一种棕色脂肪细胞来源的外泌体及其制备方法和应用

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种人源皮肤成纤维细胞（hef细胞）转分化的棕色脂肪细胞来源的外泌体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.关节炎症状包括一处或多处关节出现炎症，主要症状为关节疼痛、僵硬、活动受限，关节皮肤发热发红，肌无力和肌萎缩等，其病因尚未完全清楚，但已知与多因素有关，包括先天遗传因素、后天环境因素、年龄、性别、肥胖、关节损伤、关节过度使用等。
3.根据最新的流行病学研究表明，我国至少有关节炎患者约6千万人，而且患病人数逐渐增加。关节炎不仅影响患者的生活质量，如此大的患病基数也对社会以及国民生产造成了极大的负担。目前，针对关节炎的治疗方案都存在一定的毒副作用或者创伤式损伤缺陷。因此，如何通过无创和安全的方式让关节炎患者受益，是目前关注的重点。
4.随着干细胞研究的深入以及生物工程技术的普遍应用，越来越多的研究者探索这一技术在关节炎治疗领域中的应用，逐渐展现了较为乐观的应用前景。然而，现有干细胞治疗关节炎的方式多为病患处原位注射干细胞，但注射方式为有创治疗，其必然会存在一定的风险，包括局部出血、血肿等，尤其当无菌操作不当时，可能会造成局部感染。另外，若注射不当，还可能会造成局部组织栓塞，导致局部组织坏死等。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种棕色脂肪细胞来源的外泌体的制备方法，其包括以下步骤：s1：构建共表达pparγ和cebpβ的人源皮肤成纤维细胞，得到棕色脂肪前体细胞；s2：利用棕色脂肪细胞诱导分化培养基对步骤s1获得的棕色脂肪前体细胞进行诱导分化培养，获得棕色脂肪细胞；s3：使步骤s2获得的棕色脂肪细胞分泌外泌体，获得棕色脂肪细胞来源的外泌体。
6.在一些实施方式中，步骤s1中所述构建共表达pparγ和cebpβ的人源皮肤成纤维细胞的操作为：s11：分别构建表达pparγ和cebpβ的慢病毒表达载体，得到pparγ慢病毒表达载体和cebpβ慢病毒表达载体；s12：分别对步骤s11构建获得的pparγ慢病毒表达载体和cebpβ慢病毒表达载体进行慢病毒包装，得到表达pparγ的慢病毒和表达cebpβ的慢病毒；s13：使用步骤s12获得的表达pparγ的慢病毒和表达cebpβ的慢病毒对人源皮肤成纤维细胞进行慢病毒感染，得到所述棕色脂肪前体细胞。
7.在一些实施方式中，步骤s1中所述pparγ和cebpβ的编码序列分别如seq id no:1和seq id no:2所示。
8.在一些实施方式中，步骤s2中所述棕色脂肪细胞诱导分化培养基的配方包括：体
积百分含量为97%-99%的高糖dmem、体积百分含量为1%-3%的胎牛血清、32-34 μm的生物素、0.4-0.6 μm的胰岛素、16-18 μm的泛酸、0.09-0.11 μm的dex、1-3 μm的t3、0.50-0.60 mm的ibmx和0.02-0.04 mm的吲哚美辛。
9.在一些实施方式中，步骤s2中所述诱导分化培养的时间为6天以上。
10.在一些实施方式中，步骤s2中所述诱导分化培养的条件为5%co2，37
±
1℃。
11.在一些实施方式中，步骤s3中所述使步骤s2获得的棕色脂肪细胞分泌外泌体的操作为使用无血清基础培养基对所述棕色脂肪细胞进行培养。
12.本发明另一方面还提供一种人源皮肤成纤维细胞转分化的棕色脂肪细胞来源的外泌体，其由上述的制备方法获得。
13.上述的棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备用于治疗关节炎相关病症的药物中的应用也属于本发明的内容。
14.本发明再一方面还提供一种治疗关节炎相关病症的药物，其包括上述的棕色脂肪细胞来源的外泌体作为活性成分。
15.在一些实施方式中，所述药物为外用药物，其剂型包括散剂、溶液、酊剂、醑剂、洗剂、软膏、乳膏、糊剂、油剂、凝胶剂、涂膜剂、擦剂、滴剂、气雾剂、湿敷剂、栓剂、贴剂和喷剂。
16.在一些实施方式中，所述关节炎相关病症包括痛风性关节炎、颈椎间盘突出、腰间盘突出、腰椎间盘病变和腱炎。
