvatvmcrrkssggkggsysqaassdsaqgsdvslta）按照顺序拼接，使用peptide2.0软件翻译成核苷酸编码序列，基因合成，并按照上述步骤包装成肿瘤抗原脂质体颗粒。
32.同时选取hla-a*0201型dc细胞，体外培养7天后加入脂质体，再次培养2-3天后收获肿瘤抗原刺激的成熟dc细胞。需要补充的是，在具体的实施例中，我们对il2、il4、il15、gm-csf四种细胞因子和一种串联肿瘤抗原进行了实施，其细胞因子编码区orf序列和肿瘤抗原orf序列如下：il2（748bp）：taatacgactcactatagggagaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccaccatgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagtgcacctacttcaagttctacaaagaaaacacagctacaactggagcatttactgctggatttacagatgattttgaatggaattaataattacaagaatcccaaactcaccaggatgctcacatttaagttttacatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgtctagaagaagaactcaaacctctggaggaagtgctaaatttagctcaaagcaaaaactttcacttaagacccagggacttaatcagcaatatcaacgtaatagttctggaactaaagggatctgaaacaacattcatgtgtgaatatgctgatgagacagcaaccattgtagaatttctgaacagatggattaccttttgtcaaagcatcatctcaacactgacttgataagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaail4（748bp）：taatacgactcactatagggagaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccaccatgggtctcacctcccaactgcttccccctctgttcttcctgctagcatgtgccggcaactttgtccacggacacaagtgcgatatcaccttacaggagatcatcaaaactttgaacagcctcacagagcagaagactctgtgcaccgagttgaccgtaacagacatctttgctgcctccaagaacacaactgagaaggaaaccttctgcagggctgcgactgtgctccggcagttctacagccaccatgagaaggacactcgctgcctgggtgcgactgcacagcagttccacaggcacaagcagctgatccgattcctgaaacggctcgacaggaacctctggggcctggcgggcttgaattcctgtcctgtgaaggaagccaaccagagtacgttggaaaacttcttggaaaggctaaagacgatcatgagagagaaatattcaaagtgttcgagctgataagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaail15（775bp）
taatacgactcactatagggagaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccaccatgagaatttcgaaaccacatttgagaagtatttccatccagtgctacttgtgtttacttctaaacagtcattttctaactgaagctggcattcatgtcttcattttgggctgtttcagtgcagggcttcctaaaacagaagccaactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacaacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttcttgataagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagm-csf（721bp）：taatacgactcactatagggagaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccaccatgtggctgcagagcctgctgctcttgggcactgtggcctgcagcatctctgcacccgcccgctcgcccagccccagcacgcagccctgggagcatgtgaatgccatccaggaggcccggcgtctcctgaacctgagtagagacactgctgctgagatgaatgaaacagtagaagtcatctcagaaatgtttgacctccaggagccgacctgcctacagacccgcctggagctgtacaagcagggcctgcggggcagcctcaccaagctcaagggccccttgaccatgatggccagccactacaagcagcactgccctccaaccccggaaacttcctgtgcaacccagattatcacctttgaaagtttcaaagagaacctgaaggactttctgcttgtcatcccctttgactgctgggagccagtccaggagtgataagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa串联肿瘤抗原（850bp）taatacgactcactatagggagaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccaccatgcgggtgaccgccccccggaccctgatcctgctgctgtccggcgccctggccctgaccgagacctgggccggctccggcggctccggcggcggcggctccggcggcggcgtggccctgcagaccatgaagcagggcggctccggcggcggcggctccggcggcctgctgaaccagcacgcctgcgccgtgggcggctccggcggcggcggctccggcggctccctgctgatgtggatcacccagtgcggcggctccggcggcggcggctccggcggctacctggagcccggccccgtgaccgccggcggctccggcggcggcggctccggcggcgaggccgccggcatcggcatcctgaccgtgggcggctccctgggcggcggcggctccggcatcgtgggcatcgtggccggcctggccgtgctggccgtggtggtgatcggcgccgtggtggccaccgtgatgtgccggcggaagtcctccggcggcaagggcggctcctactcccaggccgcctcctccgactccgcccagggctccgacgtgtccctgaccgcctgataagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa本发明的一种基于脂质体递送mrna的免疫细胞培养及特异性负载激活方法，mrna形态的细胞因子能够有效扩增体外培养免疫细胞，mrna形态的多元组合串联肿瘤抗原能够特异性负载有效激活免疫细胞，解决过继细胞治疗体外免疫细胞培养所需要的细胞量大、体外细胞培养扩增困难、细胞因子成本高、靶向特异性差的难题。
33.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种基于脂质体递送细胞因子mrna的免疫细胞培养方法，以及一种基于脂质体递送多元组合串联肿瘤抗原mrna的免疫细胞特异性负载激活方法。
2.
