一种高产红曲黄色素不产橙色素的红曲霉固态发酵方法

1.本发明属于微生物发酵技术领域。更具体地，本发明涉及一种红曲霉固态发酵方法，且利用该方法能达到高产红曲黄色素而不产红曲橙色素的目的，为黄色素的分离纯化及制备提供便利。


背景技术：

2.红曲色素(monascus pigments，mps)是丝状真菌红曲菌产生的次生代谢产物，在我国用于食品着色已经有两千多年的历史。随着一些合成食用色素毒性的不断发现，健康、安全的天然食用色素越来越受到青睐。红曲色素作为一种天然微生物色素，不仅具有安全性好、产量高、生产成本低、色调丰富(从黄到红)、溶解性好等优点，由于其食用安全性和药理活性，红曲色素在食品和药品领域的使用量迅速增加。
3.《2011-2014年红曲市场需求预测》研究显示，仅四年的时间，人们对红曲的需求量增长了40.5％。红曲色素主要盛行于东亚国家，尤其是中国，估计年产量就高达2万吨，超过10亿人在日常生活中食用含有红曲色素相关产品的食物。红曲色素有6种主要色素组分，分别为2种黄色素：红曲素(monascin)和安卡红曲黄素(ankaflavin)；2种橙色素：红斑红曲素(rubropunctatin)和红曲玉红素(monascorubrin)；2种红色素：红斑红曲胺(rubrop unctamine)和红斑玉红胺(monascorubramine)。在生产、应用方面主要以着色能力强的红色素为主，橙、黄色素应用相对较少，而红曲黄色素被证明具有抗癌、抗微生物、抗肥胖、抗炎症、抗氧化等多种生理活性功能，但黄色素产量与其它色素相比较低，而人们对黄色素需求量已达到市场需求比的60％。所以对红曲黄色素的开发研究在食品、保健品行业具有极广阔的商业前景。
4.目前，还没有一种发酵技术可以生产单一的红曲色素组分，不同红曲色素组分通常以混合物形式存在于发酵产物中，红曲色素也通常以混合物形式应用于食品工业。由于发酵产物中橙黄色素分离制备难度大、成本高，因此通过控制培养基组分和发酵培养条件来调节红曲黄橙色素的比例，甚至抑制其中某一色素的生成成为红曲研究者的研究热点。从而为单一色素的分离纯化及制备提供便利。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种高产红曲黄色素不产橙色素的红曲霉固态发酵方法，该方法以橙色红曲霉菌为出发菌株，发酵培养基以大米做底物并外加氮源硫酸铵进行红曲霉发酵。本发明能够达到高产红曲黄色素，不产红曲橙色素的目的。
6.为了实现上述目的，所采用的技术方案如下：一种高产红曲黄色素不产橙色素的红曲霉固态发酵方法，包括如下步骤：
7.一种高产红曲黄色素不产橙色素的红曲霉固态发酵方法，包括红曲霉的种子液培养和大米固态发酵培养，所述固态发酵培养基中的氮源为硫酸铵。
8.其中，所述红曲菌为橙色红曲菌(m.aurantiacus)。
9.所述的发酵培养基中的硫酸铵添加量为0.5％-2.5％。
10.所述的红曲霉发酵培养基的最优组成为30g沥干水分后的湿米，硫酸铵的添加量为1％。
11.所述的发酵培养最佳条件工艺参数为：接种量6ml、装米量30g、发酵时间11d。培养温度为30℃。
12.所述的红曲霉种子液为葡萄糖6g，蛋白胨2g，nano31.0g，mgso4·
7h2o 0.5g，kh2po41.0g，ph自然，加蒸馏水至100ml，121℃灭菌20min，向上述培养基接种从麦芽汁琼脂斜面上洗脱的红曲菌孢子悬浮液200μl，30℃、180r/min的条件下恒温培养。
13.所述的红曲菌孢子悬浮液的浓度为1
×
105个/ml，种子液的最佳培养时间为48h。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：在发酵培养基中添加硫酸铵，以达到高产红曲黄色素而不产红曲橙色素的目的，从而为黄色素的分离纯化及制备提供了便利。此外本方法操作简单，生产成本较低且环境友好。
附图说明
15.图1为接种量对橙色红曲菌产黄色素的影响。
16.图2为装米量对橙色红曲菌产黄色素的影响。
17.图3为发酵时间对橙色红曲菌产黄色素的影响
18.图4为本发明对照例产红曲色素种类和产量的hplc检测图。
19.图5为本发明实施例2产红曲色素种类和产量的hplc检测图。
具体实施方式
20.下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
21.实施例1菌种活化：取m.aurantiacus菌种接种到斜面培养基上进行培养，其中，斜面培养基各组分为麦芽汁、琼脂和水，且其中麦芽汁的糖度为14
°
bx，琼脂添加量为20g/l。培养条件为：培养温度30℃，培养时间7d。种子液的制备：葡萄糖6g，蛋白胨2g，nano31.0g，mgso4·
7h2o 0.5g，kh2po41.0g，ph自然，加蒸馏水至100ml，121℃灭菌20min，取100ml种子培养基灭菌冷却后接种从斜面培养基上用无菌水洗下并调整为1
×
105个孢子/ml红曲菌的菌悬液200μl，然后在恒温摇床中进行培养，培养温度为30℃，摇床转速为180r/min，培养时间为48h，即得到种子液。
22.实施例2红曲霉发酵培养基组成为30g沥干水分的湿米，硫酸铵的添加量为1％。选取实施例1种子培养基及培养时间后，按6％的接种量(v/w)，设定培养温度为30℃，进行大米固态发酵实验，测定发酵产品黄色素的色价。分别考察不同的接种量(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0ml)、装米量(20、25、30、35、40g)以及培养时间(7、9、11、13、15d)对大米固态发酵产黄色素的影响，以最后所得的红曲黄色素色价为考察指标，对发酵条件进行单因素试验，每组试验重复3次，试验结果取其平均值。
23.对照例
同实施例2，其区别在于，固态发酵培养基中未添加硫酸铵。
24.高效液相色谱(hplc)条件利用高效液相色谱对发酵产物进行测定与分析，方法如下：色谱柱：c18色谱柱检测器：dad(二极管阵列检测器)流动相：a相：甲酸水(0.1％)，b相：乙腈，水相及有机相分别用水膜和有机相膜过滤，之后超声脱气30min，梯度洗脱，方法见表1。进样量：20μl流速：1ml/min检测波长：385nm、475nm、505nm、410nm柱温：25℃表1色素hplc梯度洗脱方法对照例产黄色素种类和产量的hplc检测如图4所示，实施例2产黄色素种类和产量的hplc检测如图5所示。实施例2中发酵产物的红曲黄色素的色价为5107.4
±
35.4u/g，经计算优化后橙色红曲菌产黄色素y1产量提高39.6％，y2提高了24.2％，且发酵产物没有红曲橙色素的产生。