17.基于以上技术方案提供的人源皮肤成纤维细胞转分化的棕色脂肪细胞来源的外泌体的制备方法可通过使分化终端（已经丧失全能干性）的人源皮肤成纤维细胞共表达pparγ和cebpβ，进而获得具有分化为成熟棕色脂肪细胞潜力的棕色脂肪前体细胞，利用棕色脂肪细胞诱导分化培养基诱导培养该棕色脂肪前体细胞，可以获得能够分泌外泌体的棕色脂肪细胞。实施例结果表明，本发明提供的人源皮肤成纤维细胞转分化的棕色脂肪细胞来源的外泌体可以通过外敷给药方式治疗关节炎相关病症，并具有无创改善关节炎疼痛症状的优异效果，能够显著缓解患者疼痛，且不存在副作用或副作用小，因此该外泌体可以应用于制备治疗和改善包括痛风性关节炎、颈椎间盘突出、腰间盘突出、腰椎间盘病变和腱炎在内的关节炎相关病症的药物。
附图说明
18.图1为稳定表达gfp的hef细胞，单稳定表达的cebpβ的hef细胞作以及稳定共表达pparγ和cebpβ的hef细胞经棕色脂肪细胞诱导分化培养基诱导培养后的细胞形态。
具体实施方式
19.针对现有技术中存在的关节炎治疗方式的诸多缺陷，本发明提供一种人源皮肤成纤维细胞转分化的棕色脂肪细胞来源的外泌体，可通过向关节炎相关病症疼痛处外敷该外泌体的方法治疗关节炎相关病症，并提供了该外泌体的制备方法。
20.本发明人惊讶发现，虽然hef细胞是一种分化终端的细胞，已经丧失了全能干性，但当将其改造成稳定共表达pparγ和cebpβ的细胞时，能够使其具有分化为棕色脂肪细胞的潜力，并且本发明人还发现利用由该人源皮肤成纤维细胞转分化的棕色脂肪细胞分泌的外泌体能够治疗关节炎相关病症，并具有良好的治疗效果。基于此，本发明提供了人源皮肤
成纤维细胞转分化的棕色脂肪细胞来源的外泌体及其制备方法和在制备治疗关节炎相关病症的药物（尤其是外敷药物）中的应用。
21.以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应当理解的是，具体实施例仅用于进一步说明本发明，而不是用于限制本发明的内容。
22.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》（《molecular cloning: a laboratory manual》 sambrook，j.，russell， david w.，molecular cloning: a laboratory manual，3rd edition，2001，ny，cold spring harbor）。
23.实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。
24.以下实施例中涉及的序列均可使用已有技术合成。
25.实施例1：将hef细胞（人源皮肤成纤维细胞）改造为具有分化为棕色脂肪细胞潜力的前体细胞该实施例旨在将hef细胞改造为具有分化为棕色脂肪细胞潜力的前体细胞，并对该前体细胞的特性进行鉴定，具体包括以下步骤。
26.1.1、质粒构建将人源pparγ cdna序列（其核苷酸序列如seq id no:1所示）和人源cebpβ cdna序列（其核苷酸序列如seq id no:2所示）分别克隆到pcdh-ef1-mcs-t2a-gfp载体（商购获得）和pcdh-ef1-mcs-t2a-puro载体（商购获得）中，分别获得pparγ病毒表达载体和cebpβ病毒表达载体。
27.1.2、慢病毒包装培养hek 293t细胞（细胞培养用的完全培养基为含10% fbs完全培养基），将细胞按密度为8
×
105个细胞/cm2均匀接种于6 cm的中皿中，待细胞融合至70-80%的时候准备转染。准备dmem无血清培养基与dmem含10�s不含双抗培养基，备用。包装过程中病毒表达载体（步骤1.1获得）：pspax2：pmd2g的质量比为5μg：2μg：1μg，作为转染混合物。具体在上述质粒溶液中加入16 μl lipofectamine2000，混匀，37℃孵育5min后。同时弃去hek 293t细胞培养基，更换成2.5 ml含10�s不含双抗的dmem培养基，然后加入转染混合物；12h后换dmem完全培养基，48h后各ep管补液1ml，72h后将含病毒的培养基分别移入离心管中，3000 r/min，4℃离心10 min，去上清病毒液。将病毒液分别用0.45μm的滤器过滤，分装并冻存于-80℃冰箱备用。分别得到生产pparγ的慢病毒和生产cebpβ的慢病毒。
