一种电致化学发光分子印迹传感器及其制备方法及应用

1.本发明涉及分子检测领域，尤其是一种电致化学发光分子印迹传感器及其制备方法及应用。


背景技术：

2.食品安全、环境污染均与生命安全、身体健康有着密切关联，因此相关部门必须切实做好食品和环境污染物的检测工作，而快速检测技术具有明显优势，可以在保障检测结果的同时缩短检测时间；
3.分子印迹技术是一种依赖于分子识别的方法，它通过分子印迹聚合物(mip)含有的三维结构空腔对形状及结构与模板相同的分子的结合实现特异性检测；电致化学发光(electrochemiluminescence,ecl)因具有低背景信号、高灵敏度和快速响应的独特优势，目前已成为一种优越的分析方法应用于生物分子的痕量目标检测、临床诊断、环境和食品监测等研究；分子印迹电化学发光传感器(mip-ecl)是ecl和mip的理想集成，现有技术中，分子印迹电化学发光传感器的mip本体存在模板嵌入较深，难以接近结合位点和选择性低的问题，其ecl活性物的灵敏度、稳定性低，导致分子印迹电化学发光传感器的应用效果差；
4.为此，本发明提出了一种电致化学发光分子印迹传感器及其制备方法及应用。


技术实现要素：

5.为提供一种对污染物分子具有较高选择性、较高的灵敏度且操作简便的现场、快速筛检手段，本发明提出了一种电致化学发光分子印迹传感器及其制备方法及应用。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.一种电致化学发光分子印迹传感器，包括钌纳米棒修饰的纳米纤维膜状的聚丙烯腈电极以及分布在聚丙烯腈电极上的分子印迹聚合物，所述钌纳米棒具有针状结构。
8.进一步地，所述分子印迹聚合物包括以盐酸多巴胺为单体自聚合生成的分析模板，所述分析模板上设有检测靶标的容置空间，所述检测靶标包括玉米赤酶烯酮、槲皮素、阿托品或磺胺类抗生素。
9.一种电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，包括如下步骤：将10％-15％wt的聚丙烯腈溶液通过静电纺丝制备得到聚丙烯腈电极；
10.将ru(bpy)
32
分散于有机溶剂中得到1-3mm ru(bpy)
32
溶液，将ru(bpy)
32
溶液滴加在聚丙烯腈电极上，待有机溶剂挥发后得到钌纳米棒修饰的聚丙烯腈电极；
11.将盐酸多巴胺溶解于tris-hcl缓冲液中，再加入检测靶标，得到混合溶液；将所述钌纳米棒修饰的聚丙烯腈电极置于混合溶液中浸泡，得到中间产物；清洗中间产物，用醇溶剂洗脱中间产物上的检测靶标，得到电致化学发光分子印迹传感器。
12.进一步地，所述聚丙烯腈溶液中的溶剂包括n,n-二甲基甲酰胺；
13.所述有机溶剂包括乙腈和异丙醇的混合溶剂或乙腈和丙酮的混合溶剂；所述醇溶剂包括甲醇；
14.检测靶标包括玉米赤酶烯酮、槲皮素、阿托品或磺胺类抗生素。
15.进一步地，所述聚丙烯腈溶液的制备步骤包括：将聚丙烯腈粉末分散在n,n-二甲基甲酰胺中，搅拌8-24h，得到聚丙烯腈溶液。
16.进一步地，所述静电纺丝包括如下步骤：将聚丙烯腈溶液置于注射器中，注射器上的喷射针头距离接收板15cm，在18kv的电压下纺丝5-12h，得到聚丙烯腈电极。
17.进一步地，所述乙腈和异丙醇的混合溶剂中乙腈与异丙醇的体积比为5:1；所述乙腈和丙酮的混合溶剂中乙腈与丙酮的体积比为5:1。
18.进一步地，所述盐酸多巴胺的质量为20-40mg；所述tris-hcl缓冲液的体积为10-15ml，ph为8-10.0；所述检测靶标为2-5ml 5-10mm的槲皮素溶液。
19.进一步地，钌纳米棒修饰的聚丙烯腈电极置于40-60℃的混合溶液中浸泡，浸泡时间为6-12h。
