一种用于细胞培养肉的丝蛋白仿生取向生物支架的制作方法

1.本发明属于食品领域，具体涉及一种用于细胞培养肉的丝蛋白仿生取向生物支架。


背景技术：

2.细胞培养肉通过细胞培养和组织工程技术，在体外形成具有真实肌肉的风味和口感的肉质产品。该技术基于无菌环境和质量控制，可规避抗生素、激素带来的食品安全问题；该技术从被动依赖动物生长周期中解放出来，有望更高效生产肉质产品，解决粮食危机问题。此外，该技术避免动物屠宰，更加复合动物保护的健康理念。细胞培养肉主要由细胞和生物支架组成。其中生物支架需满足可食用性和促进细胞黏附生长的性能要求。此外，由于天然肌肉组织存在明显的取向纹理。为了使细胞培养肉展现出天然肌肉纹理，制备具有仿生取向的微结构具有重要意义。
3.目前，可通过取向静电纺丝、湿法挤出纺丝等技术实现取向微结构的制备。然而这些生物支架存在细胞渗透率不足等问题，导致支架在增加厚度方面受到严重的限制，无法实现3d立体结构的成型加工；且由于细胞难以渗透支架内部，导致在制备的细胞培养肉中细胞占比较低，难以突破70%。提高生物支架的孔隙结构是增加细胞渗透性的重要途经。因此，亟待一种新的可食用生物支架的制备技术来来解决孔隙率和生物相容性的挑战。
4.定向冻干是一种以温度梯度为驱动、定向形成冰晶模板的方法，经过冻干以后可形成3d一体的多孔气凝胶。所制备的材料具有丰富的微纳米孔穴，为细胞的渗透生长提供了所需的空间。此外，由于冰晶的定向形成，可在冰晶形成方向上，诱导支架材料微纤维发生有序排列。因此，该技术有望在体外直接制备具有仿生肌肉取向纹理的立体细胞培养肉。cn113208059a、cn113215090a利用该技术制备了明胶基和胶原蛋白衍生物取向生物支架，可作为细胞培养肉用的生物支架。然而明胶、胶原蛋白仍然属于动物蛋白，来源受限，这与细胞培养肉行业的愿景相违背。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种用于细胞培养肉的丝蛋白仿生取向生物支架。
6.本发明所采取的技术方案是：一种用于细胞培养肉的丝蛋白仿生取向生物支架，其制备方法包括如下操作：将丝素蛋白、酵母蛋白溶解于水中，得到混合蛋白液，控制蛋白液的ph为9～10；将蛋白液转入支架模具中实施定向冻干技术。具体地，将体系转移至温度不高于-60℃的乙醇液氮液中，冻干，得到未固定的生物支架；将未固定的生物支架置于固定液中固定，清洗、得到仿生取向生物支架。
7.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，将支架模具转移至温度不高于-60℃的乙醇液氮液中实施定向冻干。
8.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，所述混合蛋白液中：丝素蛋白的质量浓度为2～10%；和/或酵母蛋白的质量浓度为1～10%。
9.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，丝素蛋白、酵母蛋白质量混合比为：丝素蛋白：酵母蛋白=(1:7)～(3:9)。
10.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，所述混合蛋白液中还添加有可食用蛋白。
11.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，所述可食用蛋白的用量为丝素蛋白和酵母蛋白总质量的0～500%。
12.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，所述可食用蛋白选自谷朊粉、大豆分离蛋白、土豆蛋白、玉米蛋白中的至少一种。
13.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，可以用食品级乙醇溶液对未固定的生物支架浸渍后再进行固定操作。
14.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，使用可食用醇溶蛋白的乙醇溶液对未固定的生物支架浸渍后再进行固定操作。
15.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，所述可食用醇溶蛋白为可食用玉米醇溶蛋白。
