一种高粱素的制备方法

1.本发明涉及一种高粱素的制备方法，特别涉及一种利用基因工程改造的酿酒酵母在制备高粱素中的应用。
技术背景
2.化感作用最开始的定义是指植物通过向环境释放特定的次生物质从而对邻近其它植物生长发育产生的影响。现在，植物化感作用研究事实上已扩展到以植物为中心的一切有机体及环境间通过化学物质为媒介的化学相互作用。1984年rice在《allelopathy》第二版中，将化感作用较完整的意义定为：植物或微生物的代谢分泌物对环境中其他植物或微生物有利或不利的作用。这个定义现已被广泛接受。
3.《利用化感物质开发除草剂的应用前景》（陈业兵等，山东农业大学学报）指出，从植物中提取有效的化感物质直接应用于生产实际是不太现实的，因为化感物质含量少，提取困难，获得的量也非常少，成本太高。研究植物的化感作用，是在提取、分离和鉴定化感物质的基础上，人工模拟合成化感物质作用较强物质或对一些化感物质进行结构修饰，这将有可能开发出新型除草剂。而在从植物中获得具有开发成除草剂潜力的化感物质，在用于除草剂之前，要解决的问题有：（1）、物质的最低有效浓度；（2）、化感物质的分离和鉴定；（3）、化感物质在土壤中的残留和降解；（4）、化感物质对土壤中微生物生理生化特性的影响；（5）、化感物质的作用方式；（6）、化感物质对作物是否有负面影响；（7）、化感物质对人类健康的影响；（8）、产业化生产化感物质是否是经济合理的。
4.对化感物质进行研究，可以选择出新一代农药开发的母体结构。以活性化感物质作为先导化合物可以更快更经济地发现活性更优的类似物。虽然离最终除草剂的问世还需要相当长的时间和较大的经济投入，但是天然除草剂是环保的，在环境问题备受关注的今天，天然除草剂必将具有广阔的前景。
5.高粱素（sorgoleone）是高粱（sorghum bicolor （l.） moench）的根中合成并分泌到土壤中的苯醌类化感物质（allelochemicals），它能通过竞争光合系统ii中质体醌的结合位点，从而抑制其它植物的光合作用；同时能阻碍线粒体中的电子转移反应，从而对其它植物产生直接的或间接的有害作用。有研究报道高粱素对包括阔叶、单子叶和双子叶等多种杂草的生长表现出显著的抑制作用。由于高粱素对人和动物安全，且具有除草高效及无环境污染等特点，使其在新型除草剂开发方面具有广阔的前景。
h；然后用无菌离心管在（2000~4000）g离心2~10 min收集菌体，并转移至ypg培养基中，在28~32℃，180 ~220 rpm摇床中培养40~55h；外加脂肪酸培养时，以0.05~0.2%（v/v）的终浓度加入；f、收集发酵后的菌体，使用液氮研磨法将菌体粉化；进行产物的提取和检测。
11.或者，一种高粱素的制备方法，包括以下步骤：a、获得改进的高粱素合成基因， des2、des3、ars1、ars2、omt3、p450、atr1；b、将des2和des3、a1o（指ars1或ars2）和omt3、p450和atr1两两分组分别构建到pesc系列载体的多克隆位点1和多克隆位点2处，使用引物t
adh1
和t
cyc1
，将包含两端终止子序列的表达盒片段进行扩增、纯化，获得片段1、2、3；从pesc-ura 载体上用引物ura-f和ura-r扩增获得尿嘧啶ura3编码序列的表达盒片段4；合成酿酒酵母基因组的非同源连接片段l1-l4，通过同源重组的方式将连接片段与上述表达盒1、2、3、4进行拼接，获得ura-l1、l1
‑ꢀ
des2
‑ꢀ
des3-l2、l2
‑ꢀ
a1o-omt3-l3、l3
‑ꢀ
p450-atr1-l4基因片段；提取酿酒酵母基因组，扩增整合位点yprc
∆
15两端同源臂site1和site2，并且通过同源重组方式，拼接获得片段site1-ura-l1和l4
‑ꢀ
site2；将site1-ura-l1、l1
‑ꢀ
des2
‑ꢀ
des3-l2、l2
‑ꢀ
a1o-omt3-l3、l3
‑ꢀ
p450-atr1-l4和l4
‑ꢀ
site2五个片段分别扩增、纯化，通过电击转化法转化到酿酒酵母cen.pk2-1c中，使用sd-ura固体缺陷培养基培养2~3天，挑选单克隆，进行基因型验证，将阳性菌株进行保菌，得到by-zjut-zh2菌株；c、将保存的甘油菌by-zjut-zh2菌株在平板上划线，28~32℃培养2~4 d；长出单菌落后，挑取单菌落于液体培养基中，在摇床中，28~32℃，200~250 rpm培养8~15 h；培养好的种子液继续扩大培养至200 ml，接种初始od
600