20.上述的电致化学发光分子印迹传感器在食品检测或环境污染物检测中的应用、上述的制备方法制备得到的电致化学发光分子印迹传感器在食品检测或环境污染物检测中的应用或上述的制备方法制备得到的电致化学发光分子印迹传感器用于检测玉米赤酶烯酮。
21.本发明的有益效果：
22.1、制备工艺简单：pane-ru/mip的制备分为两步：包括溶剂蒸发法固载runps和自聚合法制备mip；溶剂蒸发法是一种简便而稳定的固定runps的方法；通过有机溶剂溶解ru(bpy)
32
，并滴于pane，有机溶剂挥发后形成pane-ru。以da为功能单体制备mip，不需要交联剂与引发剂，碱性条件下一步法直接自聚合，制备工艺简单；
23.2、分析性能优越：
24.1)灵敏度：pane作为柔性电极首次应用于ecls,其比表面积大、孔隙率高、可修饰大量runps，且具有针状纳米结构的runps发光效率极高；pane-runps具有稳定且强的ecl信号；因此，pane-ru/mip识别并结合污染物分子后，相同浓度的污染物分子引起的ρi
ecl
更大，则所构建的传感器具有高灵敏度；
25.2)选择性：mip通过含有的三维结构空腔对形状及结构与模板相同的分子的结合实现特异性检测；因此，mip具有较好的选择性。此外，pane具有多孔表面、较高比表面积和孔隙率；将分子印迹聚合物压印于pane表面，有利于压印均匀，分散印迹位点，且模板嵌入较浅，靶标易于接触结合位点，因此pane-mip具有强的吸附能力和良好的选择性；
26.3)稳定性：pane-ru/mip具有良好的稳定性，pane通过静电吸附ru(bpy)
32
，促进了ru(bpy)
32
在其表面自组装形成稳定的runps；pane与runps相互结合，通过协同作用，提高了pane-ru化学稳定性；将其下保存在室温下15天后，pane-ru的ecl信号几乎不变，在30天后降到89.5％以下，因此说明pane-ru的稳定性较好；mip作为分子识别元件，相较于抗体、适体等生物分子，易储存，可长期保存；
27.4)实用性：pane-ru/mip作为柔性分析模板具有柔软、弹性和弯曲的特性，可根据测量条件的要求任意放置，适用于很多场景和环境。此外，pane-ru/mip制备方法简单、绿色环保，所制备的分子模板操作简便，适用于现场实际样品快速检测；pane-ru/mip柔性分析模板为生物分子的现场检测提供了一种途径。
28.5)通用性：以da为功能单体，检测靶标为模板制备mip。由于da结构中带有苯环和
氨基，因此能够与苯环上携带氨基、羟基等基团的靶标(如zen、阿托品、磺胺类抗生素等)形成mip，具有一定的通用性，因此，以da为功能单体的mip对一类污染物具备通用性。
29.6)再生性：mip结构稳定，在甲醇、超纯水中清洗不影响其活性，能够保持其对靶标的特异性。将pane-ru/mip浸入含污染物分子样品中孵育8分钟后测量其ecl降低值，测量后将其浸入洗脱溶液(甲醇)中20min，洗脱污染物分子，干燥后再检测。9次循环使用后，ρi
ecl
基本没有太大变化。在第十次测定时ρi
ecl
降至新鲜制备电极的89.5％以下。结果表明，使用pane-ru/mip能够循环检测9次，具有良好的再生性。
附图说明
30.图1为本发明实施例1的pane的fesem图；
31.图2为本发明实施例1的pane-ru的fesem图；
32.图3为本发明实施例1的pane-ru/mip
before
的fesem图；
33.图4为本发明实施例1的pane-ru/mip
after
的fesem图；
34.图5为本发明实施例1的pane-ru/mip横截面的fesem图；
35.图6为实施例1中各物质在1mm kfe(cn)