背景技术：
3.人体的免疫细胞能够清除感染、凋亡、衰老、病变乃至癌变的异常细胞，守护着人体的健康。在肿瘤患者体内，和肿瘤细胞正面交锋的免疫细胞就数杀伤性t淋巴细胞。交锋的关键在于肿瘤基因突变被抗原呈递细胞识别为新抗原，新抗原成功激发肿瘤特异性的杀伤性cd8 t细胞。当机体免疫力正常，这一过程通常可以在发展到临床症状之前实现肿瘤细胞的免疫清除，但是因为免疫逃逸也会存在无法有效激活cd8
t细胞的情况。因此在体外培养免疫细胞，经过培养扩增、抗原激活、回输进行过继细胞治疗成为一种治疗肿瘤的有效手段。免疫细胞的培养扩增需要添加血清或细胞因子，例如培养t淋巴细胞时需要加入il2和il15细胞因子，培养巨噬细胞或树突细胞（dc cell）加入gm-csf和il4细胞因子，并用肿瘤抗原进行特异性负载激活。但是当下血清和细胞因子的提取工艺复杂，成本高昂，且不利于实验的重复性、批次间生产的稳定性。特别是某些细胞因子的蛋白溶解性差或蛋白不稳定、需要翻译后修饰，生产工艺、提取工艺和保存工艺需要个性化摸索。
4.使用细胞因子的mrna能够减少生产环节、省去复杂的差异化的蛋白生产提取工艺，更易于批量生产，更易于做质量控制，且成本更低、使用更方便。例如对于肿瘤浸润淋巴细胞的体外培养，需要高达6000iu/ml的细胞因子使用量，而使用微量的rna即可以使得细胞持续产生细胞因子。但是rna的一个致命缺点是容易降解，储藏条件较为苛刻。随着各种临床应用级脂质体的出现，使用按照一定比例配制的脂质体，可以将mrna包裹在脂质体中受到保护，并能够有效递送到细胞释放有效成分，实现对免疫细胞进行体外高效培养激活扩增。
5.
技术实现要素：
6.本发明提供一种基于脂质体递送mrna的免疫细胞培养及特异性负载激活方法，旨在解决现有技术存在的问题。
7.本发明是这样实现的，一种基于脂质体递送细胞因子mrna的免疫细胞培养方法，包括以下步骤：s1、设计细胞因子dna模板，合成基因构建于pires2-egfp载体，用于模板扩增和保存；s2、体外转录生产mrna；
s3、配制脂质体，进行mrna包装并生成脂质体颗粒；s4、将步骤s3获得的脂质体添加到免疫细胞；s5、进行基于脂质体递送细胞因子mrna的免疫细胞体外培养。
8.本发明还提供一种基于脂质体递送肿瘤抗原mrna的免疫细胞特异性负载激活方法，包括：将多元组合串联肿瘤抗原负载免疫细胞或dc细胞，对免疫细胞进行肿瘤抗原靶向性激活；s1、设计多元组合串联肿瘤抗原dna模板，合成基因构建于pires2-egfp载体，用于模板扩增和保存；s2、体外转录生产mrna；s3、配制脂质体，进行mrna包装并生成脂质体颗粒；s4、将步骤s3获得的脂质体添加到免疫细胞；s5、进行基于脂质体递送肿瘤抗原mrna的免疫细胞特异性负载激活。
9.优选的，所述构设计细胞因子dna模板，具体包括：对目标细胞因子进行全基因合成设计，合成序列包括t7启动子序列、通用5’utr序列、细胞因子编码区orf序列、通用5’utr序列、100bp的聚合腺嘌呤序列：t7启动子序列：taatacgactcactataggg；通用5’utr序列：agaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccacc；通用3’utr序列：taagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggc；poly（a）序列：aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。
10.优选的，所述体外转录生产mrna，具体包括：使用t7 rna聚合酶体外转录生成mrna，在转录体系中同时加入arca【3
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)g】用于产生帽子结构；mrna产物最终溶解在10mm柠檬酸盐/150mmnacl中，ph值为4.5。
11.优选的，所述配制脂质体，进行mrna包装并生成脂质体颗粒，具体包括：把脂质体原材料dotap（一种阳离子脂质）、dope（一种pe类助脂质）、胆固醇、peg脂质溶解在乙醇中，根据摩尔比5：3.75：3.75：0.65进行混合；上述mrna产物和脂质体混合物再以4：1的体积比，以脂质体快速注射到mrna溶液的方式进行混合形成包埋目标mrna的脂质体，mrna终浓度0.2 mg/ml，无菌过滤后溶解在pbs溶液中待用。
12.优选的，将脂质体与60 mg/ml 的d
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蔗糖混合进行冻干，然后在
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c条件下保存。
13.优选的，所述将步骤s3获得的脂质体添加到免疫细胞，具体包括：将分离的免疫细胞接种在细胞培养皿，加入rpmi1640培养基或x-vivo 15培养基；上述mnra脂质体以每106细胞加入3
µ
g mrna的比例加入培养基；对于肿瘤浸润淋
巴细胞，将il2 mnra脂质体以每106细胞加入3
µ
g mrna的比例加入培养基，培养5天后更换一半培养基并加入1.5
µ
g mrna，随后每2-3天进行细胞传代培养，培养14-21天后细胞数量达到10