技术特征：
1.一种高产红曲黄色素不产橙色素的红曲霉固态发酵方法，包括红曲霉的种子液培养和大米固态发酵培养，所述固态发酵培养基中的氮源为硫酸铵，所述的固态发酵培养基中的硫酸铵添加量为0.5％-2.5％。2.根据权利要求1所述的一种高产红曲黄色素不产橙色素的红曲霉固态发酵方法，具体如下：红曲霉种子液培养：葡萄糖6g，蛋白胨2g，nano31.0g，mgso4·
7h2o 0.5g，kh2po41.0g，ph自然，加蒸馏水至100ml，121℃灭菌20min，向上述培养基中接种从麦芽汁琼脂斜面上洗脱的红曲菌孢子悬浮液200μl，30℃、180r/min的条件下恒温培养；红曲霉大米固态发酵培养：大米清洗干净，用自来水浸泡6h，取30g沥干水分的湿米装于250ml三角瓶中，添加氮源，121℃灭菌20min后，选择最佳的培养条件培养。3.根据权利要求2所述的一种高产红曲黄色素不产橙色素的红曲霉固态发酵方法，所述红曲菌为橙色红曲菌(monascus.aurantiacus)。4.根据权利要求2所述的一种高产红曲黄色素不产橙色素的红曲霉固态发酵方法，红曲菌孢子悬浮液的浓度为1
×
105个/ml，红曲霉种子液的最佳培养时间为48h。5.根据权利要求1所述的一种高产红曲黄色素不产橙色素的红曲霉固态发酵方法，所述固态发酵培养基中的硫酸铵添加量为1％。6.根据权利要求2所述的一种高产红曲黄色素不产橙色素的红曲霉固态发酵方法，其培养最佳条件工艺参数为：接种量6ml、装米量30g、发酵时间11d，培养温度为30℃。7.根据权利要求2所述的一种高产红曲黄色素不产橙色素的红曲霉固态发酵方法，在发酵培养基中添加硫酸铵，经最佳条件培养后，可以达到高产红曲黄色素而不产红曲橙色素的目的。

技术总结
本发明提供了一种高产红曲黄色素不产橙色素的红曲霉固态发酵方法，包括红曲霉的种子液培养和大米固态发酵培养，所述固态发酵培养基中的氮源为硫酸铵，所述的发酵培养基中的硫酸铵添加量为1％，通过对接种量、装米量、发酵时间三个影响因素进行优化，进而确定该菌株的最佳固态发酵条件，本发明的技术方法能达到高产红曲黄色素，不产红曲橙色素的目的。从而为红曲黄色素的分离纯化及制备提供了便利。红曲黄色素的分离纯化及制备提供了便利。


技术研发人员：王玉荣 张蕊 余济源 李伟东 邢沄翰 马波娇 尉婉君
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2020.11.17
技术公布日：2022/5/17