63-/4-的cv图谱，其中曲线a为pane的cv图谱、曲线b为pane-ru的cv图谱、曲线c为pane-ru/mip
before
的cv图谱、曲线d为pane-ru/mip
after
的cv图谱、曲线e为pane-ru/mip(zen)的cv图谱；
36.图7为本发明实施例1中相关物质的ρi
ecl
图，其中a为pane-ru的ρi
ecl
图、b为ge-ru的ρi
ecl
图；
37.图8为本发明实施例1的pane吸附runps的吸附率；
38.图9为本发明的pane-ru/mip和pane-ru/nip在1nm和100pm zen的ρi
ecl
图；
39.图10为本发明的pane/mip-ru、pane-ru/mip、ru@pane/mip的ρi
ecl
图；
40.图11为本发明的盐酸多巴胺自聚合时间优化图；
41.图12为本发明的pane-ru/mip
before
洗脱虚拟模板时间优化图；
42.图13为本发明实施1的pane-ru/mip孵育靶标zen时间优化；
43.图14为本发明实施例1的pane-ru/mip检测zen的再生性；
44.图15为本发明实施例1的pane-ru/mip在1pm,10pm,100pm,1nm的zen中的ρi
ecl
。
具体实施方式
45.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
46.一种电致化学发光分子印迹传感器的制备方法，包括如下步骤：将10％-15％wt的聚丙烯腈溶液通过静电纺丝制备得到聚丙烯腈电极；
47.在一些实施方式中，丙烯腈溶液中的溶剂可以为n,n-二甲基甲酰胺，聚丙烯腈溶液的制备步骤包括：将聚丙烯腈粉末分散在n,n-二甲基甲酰胺中，搅拌8-24h，得到聚丙烯腈溶液；
48.在一些实施方式中，静电纺丝的操作步骤可以为：将10％-15％wt的聚丙烯腈溶液装在50ml注射器中，注射器顶部连接20号喷射针头，距离接收板15cm，在18kv电压下静电纺丝，纺丝5-12h，于铝箔上得到聚丙烯腈电极；
49.将ru(bpy)
32
分散于有机溶剂中得到1-3mm ru(bpy)
32
溶液，将ru(bpy)
32
溶液滴加在聚丙烯腈电极上，待有机溶剂挥发后得到钌纳米棒修饰的聚丙烯腈电极；
50.在一些实施方式中，有机溶剂可以为乙腈和异丙醇的混合溶剂或乙腈和丙酮的混合溶剂；例如，乙腈和异丙醇的混合溶剂中乙腈与异丙醇的体积比为5:1；乙腈和丙酮的混合溶剂中乙腈与丙酮的体积比为5:1；
51.将盐酸多巴胺溶解于tris-hcl缓冲液中，再加入检测靶标(检测靶标为苯环上携带氨基、羟基等基团，例如，玉米赤酶烯酮、槲皮素、阿托品或磺胺类抗生素)，得到混合溶液；将所述钌纳米棒修饰的聚丙烯腈电极置于混合溶液中浸泡，得到中间产物；清洗中间产物，用醇溶剂(例如，甲醇)洗脱中间产物上的检测靶标，得到电致化学发光分子印迹传感器；
52.在一些实施方式中，钌纳米棒修饰的聚丙烯腈电极可置于40-60℃的混合溶液中浸泡，浸泡时间为6-12h；
53.在一些实施方式中，盐酸多巴胺和tris-hcl缓冲液按照一定的比例添加，例如，盐酸多巴胺的质量为20-40mg，tris-hcl缓冲液的体积为10-15ml，ph为8-10.0；按照上述实施方式，当检测靶标为2-5ml 5-10mm的槲皮素溶液时，所制得的印迹传感器可用于检测玉米赤酶烯酮。
54.基于上述制备方法，本发明提出了上述的制备方法制备得到的电致化学发光分子印迹传感器在食品检测或环境污染物检测中的应用或上述的制备方法制备得到的电致化学发光分子印迹传感器用于检测玉米赤酶烯酮。