16.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，所述固定液为乙醇和乙酸的混合液。
17.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，所述固定液中，乙醇的体积浓度为75%；乙酸的体积浓度为2～5%。
18.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，其用于培养动物细胞，所述动物细胞选自成肌细胞、肌肉卫星细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、脂肪前体细胞、成体干细胞和多能干细胞。所述细胞包括但不限于肌细胞、肝细胞、成骨细胞、成纤维细胞、成脂细胞、造牙本质细胞、成体神经元祖细胞、神经干细胞、来自脑室下前脑区的多个多潜能干细胞、室管膜神经干细胞、造血干细胞、肝造血干细胞、骨髓干细胞、脂肪的成纤维细胞、脂肪干细胞、产生多个胰岛细胞的干细胞、胰源性多能产生胰岛干细胞、间质干细胞、胎盘细胞、骨髓基质细胞、肌肉侧群细胞、骨髓来源的回收细胞、血液来源的间质前体细胞、骨髓来源的侧群细胞、肌肉前体细胞、循环的骨骼干细胞、神经祖细胞、多潜能成体祖细胞、中胚层祖细胞、脊髓祖细胞及孢子样细胞及任何组合所组成的群组。
19.本发明的有益效果是：本发明一些实例的丝蛋白仿生取向生物支架，使用的原料均为非动物源的蛋白质，不仅具有良好的细胞相容性和生物安全性，能促进细胞黏附生长，其自身蛋白含有丰富的氨基酸，能提高机体新陈代谢，促进人体健康。
20.本发明一些实例的丝蛋白仿生取向生物支架，具有定向仿生取向结构，能够模拟天然肌肉组织的纹理，为细胞培养肉带来良好的口感。
21.本发明一些实例的丝蛋白仿生取向生物支架，孔隙率高，有效提高了细胞的渗透能力。
附图说明
22.图1是实施例1制备得到的丝蛋白仿生取向生物支架的光学照片；
图2是实施例1仿生取向生物支架接种c2c12细胞后3d的细胞活死染色图；图3是实施例2仿生取向生物支架接种c2c12细胞后3d的细胞活死染色图；图4是实施例3仿生取向生物支架接种猪原代细胞scs后3d的细胞活死染色图。
具体实施方式
23.一种用于细胞培养肉的丝蛋白仿生取向生物支架，其制备方法包括如下操作：将丝素蛋白、酵母蛋白溶解于水中，得到混合蛋白液，控制蛋白液的ph为9～10；将混合蛋白液转入支架模具中实施定向冻干，得到未固定的生物支架；将未固定的生物支架置于固定液中固定，清洗、得到仿生取向生物支架。
24.可以通过在蛋白液中添加可食用的碱或酸，如naoh、na2co3等来调整混合蛋白液的ph。
25.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，将支架模具转移至温度不高于-60℃的乙醇液氮液中实施定向冻干。通过在乙醇液氮液中进行定向冻干，可以更好地确定生物支架的取向，使得其具有期望的形态。
26.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，液氮定向冻干过程，会在液氮中添加乙醇，来调控冻干过程的工艺温度，以实现孔结构的调整。
27.定向冻干时，待蛋白液完全冻结后，脱膜，之后于冻干机中冻干即可。
28.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，丝素蛋白、酵母蛋白质量混合比为：丝素蛋白：酵母蛋白=(1:7)～(3:9)。在此范围内，可获得细胞黏附性能较好的生物支架，同时兼顾材料的力学稳定性。
29.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，所述混合蛋白液中：丝素蛋白的质量浓度为2～10%；和/或酵母蛋白的质量浓度为1～10%。这样得到的支架，具有期望的强度和孔隙率，利于细胞附着生长。
30.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，所述混合蛋白液中还添加有可食用蛋白，以满足对口感和营养成分的个性化设计。
31.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，所述可食用蛋白的用量为丝素蛋白和酵母蛋白总质量的0～500%。