28.1.3、稳转pparγ和cebpβ的hef细胞构建取冻存的hef细胞复苏，按照接种密度为8
×
105个细胞/cm2接种于6cm培养皿，4ml/皿。细胞培养用的完全培养基为含10% fbs完全培养基。于5%co2，37℃的培养箱中培养。待hef细胞融合至80-90%后，使用步骤1.2获得的生产pparγ的慢病毒和生产cebpβ的慢病毒侵染hef细胞，并于48小时候后进行gfp流式筛选以及puro压力筛选出可稳定共高表达pparγ和cebpβ的hef细胞，即为具有分化为棕色脂肪细胞潜力的前体细胞。该步骤中按照以上
μm的dex、2 μm的t3、0.55 mm的ibmx和0.03 mm的吲哚美辛）中诱导分化6天。
33.（2.2）将步骤（2.1）诱导分化后的细胞用pbs清洗3次，每皿加入20 ml无酚红dmem基础培养基。培养24h后收集细胞培养上清液，并加入新的20 ml无酚红dmem基础培养基继续培养24h收集细胞培养上清液。
34.（2.3）将（2.2）中收集的细胞培养上清液置于4℃离心机中，1800 rpm离心25min，离心后弃去死细胞沉淀，收集上清。
35.（2.4）将（2.3）中收集的上清液置于4℃离心机中，9500rpm离心35min，离心后弃去细胞碎片沉淀，收集上清。
36.（2.5）将（2.4）中收集的上清液置于4℃离心机中，100000xg离心50min，离心后收集沉淀。
37.（2.6）将步骤（2.5）收集的沉淀用无酚红dmem重悬，即可得到棕色脂肪细胞来源的外泌体。基于label free的定量蛋白组分析对外泌体样品进行分析，结果如下表2所示，可见所获得的外泌体含有大量的cd81蛋白（外泌体的标志蛋白），而不含有cox iv蛋白（线粒体的标志蛋白），证明该实施例确实获得了外泌体。
38.表2：样品中外泌体表面标志蛋白丰度（intensity）分析结果 蛋白名称样品一样品二样品三样品四样品五外泌体标志蛋白cd8161260004362600436280025369007508600线粒体标志蛋白coxiv00000实施例3：棕色脂肪细胞来源的外泌体的应用该实施旨在使用实施例2制备的棕色脂肪细胞来源的外泌体对关节炎相关病症患者进行治疗，并评价疗效，具体包括以下步骤。
39.选取9名具有关节炎疼痛的患者（已签署知情意向同意书，患者的具体信息如下表3所示），利用实施例2制备的棕色脂肪细胞来源的外泌体进行治疗，并随后进行医学评价。具体治疗方式为：患者在病患疼痛处每日早、晚各涂抹一次由实施例2制备的棕色脂肪细胞来源的外泌体（其中总蛋白浓度约为1 mg/ml），连续14天，记录疼痛指数，疼痛指数的评价方法和标准如下所示：视觉模拟法（vas划线法）无痛/剧痛之间划一条长线（一般为100 mm），线上不做标记、数字或词语，以免影响评估结果。一端代表无痛，另一端代表剧痛，让患者在线上最能反应自己疼痛程度之处划一交叉线。
40.vas疼痛评分标准（0分-10分）0分：无痛；≤3分：有轻微的疼痛，能忍受；4分-6分：患者疼痛并影响睡眠，尚能忍受；≥7分：患者有逐渐强烈的疼痛，疼痛难忍，影响食欲，影响睡眠。
41.评价结果见下表3所示。可见，当向关节炎相关病症患者疼痛处涂抹施用本发明提供的外泌体3天后，均能降低包括痛风性关节炎、颈椎间盘突出、腰间盘突出、腰椎间盘病变和腱炎在内的关节炎相关病症的疼痛指数，并且在施用外泌体7天后（尤其是14天后），能够显著降低以上这些关节炎相关病症的疼痛指数，并且在这些关节炎相关病症中，本发明提
供的外泌体对痛风性关节炎和颈椎间盘突出的治疗效果更好，施用外泌体14天后能够基本上完全缓解患者的疼痛。以上结果证明本发明制得的hef细胞转分化的棕色脂肪细胞来源的外泌体具有良好的缓解关节炎相关病症疼痛的效果。
42.表3：棕色脂肪细胞来源的外泌体对膝关节炎相关病症的治疗效果评价最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。