为0.03~0.06，在摇床中，28~32 ℃，200~250 rpm培养8~16h；d、将培养好的二级种子液接种至发酵罐进行发酵，培养温度为28~32 ℃，初始搅拌转速为600~1000 rpm，根据发酵过程中溶氧水平搅拌转速最高可调整至1200 rpm，ph通过补加氨水控制在5.6左右；本步骤培养基组成为：4~6 g/l （nh4） 2
so4，2~4g/l kh2po4，0.03~0.07 g/l mgso4，50~70 mg/l尿嘧啶，50~70mg/l色氨酸，10~30 g/l葡萄糖以及本领域常规使用量的金属元素和维生素溶液；e、培养4~6 h后，补加培养基13~16 g/l （nh4） 2
so4，8~10 g/l kh2po4，1.2~1.8 g/l mgso4，160~200 mg/l尿嘧啶，160~200 mg/l色氨酸，50~70g/l葡萄糖，以及步骤c中三倍使用量的金属元素和维生素溶液，继续培养；f、继续培养4~6 h后，补加培养基23~28 g/l （nh4） 2
so4，12~18 g/l kh2po4，2.~3 g/l mgso4·
7h2o，250 ~350mg/l尿嘧啶，250 ~350 mg/l色氨酸，80~120 g/l半乳糖以及步骤c中五倍使用量的金属元素和维生素溶液，继续培养18~30 h；g、培养结束后，通过离心收集菌体，进行产物的提取和检测。
12.本发明上述技术方案中，des2的序列，为序列表所示的第1序列；des3的序列，为序列表所示的第3序列；ars1的序列，为序列表所示的第5序列；ars2的序列，为序列表所示的第7序列；omt3的序列，为序列表所示的第9序列；cyp71am1的序列，为序列表所示的第11序列；
atr1的序列，为序列表所示的第13序列。综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明对酿酒酵母的代谢途径进行改造以提高合成乙酰辅酶a（acetyl-coa）和丙二酰辅酶a（malonyl-coa）的能力，同时将合成高粱素的相关基因导入酿酒酵母中，获得高产高粱素的重组工程菌，并将工程菌应用于制备高粱素的方法，实现高粱素高效的合成。
附图说明
13.图1 pesc-his-des2-des3载体构建示意图；图2 pesc-ura-ars1-omt3和pesc-ura-ars2-omt3构建示意图；图3 pesc-leu-cyp71am1-cpr构建示意图；图4 by-zjut-zh1发酵产物液相色谱图；图5 酿酒酵母脂肪酸途径优化示意图；图6 在酿酒酵母中异源整合高粱素合成途径关键酶基因示意图。
具体实施方式
14.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
15.lb培养基：酵母粉5.0g/l，蛋白胨10g/l、nacl10g/l，溶剂为去离子水，ph7.0。
16.ypd培养基组成：酵母粉24 g/l、蛋白胨12 g/l、甘油4 ml、kh2po
4 2.3 g/l、k2hpo
4 12.5 g/l，溶剂为去离子水，ph6.8-7.0。
17.sc-dropout培养基组成: 泛基诺 his leu ura minus media 8 g/l、葡萄糖20 g/l。
18.实施例1 、基因表达载体的构建从ncbi数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）中下载基因序列，分别是来源于高粱（sorghum bicolor （l.） moench）的脂肪酸脱氢酶（fatty acid desaturases）基因des2和des3、高粱的聚酮合酶（alkylresorcinol synthases）基因ars1和ars2、甲基转移酶（o-methyltransferase）基因omt3和细胞色素p450（cytochrome p450）基因cyp71am1。针对酿酒酵母密码子偏好性将这些基因序列进行密码子优化后进行全基因合成。示例性的基因改进后的密码子序列如seq id no：1（des2）、3（des3）、5（ars1）、7（ars2）、9（omt3）及11（cyp71am1）所示。