32.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，所述可食用蛋白选自谷朊粉、大豆分离蛋白、土豆蛋白、玉米蛋白中的至少一种。
33.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，使用食品级乙醇溶液对未固定的生物支架浸渍后进行固定操作，可原位诱导丝素蛋白的构型变化，形成稳定的生物支架。
34.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，可以用食品级乙醇溶液对未固定的生物支架浸渍后再进行固定操作。
35.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，所述可食用醇溶蛋白为可食用玉米醇溶蛋白。这样可以进一步改善。
36.固定液可以是本领域常用的固定液，为减少后续处理，固定液优选使用可食用的原料配制而成。在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，所述固定液为乙醇和乙酸的混合液。
37.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，所述固定液中，乙醇的体积浓度为
75%；乙酸的体积浓度为2～5%。
38.在一些丝蛋白仿生取向生物支架的实例中，其用于培养动物细胞，所述动物细胞选自成肌细胞、肌肉卫星细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、脂肪前体细胞、成体干细胞和多能干细胞。所述细胞包括但不限于肌细胞、肝细胞、成骨细胞、成纤维细胞、成脂细胞、造牙本质细胞、成体神经元祖细胞、神经干细胞、来自脑室下前脑区的多个多潜能干细胞、室管膜神经干细胞、造血干细胞、肝造血干细胞、骨髓干细胞、脂肪的成纤维细胞、脂肪干细胞、产生多个胰岛细胞的干细胞、胰源性多能产生胰岛干细胞、间质干细胞、胎盘细胞、骨髓基质细胞、肌肉侧群细胞、骨髓来源的回收细胞、血液来源的间质前体细胞、骨髓来源的侧群细胞、肌肉前体细胞、循环的骨骼干细胞、神经祖细胞、多潜能成体祖细胞、中胚层祖细胞、脊髓祖细胞及孢子样细胞及任何组合所组成的群组。
39.下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。
40.实施例1生物支架的制备：1)用水配置经过脱胶的丝素蛋白，形成6%丝素蛋白水溶液；2)用1%的食用碱na2co3水溶液配置5%酵母蛋白水溶液；3)上述丝素蛋白水溶液与酵母蛋白水溶液按照质量比为2：1～1：3进行混合，形成均匀蛋白溶液；4)将蛋白溶液倒入模具中，放置于-80℃乙醇液氮混合液中，静置10min，使蛋白溶液彻底冻住，经过冻干机冻干水分后，获得未固定的生物支架；5)将未固定的生物支架加入75%乙醇和2%食用乙酸，浸泡2h固定；用pbs除去酸碱，调至中性，得到仿生取向生物支架。
41.所制备的一种应用于细胞培养肉的可食用的酵母蛋白丝素蛋白仿生取向生物支架，其普通光学照片如图1所示。从图1中可以所制备的定向冻干支架具有明显的取向纹理，且保持较明显的多孔结构。
42.细胞培养：细胞代数不超过6代的小鼠成肌细胞c2c12，培养于高糖培养基/胎牛血清（dmem/fbs）培养基中，所述培养基含10�s和1%三抗。细胞培养于37℃，5%co2培养箱中。待细胞在培养皿中达到80%覆盖率后，经过胰蛋白酶消化和离心，重悬获得细胞分散液。经过计数，分散的细胞为105cells/ml的溶液备用。
43.本实施例所制备仿生支架，泡在75%医用酒精进行灭菌。同时将体系放于紫外灭菌灯进行灭菌处理。然后在生物安全柜中用pbs清洗5次，每次5min。移除pbs后，将细胞悬液接种于生物支架。使细胞贴壁生长。细胞培养于37℃，5%co2培养箱中。
44.细胞表征：待细胞培养3d后，加入适当体积的calcein am/pi检测工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育30min。孵育结束后，在荧光显微镜下观察染色效果(calcein am为绿色荧光，ex/em=494/517nm；pi为红色荧光，ex/em=535/617nm)。