55.本发明还提出了一种电致化学发光分子印迹传感器，包括钌纳米棒修饰的纳米纤维膜状的聚丙烯腈电极以及分布在聚丙烯腈电极上的分子印迹聚合物，所述钌纳米棒具有针状结构，所述分子印迹聚合物包括以盐酸多巴胺为单体自聚合生成的分析模板，所述分析模板上设有检测靶标的容置空间，所述检测靶标包括玉米赤酶烯酮、槲皮素、阿托品或磺胺类抗生素等；
56.上述电致化学发光分子印迹传感器在食品检测或环境污染物检测中的应用。
57.以下具体实施例中，为了使得表述简便，本发明对一些物质的描述采取了简化的方式，其具体的名称或物质如下：
58.分子印迹电化学发光传感器(mip-ecl)、联吡啶钌(ru(bpy)
32
)、钌纳米棒(runps)、聚丙烯腈柔性电极(pane)、电致化学发光扫描(ecl)、分子印迹聚合物(mip)、盐酸多巴胺(da)、聚丙烯腈(pan)、runps修饰的pane(pane-ru)、mip修饰的pane-ru(pane-ru/mip)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、非分子印迹聚合物(nip)、pane-ru/mip洗脱前(pane-ru/mip
before
)、pane-ru/mip洗脱后(pane-ru/mip
after
)、掺杂ru(bpy)
32
的聚丙烯腈电极(ru@pane)、mip修饰的ru@pane(ru@pane/mip)、mip修饰的pane(pane/mip)、runps修饰的pane-mip(pane/mip-ru)、槲皮素(qct)、三丙胺(tpra)、银-氯化银参比电极(ag/agcl)、场发射扫描电镜(fesem)、循环伏安法(cv)、玉米赤酶烯酮(zen)；
59.以下实施例中以槲皮素(qct)为模板，盐酸多巴胺(da)为单体，通过自聚合方法与runps修饰的pane结合构建玉米赤酶烯酮(zen)柔性分析模板。
60.实施例1
61.①
pane的制备：将1.0g白色pan粉末分散在10ml dmf中磁力搅拌12h，形成10％wt
均匀透明的pan纺丝液；将纺丝液装在50ml注射器中，注射器顶部连接20号喷射针头，距离接收板15cm，在18kv电压下静电纺丝，纺丝8h，于铝箔上得到pane。将pane裁剪成面积为1*1cm2备用。
62.②
pane-ru的制备：将3.5mg ru(bpy)
32
分散于5ml乙腈和1ml异丙醇的混合有机溶剂中，吸取50μl上述溶液，滴于pane上，待溶剂挥发，runps修饰于pane(pane-ru),室温下避光保存。
63.③
pane-ru/mip的制备：采用简单的自聚合法制备mip，将25mgda溶于10ml tris-hcl缓冲液(ph为8.5)，再加入5ml 6mm qct溶液，震荡均匀后加入两片pane-ru，50℃下摇晃6h,制备pane-ru/mip。用超纯水冲洗，干燥后用甲醇洗脱pane-ru/mip
before
中的qct，形成含空腔的pane-ru/mip
after
，干燥后用于ecl检测。
64.实施例2
65.①
pane的制备：将1.5g白色pan粉末分散在10ml dmf中磁力搅拌12h，形成15％wt均匀透明的pan纺丝液；将纺丝液装在50ml注射器中，注射器顶部连接20号喷射针头，距离接收板15cm，在18kv电压下静电纺丝，纺丝8h，于铝箔上得到pane。将pane裁剪成面积为1*1cm2备用。
66.②
pane-ru的制备：将3.5mg ru(bpy)
32
分散于5ml乙腈和1ml丙酮的混合有机溶剂中，吸取50μl上述溶液，滴于pane上，待溶剂挥发，runps修饰于pane(pane-ru),室温下避光保存。
67.③