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级后收集细胞。
14.优选的，所述rpmi1640培养基或x-vivo 15培养基的成分包括10%人ab型血清、2
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mmol谷氨酰胺、25
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mmhepes、10μg/ml庆大霉素。
15.优选的，所述进行基于脂质体递送肿瘤抗原mrna的dc细胞培养，具体包括：在dc细胞的体外培养过程中，加入gm-csf/il4细胞因子和tlr配体复合物刺激未分化的dc细胞；对未分化的dc细胞进行串联肿瘤抗原特异性负载，串联肿瘤抗原的基因合成序列如下：将信号肽片段（mrvtaprtlilllsgalaltetwags）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原afp片段（gvalqtmkq）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原afp片段（llnqhacav）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原ny-eso-1片段（sllmwitqc）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原gp100片段（ylepgpvta）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原melan-a片段（eaagigiltv）、连接子（ggslggggsg）、mitd结构域（ivgivaglavlavvvigavvatvmcrrkssggkggsysqaassdsaqgsdvslta）按照顺序拼接，使用peptide2.0软件翻译成核苷酸编码序列，基因合成；并按照上述步骤包装成肿瘤抗原脂质体颗粒；同时选取hla-a*0201型dc细胞，体外培养7天后加入脂质体，再次培养2-3天后收获肿瘤抗原刺激的成熟dc细胞。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的一种基于脂质体递送mrna的免疫细胞培养及特异性负载激活方法，mrna形态的细胞因子能够有效扩增体外培养免疫细胞，mrna形态的多元组合串联肿瘤抗原能够个性化特异性负载有效激活免疫细胞，解决过继细胞治疗体外免疫细胞培养所需要的细胞量大、体外细胞培养扩增困难、细胞因子成本高、靶向特异性差的难题。
附图说明
17.图1为本发明的产生细胞因子mrna的dna模板的示意图。
18.具体实施方式
19.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
20.本发明提供一种技术方案：一种基于脂质体递送细胞因子mrna的免疫细胞培养方法，包括以下步骤：s1、设计细胞因子dna模板，合成基因构建于pires2-egfp载体，请参阅图1，用于模板扩增和保存：对目标细胞因子进行全基因合成设计，合成序列包括t7启动子序列、通用5’utr序列、细胞因子编码区orf序列、通用5’utr序列、100bp的聚合腺嘌呤序列：
t7启动子序列：taatacgactcactataggg；通用5’utr序列：agaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccacc；通用3’utr序列：taagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggc；poly（a）序列：aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。
21.s2、体外转录生产mrna：使用t7 rna聚合酶体外转录生成mrna，在转录体系中同时加入arca【3
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o-me-m7g(5
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)g】用于产生帽子结构。
22.mrna产物最终溶解在10mm柠檬酸盐/150mmnacl中，ph值为4.5。注意通过该技术方法生成的mrna不需要进行poly(a)聚合酶进行加尾的实验步骤，且保证了所有的mnra均具有相同长度的poly(a)，便于后续mrna的均一性质量控制。另外根据需求决定是否掺入修饰碱基假尿苷和/或5甲基胞嘧啶。
23.s3、配制脂质体，进行mrna包装并生成脂质体颗粒：把脂质体原材料dotap（一种阳离子脂质）、dope（一种pe类助脂质）、胆固醇、peg脂质溶解在乙醇中，根据摩尔比5：3.75：3.75：0.65进行混合。脂质体原材料可为阳离子或可离子化脂质。磷脂可为pc或pe类助脂质。peg脂质为c
122o49
nh
247
。
24.上述mrna产物和脂质体混合物再以4：1的体积比，以脂质体快速注射到mrna溶液的方式进行混合形成包埋目标mrna的脂质体，mrna终浓度0.2 mg/ml，无菌过滤后溶解在pbs溶液中待用。