19.将获得上述改进的高粱素合成基因，通过同源重组的方式将des2基因和des3基因分别构建至真核表达载体pesc-his的pgal1和pgal10启动子下游（mcs2和mcs1） （附图1），将ars1基因和omt3基因分别构建至真核表达载体pesc-ura的pgal1和pgal10启动子下游（mcs2和mcs1） （附图2），将ars2基因和omt3基因分别构建至真核表达载体pesc-ura的pgal1和pgal10启动子下游（mcs2和mcs1） （附图2），将cyp71am1基因和来源于拟南芥的atr1基因（基因序列seq id no：13（atr1））分别构建至真核表达载体pesc-leu的pgal1和pgal10启动子下游（mcs2和mcs1） （附图3）。具体操作如下：（1）利用设计的带载体同源臂的引物通过全长pcr将des3扩增，纯化；
pesc-leu-r5
’‑
gaggtcttcttcggaaatcaac-3’p450-f5
’‑
tgatttccgaagaagacctcgatggatgagtacttcgttga-3’p450-r5
’‑
ccgcggtaccaagcttactctttaagcatcaatagaagcag-3’atr1-f5
’‑
gaattcaaccctcactaaagggatgtggaaaaagacaacagc-3’atr1-r5
’‑
gtaatccatcgatactagtgcggttaccagacgtccctcaagt-3’pesc-leu-r
’5’‑
ccctttagtgagggttgaattc-3’pesc-leu-f
’5’‑
ccgcactagtatcgatggattac-3’gal1-f5
’‑
attttcggtttgtattacttc-3’gal1-r5
’‑
gttcttaatactaacataact-3’gal10-f5
’‑
ggtggtaatgccatgtaatatg-3’gal10-r5
’‑
ggcaaggtagacaagccgacaac-3’实施例2、酿酒酵母工程菌by-zjut-zh1的构建将pesc-his-des2-des3质粒、pesc-ura-ars1-omt3（或pesc-ura-ars2-omt3）和pesc-leu-cyp71am1-cpr利用酵母转化试剂盒转化入酿酒酵母by4741，涂布于sc-his-leu-ura筛选平板，30 ℃下培养2-4 d。长出单菌落后，在超净工作台中挑取单菌落于1 ml的sc-his-leu-ura液体筛选培养基，在摇床中，30 ℃，220 rpm培养过夜。取培养好的菌液，用引物gal1-f/r和gal10-f/r进行pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳，检测pcr产物中是否包含所有目的条带。将包含所有目的条带的菌株命名为by-zjut-zh1，加入20 %的甘油，-80 ℃冻存。
21.重组酵母摇瓶诱导发酵将甘油菌by-zjut-zh1在sc-his-leu-ura筛选平板上划线，30℃培养2-4 d，挑取平板上的重组酿酒酵母单菌落到5 ml培养基中，在摇床中30 ℃，200 rpm过夜培养。将菌体转移到新的100 ml培养基中，使其初始od
600
=0.5，继续在30 ℃，200 rpm摇床中培养24 h。然后用无菌离心管在3000
×
g离心5 min收集菌体，并转移至100 ml ypg培养基（ypd培养基中的葡萄糖换成半乳糖）中，在30 ℃，200 rpm摇床中培养48 h。外加脂肪酸培养时，以0.1%（v/v）的终浓度加入。
22.重组酵母产物提取收集发酵后的菌体，使用液氮研磨法将菌体粉化。首先在250 ml锥形瓶中加入50 ml的甲醇/氯仿（1:1, v/v）溶液，再加入粉碎的菌体，轻轻涡旋1 min，然后水浴超声30 min。抽提液真空抽滤，收集滤液，滤渣再用10 ml甲醇/氯仿（1:1, v/v）溶液抽提两次。合并三次抽提的滤液，旋蒸，圆底烧瓶中的残留物在氯仿中重新溶解，然后用0.22 μm的有机膜过滤后，转移到液相色谱瓶中，使用岛津液相色谱仪进行hplc分析。
23.hplc检测发酵产物对照品：1 mg/l高粱素。
24.色谱条件：色谱柱，agilent xdb-c18 （250 mm
ꢀ×ꢀ
4.6 mm）；流动相，乙腈：水（v/v）=7:3；流速，1.8 ml
·
min-1
；进样量，50 μl；柱温，30℃。产物结果见附图4。从图4可以看出，在检测样品色谱图上16 min处出现了与高粱素标准品相同出峰时间的峰，后经确证该样品峰为高粱素。
25.实施例3 、酿酒酵母工程菌by-zjut-zh2的构建首先对酿酒酵母脂肪酸途径进行优化，以提高高粱素前体的棕榈油酸
palmitoleic acid （16:1