pane-ru/mip的制备：采用简单的自聚合法制备mip，将25mgda溶于10ml tris-hcl缓冲液(ph为8.5)，再加入5ml 6mm qct溶液，震荡均匀后加入两片pane-ru，50℃下摇晃6h,制备pane-ru/mip。用超纯水冲洗，干燥后用甲醇洗脱pane-ru/mip
before
中的qct，形成含空腔的pane-ru/mip
after
。
68.④
靶标的识别与检测：使用一室三电极体系，工作电极为实施例1中制备的pane-ru/mip，对电极为铂丝电极(pt)，参比电极是ag/agcl(饱和kcl溶液)，在含有不同浓度zen的10mmol/l pbs(ph为7.4)(含0.1mmol/l tpra)进行ecl检测。在0至1.4v的连续电位扫描范围内以100mv/s速率施加循环伏安(cv)扫描模式正向扫描，光电倍增管施压700v，放大系数设定为4，同时记录ecl和cv曲线。
69.对pane、pane-ru、pane-ru/mip
before
和pane-ru/mip
after
分别进行了微观形态的表征；
70.由pane的场发射扫描电镜图谱(fesem)如图1可以看出，pane呈现出均匀的相互交叉的纤维状结构，直径为200
±
20nm；
71.当runps修饰于pane后如图2，呈现出棒状结构，表面粗糙，大小均匀；通过一步自聚合形成了pane-ru/mip
before
如图3，pane表面覆盖一层均匀的薄膜；
72.当qct被洗脱后如图4，pane-ru/mip
after
出现许多空腔。
73.对pane-ru/mip的制备过程应用cv进行表征，pane具有较好的导电性如图6中曲线a，当修饰runps形成pane-ru后，runps具有良好的导电性，其cv信号进一步增强如图6中曲线b；通过自聚合多巴胺形成的pane-ru/mip
before
，其cv信号变化不大如图6中曲线c；洗脱qct后，形成空腔，展现出最强的cv信号如图6中曲线d；最后检测zen时，cv信号降低如图6中曲线e；表明pane-ru/mip的成功制备。
74.比较了pane和玻碳电极(ge)负载runps的能力，通过溶剂蒸发法将runps修饰于pane和ge，比较pane-ru和ge-ru的ecl信号强度及其稳定性如图7。pane-ru比ge-ru的ecl信号强且稳定。此外，pane吸附runps的吸附率可达到86％如图8，因此，选择pane-ru作为柔性模板。
75.对比例1
76.按照实施例1的方法，其它条件不变，在步骤
③
pane-ru/mip的制备中，用pbs缓冲溶液代替qct溶液加入到聚膜液中，制得非分子印迹(nip)修饰pane-ru(pane-ru/nip)。对比例1制备的pane-ru/nip与实施例1制备的pane-ru/mip相比，未形成zen的识别位点，因此无法特异性识别zen。对比例1制备的pane-ru/nip的ρi
ecl
远小于实施例1制备的pane-ru/mip，证明实施例1制备的传感器具有良好的特异性。
77.对比例2
78.按照实施例1的方法，其它条件不变，在步骤
①
pane的制备中，在10％wt均匀透明的pan纺丝液中添加1mm ru(bpy)
32
，制得ru@pane。使用相同方法，在ru@pane上自聚合mip形成ru@pane/mip。对比例2制备的ru@pane/mip与实施例1制备的pane-ru/mip相比，i
ecl
低，灵敏度差，说明溶剂蒸发法形成的钌纳米棒具有强而稳定的ecl信号。
79.对比例3
80.按照实施例1的方法，其它条件不变，改变步骤
②
和步骤
③