45.实验结果(图2)显示所有细胞呈现绿色荧光，这说明细胞的存活率超过95%以上，且细胞在支架上的黏附密度高，实验结果显示该定向冻干支架具有良好的细胞相容性，可
促进细胞的黏附生长。
46.实施例2生物支架的制备：1)用水配置经过脱胶的丝素蛋白，形成6%丝素蛋白水溶液；2)用1%的食用碱na2co3水溶液配置5%酵母蛋白水溶液；3)用2%的食用碱na2co3水溶液配置5%大豆分离蛋白溶液；4)上述丝素蛋白、酵母蛋白、大豆分离蛋白溶液按照质量比为3：3：4进行混合，形成均匀蛋白溶液；5)将蛋白溶液倒入模具中，放置于-80℃乙醇液氮混合液中，静置10min，使蛋白溶液彻底冻住，经过冻干机冻干水分后，获得未固定的生物支架；6)将未固定的生物支架加入75%乙醇和2%食用乙酸，浸泡2h固定；用pbs除去酸碱，调至中性。
47.细胞培养：细胞代数不超过6代的小鼠成肌细胞c2c12，培养于高糖培养基/胎牛血清（dmem/fbs）培养基中，所述培养基含10�s和1%三抗。细胞培养于37℃，5%co2培养箱中。待细胞在培养皿中达到80%覆盖率后，经过胰蛋白酶消化和离心，重悬获得细胞分散液。经过计数，分散的细胞为105cells/ml的溶液备用。
48.本实施例所制备仿生支架，泡在75%医用酒精进行灭菌。同时将体系放于紫外灭菌灯进行灭菌处理。然后在生物安全柜中用pbs清洗5次，每次5min。移除pbs后，将细胞悬液接种于生物支架。使细胞贴壁生长。细胞培养于37℃，5%co2培养箱中。
49.细胞表征：待细胞培养3d后，加入适当体积的calcein am/pi检测工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育30min。孵育结束后，在荧光显微镜下观察染色效果(calcein am为绿色荧光，ex/em=494/517nm；pi为红色荧光，ex/em=535/617nm)。
50.实验结果(图3)显示所有细胞呈现绿色荧光，这说明细胞的存活率超过95%以上，且细胞在支架上的黏附密度高，实验结果显示该定向冻干支架具有良好的细胞相容性，可促进细胞的黏附生长。
51.实施例3生物支架的制备：1)用水配置经过脱胶的丝素蛋白，形成6%丝素蛋白水溶液；2)用1%的食用碱na2co3水溶液配置5%酵母蛋白水溶液；3)用75%的食用乙醇配置3%玉米醇溶蛋白溶液；4)上述丝素蛋白、酵母蛋白按照质量比为5：5进行混合，形成均匀蛋白溶液；5)将蛋白溶液倒入模具中，放置于-80℃乙醇液氮混合液中，静置10min，使蛋白溶液彻底冻住，经过冻干机冻干水分后，获得未固定的生物支架；6)将未固定的生物支架加入75%乙醇和2%食用乙酸，浸泡2h固定；用pbs除去酸碱，调至中性，得到固定的生物支架；7)将固定的生物支架浸泡于3%玉米醇溶蛋白中，使材料充分被玉米醇溶蛋白浸
润，20min后取出沥干，并用pbs清洗，使醇溶蛋白析出形成疏水性涂层。制备得到一种应用于细胞培养肉的可食用的酵母蛋白丝素蛋白仿生取向生物支架。
52.细胞培养：细胞代数不超过5代的猪原代细胞scs，培养于高糖培养基/胎牛血清（dmem/fbs）培养基中，所述培养基含10�s、1%三抗。细胞培养于37℃，5%co2培养箱中。待细胞在培养皿中达到80%覆盖率后，经过胰蛋白酶消化和离心，重悬获得细胞分散液。经过计数，分散的细胞为105cells/ml的溶液备用。
53.本实施例所制备仿生支架，泡在75%医用酒精进行灭菌。同时将体系放于紫外灭菌灯进行灭菌处理。然后在生物安全柜中用pbs清洗5次，每次5min。移除pbs后，将细胞悬液接种于生物支架。使细胞贴壁生长。细胞培养于37℃，5%co2培养箱中。
54.细胞表征：待细胞培养3d后，加入适当体积的calcein am/pi检测工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育30min。孵育结束后，在荧光显微镜下观察染色效果(calcein am为绿色荧光，ex/em=494/517nm；pi为红色荧光，ex/em=535/617nm)。
55.实验结果(图4)显示所有细胞呈现绿色荧光，这说明细胞的存活率超过95%以上，且细胞在支架上的黏附密度高，实验结果显示该定向冻干支架具有良好的细胞相容性，可促进细胞的黏附生长。
56.以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。