△9）产量，主要构建策略和方法参考yongjin j. zhou等人的研究（zhou et al. nature communicatons （2016） 7:11709. doi 10.1038/ncomms11709）。通过以下策略提高酿酒酵母细胞质中脂肪酸合成前体乙酰辅酶a acetyl-coa的产量，引入小家鼠mus musculus的柠檬酸裂解酶citrate lyase （mmacl） 和圆红冬孢酵母rhodospuridium toruloides的苹果酸酶malic enzymes（rtme）和柠檬酸合酶 rtcit1，过表达酿酒酵母内源的线粒体柠檬酸转运蛋白ctp1和苹果酸盐脱氢酶malate dehydrogenase
ꢀ‘
mdh3，过表达线粒体丙酮酸载体（mitochondrial pyruvate carrier） mpc1 和 mpc3；通过引入圆红冬孢酵母的脂肪酸合酶rtfas1 和 rtfas2，乙酰辅酶a羧化酶acetyl-coa carboxylase（acc1），阻止脂肪酸通过β-氧化降解，敲除pox1基因，提高酿酒酵母脂肪酸的合成（脂肪酸途径优化示意图见图5）。
26.基于实施例2中将des2和des3、a1o（ars1或ars2）和omt3、p450和atr1两两分组分别构建到pesc系列载体的多克隆位点1和多克隆位点2处，使用引物t
adh1
和t
cyc1
，将包含两端终止子序列的表达盒片段进行扩增、纯化，获得片段1、2、3；从pesc-ura 载体上用引物ura-f和ura-r扩增获得尿嘧啶（ura3）编码序列的表达盒片段4；参考siwei li等人的研究（li et al. biotechnol biofuels （2016） 9:232. doi 10.1186/s13068-016-0645-4），合成酿酒酵母基因组的非同源连接片段l1-l4（表2），通过同源重组的方式将连接片段与上述表达盒1、2、3、4进行拼接，获得ura-l1、l1
‑ꢀ
des2
‑ꢀ
des3-l2、l2
‑ꢀ
a1o-omt3-l3、l3
‑ꢀ
p450-atr1-l4基因片段；提取酿酒酵母基因组，扩增整合位点yprc
∆
15两端同源臂site1和site2，并且通过同源重组方式，拼接获得片段site1-ura-l1和l4
‑ꢀ
site2；将site1-ura-l1、l1
‑ꢀ
des2
‑ꢀ
des3-l2、l2
‑ꢀ
a1o-omt3-l3、l3
‑ꢀ
p450-atr1-l4和l4
‑ꢀ
site2五个片段分别扩增、纯化，通过电击转化法转化到酿酒酵母cen.pk2-1c中，使用sd-ura固体缺陷培养基培养2-3天，挑选单克隆，进行基因型验证，将阳性菌株进行保菌（基因整合示意图见图6）。
27.表2 引物、连接片段序列及整合位点同源序列
实施例4、by-zjut-zh2的高密度发酵将构建好的by-zjut-zh2菌株进行高密度发酵，具体操作如下：（1）将保存的甘油菌by-zjut-zh2菌株在平板上划线，30 ℃培养2-4 d。长出单菌落后，挑取单菌落于5 ml的液体培养基中，在摇床中，30 ℃，220 rpm培养12 h。培养好的种子液继续扩大培养至200 ml，接种初始od
600
为0.05，在摇床中，30 ℃，220 rpm培养12 h；
（2）将培养好的二级种子液接种至5 l发酵罐进行发酵，使用无机盐培养基作为发酵培养基（5 g/l （nh4）2so4，3 g/l kh2po4，0.5 g/l mgso4·
7h2o，60 mg/l尿嘧啶，60 mg/l色氨酸，20 g/l葡萄糖以及微量金属元素和维生素溶液），初始培养体积为2 l，碳源为葡萄糖，培养温度为30 ℃，初始搅拌转速为800 rpm，根据发酵过程中溶氧水平搅拌转速最高可调整至1200 rpm，ph通过补加氨水控制在5.6左右；（3）培养6 h后，补加培养基（15 g/l （nh4） 2
so4，9 g/l kh2po4，1.5 g/l mgso4·
7h2o，180 mg/l尿嘧啶，180 mg/l色氨酸以及3x微量金属元素和3x维生素溶液），60 g/l葡萄糖，继续培养；（4）又培养6 h后，补加培养基（25 g/l （nh4）2so4，15 g/l kh2po4，2.5 g/l mgso4·
7h2o，300 mg/l尿嘧啶，300 mg/l色氨酸以及5x微量金属元素和5x维生素溶液），100 g/l半乳糖，继续培养24 h；（5）培养结束后，通过离心收集菌体，产物的提取和检测同实施例2。