的顺序，先在pane上自聚合mip制得pane/mip，再通过溶剂蒸发法制得pane/mip-ru。对比例3制备的pane/mip-ru与实施例1制备的pane-ru/mip相比，识别zen的空腔结构被runps破坏，特异性较差，说明实施例1制备的传感器具有良好的特异性。
81.比较实施例1制备的pane-ru/mip、对比例1制备的ru@pane/mip和对比例3制备的pane/mip-ru在zen溶液中的ρi
ecl
，以筛选具有高灵敏度的柔性模板。由图9可得出相较于pane/mip-ru和ru@pane/mip，pane-ru/mip的ρi
ecl
更大，响应更灵敏。ru@pane/mip中的钌是ru(bpy)
32
形式且被包覆于纤维中(对比例2)，故其i
ecl
和ρi
ecl
均最小；而pane/mip-ru的zen空腔被runps破坏(对比例3)，导致ρi
ecl
减小。因此选择pane-ru/mip作为柔性分析模板。
82.比较了pane-ru/mip和pane-ru/nip对zen的选择能力。图10结果表明，pane-ru/mip对zen的检测具有较高的选择性，而pane-ru/nip无识别位点(对比例1)，因此对比例1制得的pane-ru/nip没有选择性。
83.mip膜中形成结构相关结合位点的重要因素包括模板聚合时间、去除模板分子的合适的溶剂和洗脱时间，在2-24h内研究了da自聚合时间对ρi
ecl
的影响，根据图11中显示的结果，ρi
ecl
上升降到6h后，保持稳定，因此，模板聚合时间设定为6h。本发明以甲醇为洗脱试剂。pane-ru/mip
before
在温和摇晃条件下浸入甲醇溶液中0-60分钟如图12，发现i
ecl
在20min后达到最大值并保持恒定，因此选择20min作为最佳洗脱时间。
84.为了提高传感器的灵敏度，还在1.0nm zen溶液中仔细研究了不同的再结合时间。图13显示i
ecl
随着孵育时间的增加而降低，ρi
ecl
增加；到8min后，它达到最大值并保持稳定，表明pane-ru/mip的快速结合动力学，因此，8min被设置为最佳孵化时间。
85.pane-ru/mip的再生性也是传感器的重要性能，本发明将pane-ru/mip浸入含zen样品中孵育8分钟后测量其ecl降低值，测量后将其浸入甲醇溶液中20min,洗脱zen，干燥后再检测；重复检测10次，所获得的数据显示在图14中；前9次循环使用后，ρi
ecl
基本没有太大
变化，在第十次测定时ρi
ecl
降至新鲜制备电极的89.5％以下，结果表明，使用pane-ru/mip能够循环检测9次，具有良好的再生性。
86.pane-ru/mip检测zen的校准曲线研究，本发明将pane-ru/mip作为工作电极，分别在室温下在含1pm、10pm、100pm、1nm zen样品中孵育8分钟后测量其ecl降低值，并且获得的数据显示在图15中；pane-ru/mip检测zen在1pm-1nm范围内呈现良好的线性，且检测下限(lod)为0.5pm，结果表明，构建的pane-ru/mip传感器具有较好的灵敏度。
87.本发明通过静电纺丝制备的纳米纤维膜状聚丙烯腈电极具有多孔表面和横截面结构，是理想的压印材料，mip与纳米纤维膜状聚丙烯腈电极结合，可显著提高mip的选择性与灵敏度，利用溶剂蒸发法将ru(bpy)
32
修饰于电极，操作简单，且形成的runps的ecl信号稳定且强，通过静电纺丝制备导电的pan作为柔性聚丙烯腈电极(pane)，pane具有大的比表面积与mip结合可以增强分子印迹传感器的灵敏度，通过静电纺丝制备导电的纳米纤维膜与mip结合构建形成的传感器可长期保存，直接用于现场检测。
88.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。