25.需要长期保存的可以将脂质体与60mg/ml的d-蔗糖混合进行冻干，然后在
−
80
ꢁ°
c条件下保存。
26.s4、将步骤s3获得的脂质体添加到免疫细胞：将分离的免疫细胞接种在细胞培养皿，加入rpmi1640培养基（不用使用无血清培养基，10% 人ab型血清、 2
ꢁ
mmol谷氨酰胺、25
ꢁ
mm hepes、10 μg/ml庆大霉素）。在其它实施方式中，可以采用x-vivo 15培养基，并且x-vivo 15培养基成分包括10%人ab型血清、2
ꢁ
mmol谷氨酰胺、25
ꢁ
mmhepes、10μg/ml庆大霉素。
27.上述mnra脂质体以每106细胞加入3
µ
g mrna的比例加入培养基；对于肿瘤浸润淋巴细胞，将il2 mnra脂质体以每106细胞加入3
µ
g mrna的比例加入培养基，培养5天后更换一半培养基并加入1.5
µ
g mrna，随后每2-3天进行细胞传代培养，培养14-21天后细胞数量达到10
10
级后收集细胞。
28.其中，免疫细胞从外周血或肿瘤组织中分离获得。
29.s5、进行基于脂质体递送肿瘤抗原mrna的dc细胞培养：在dc细胞的体外培养过程中，加入gm-csf/il4细胞因子和tlr配体复合物刺激未分化的dc细胞。
30.我们尝试进一步负载肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen）、或肿瘤特异性
新抗原（tumor-specific neoantigen），以获得更具靶向性的dc细胞。我们同样采用脂质体包埋mrna的方式递送到免疫细胞即负载dc细胞，不同的是该mrna编码不是细胞因子，而是多元组合的串联肿瘤抗原（tandem tumor antigen）。
31.对未分化的dc细胞进行串联肿瘤抗原特异性负载，串联肿瘤抗原的基因合成序列如下：将信号肽片段（mrvtaprtlilllsgalaltetwags）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原afp片段（gvalqtmkq）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原afp片段（llnqhacav）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原ny-eso-1片段（sllmwitqc）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原gp100片段（ylepgpvta）、连接子（ggsggggsgg）、肿瘤抗原melan-a片段（eaagigiltv）、连接子（ggslggggsg）、mitd结构域（ivgivaglavlavvvigavvatvmcrrkssggkggsysqaassdsaqgsdvslta）按照顺序拼接，使用peptide2.0软件翻译成核苷酸编码序列，基因合成，并按照上述步骤包装成肿瘤抗原脂质体颗粒。
32.同时选取hla-a*0201型dc细胞，体外培养7天后加入脂质体，再次培养2-3天后收获肿瘤抗原刺激的成熟dc细胞。需要补充的是，在具体的实施例中，我们对il2、il4、il15、gm-csf四种细胞因子和一种串联肿瘤抗原进行了实施，其细胞因子编码区orf序列和肿瘤抗原orf序列如下：il2（748bp）：taatacgactcactatagggagaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccaccatgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagtgcacctacttcaagttctacaaagaaaacacagctacaactggagcatttactgctggatttacagatgattttgaatggaattaataattacaagaatcccaaactcaccaggatgctcacatttaagttttacatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgtctagaagaagaactcaaacctctggaggaagtgctaaatttagctcaaagcaaaaactttcacttaagacccagggacttaatcagcaatatcaacgtaatagttctggaactaaagggatctgaaacaacattcatgtgtgaatatgctgatgagacagcaaccattgtagaatttctgaacagatggattaccttttgtcaaagcatcatctcaacactgacttgataagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaail4（748bp）：taatacgactcactatagggagaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccaccatgggtctcacctcccaactgcttccccctctgttcttcctgctagcatgtgccggcaactttgtccacggacacaagtgcgatatcaccttacaggagatcatcaaaactttgaacagcctcacagagcagaagactctgtgcaccgagttgaccgtaacagacatctttgctgcctccaagaacacaactgagaaggaaaccttctgcagggctgcgactgtgctccggcagttctacagccaccatgagaaggacactcgctgcctgggtgcgactgcacagcagttccacaggcacaagcagctgatccgattcctgaaacggctcgacaggaacctctggggcctggcgggcttgaattcctgtcctgtgaaggaagccaaccagagtacgttggaaaacttcttggaaaggctaaagacgatcatgagagagaaatattcaaagtgttcgagctgataagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaail15（775bp）
taatacgactcactatagggagaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccaccatgagaatttcgaaaccacatttgagaagtatttccatccagtgctacttgtgtttacttctaaacagtcattttctaactgaagctggcattcatgtcttcattttgggctgtttcagtgcagggcttcctaaaacagaagccaactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacaacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttcttgataagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagm-csf（721bp）：taatacgactcactatagggagaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccaccatgtggctgcagagcctgctgctcttgggcactgtggcctgcagcatctctgcacccgcccgctcgcccagccccagcacgcagccctgggagcatgtgaatgccatccaggaggcccggcgtctcctgaacctgagtagagacactgctgctgagatgaatgaaacagtagaagtcatctcagaaatgtttgacctccaggagccgacctgcctacagacccgcctggagctgtacaagcagggcctgcggggcagcctcaccaagctcaagggccccttgaccatgatggccagccactacaagcagcactgccctccaaccccggaaacttcctgtgcaacccagattatcacctttgaaagtttcaaagagaacctgaaggactttctgcttgtcatcccctttgactgctgggagccagtccaggagtgataagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa串联肿瘤抗原（850bp）taatacgactcactatagggagaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccaccatgcgggtgaccgccccccggaccctgatcctgctgctgtccggcgccctggccctgaccgagacctgggccggctccggcggctccggcggcggcggctccggcggcggcgtggccctgcagaccatgaagcagggcggctccggcggcggcggctccggcggcctgctgaaccagcacgcctgcgccgtgggcggctccggcggcggcggctccggcggctccctgctgatgtggatcacccagtgcggcggctccggcggcggcggctccggcggctacctggagcccggccccgtgaccgccggcggctccggcggcggcggctccggcggcgaggccgccggcatcggcatcctgaccgtgggcggctccctgggcggcggcggctccggcatcgtgggcatcgtggccggcctggccgtgctggccgtggtggtgatcggcgccgtggtggccaccgtgatgtgccggcggaagtcctccggcggcaagggcggctcctactcccaggccgcctcctccgactccgcccagggctccgacgtgtccctgaccgcctgataagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa本发明的一种基于脂质体递送mrna的免疫细胞培养及特异性负载激活方法，mrna形态的细胞因子能够有效扩增体外培养免疫细胞，mrna形态的多元组合串联肿瘤抗原能够特异性负载有效激活免疫细胞，解决过继细胞治疗体外免疫细胞培养所需要的细胞量大、体外细胞培养扩增困难、细胞因子成本高、靶向特异性差的难题。
33.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。