一种炙枳实的质量检测方法与流程

1.本发明属于中药分析领域，具体涉及一种炙枳实的质量检测方法。


背景技术：

2.枳实是芸香科植物酸橙(citrus aurantium l.)及其栽培变种或甜橙(citrus sinensis osbeck)的干燥幼果。植物形态为常绿小乔木，有长刺。单叶互生，革质，叶柄有狭长形或倒心脏形的翼；叶片长椭圆形，有半透明油点；花排列成总状花序；花萼杯状，5裂；花瓣5，白色，长椭圆形；柑果圆形而稍扁，成熟时橙黄色。花期4-5月，果期6-11月。枳实呈半球形，少数为球形，直径0.5-2.5cm。外果皮黑绿色或暗棕绿色，具颗粒状突起和皱纹，有明显的花柱残迹或果梗痕，切面中果皮略隆起，厚0.3-1.2cm，黄白色或黄褐色，边缘有1-2列油室，瓤囊棕褐色，质地坚硬。气清香，味苦，微酸。主产于四川、江西、福建、江苏等地。枳实在《神农本草经》中作为中品收载，具有破气消积，化痰散痞的功效。主要用于积滞内停，痞满胀痛，泻痢后重，大便不通，痰滞气阻，胸痹，结胸，脏器下垂等。
3.枳实主要有效成分为生物碱，如辛弗林、n-甲基酪胺等，黄酮类成分，如橙皮苷、柚皮素和柚皮苷等。炙枳实始载于《伤寒杂病论》的经典名方大柴胡汤中，炙枳实与大黄合用，发挥了内泻阳明热结的功效，但原方中并未明确炙法的工艺。枳实炮制后有缓和生品峻烈之性，免伤正气的作用，枳实历代有多种炮制方法，近代炮制方法主要有炒黄、炒炭、蜜炙、砂烫、酒炙、醋炙等，然而仅麸炒收载在《中国药典》(2020年版)中。
4.众所知周，中药的炮制对其相关产品的品质具有重大影响，是其工业化生产的关键步骤，也关系到产品后续的加工，不良炮制工艺导致有效成分流失严重，饮片质量不可控，影响饮片的临床疗效。为了解决这一问题发明人开发了一种大柴胡汤功效q-markers精准分析发现与特定功效对应的活性成分，进而以这些活性成分作为评价指标优化炙枳实炮制工艺的方法，并筛选出了能够最大程度保留炙枳实中与大柴胡汤内泻阳明热结的功效密切相关的活性成分的炙枳实制备方法。
5.但是，解决了上述问题，又导致一个新的问题随之而来，目前尚未建立针对采用上述特定炮制方法制备的炙枳实饮片的指标性成分含量测定方法与标准，没有定量质控指标，就不能对这种炙枳实饮片内在质量进行监控，也不能反映出这种炙枳实饮片质量的优劣，不利于对其进行质量控制。在《中国药典》(2020年版)中收载的枳实和枳实饮片的质量检测方法中仅对单一成分辛弗林的含量进行了检测，但根据本发明人的研究这种活性成分并不是炙枳实在大柴胡汤方剂中发挥作用的主要药效成分。
6.因此，如果能够建立一种炙枳实的质量检测方法，使得同时测定采用特定炮制方法制备的炙枳实中多种目标活性成分的含量，就能够更加全面、准确地评价该炙枳实的质量，从而最大限度地保证使用这种炙枳实的大柴胡汤的临床疗效。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题，本发明建立了一种适用于采用特定炮制方法制备的炙枳
实的质量检测方法，该质量检测方法利用高效液相色谱(hplc)，测定所述炙枳实中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林4种活性成分的含量，该质量检测方法简单、准确、重现性好，可为全面评价和控制大柴胡汤专用炙枳实饮片的质量提供依据。
8.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
9.一种炙枳实的质量检测方法，所述方法包括：采用高效液相色谱(hplc)测定橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷和辛弗林的含量，
10.其中，所述炙枳实的制备方法包括以下步骤：
11.(1)取生枳实片，净制，阴干后备用；
12.(2)将适量生枳实切片平铺于烤盘上，预热烘箱，以150℃-200℃的烘烤温度，烤制5-30min，待枳实饮片卷翘，边缘隆起，穰囊突出，有油迹，颜色棕黄，闻之芳香，味苦，取出，放凉，即得。
13.作为可选方式，在上述质量检测方法中，所述炙枳实的制备方法为大柴胡汤用炙枳实的制备方法，采用所述方法制备得到的炙枳实显著增强大柴胡汤内泻阳明热结的功效。
14.作为可选方式，在上述质量检测方法中，所述烘烤温度为200℃，烤制时间为8min。
15.作为可选方式，在上述质量检测方法中，
16.柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林含量测定的色谱条件包括：
17.采用ods c
18
色谱柱，色谱柱规格4.6mm
×
250mm，5μm；
18.流动相：a相：乙腈，b相：乙腈：水(其中，水相制备方法如下：取十二烷基硫酸钠2.0g，溶于1000ml水中，滴加磷酸1滴)＝20∶80，流速：1ml/min；柱温：25℃；紫外检测器，检测波长为283nm；进样量10μl；
19.并且，洗脱梯度如下表所示：
[0020][0021]
作为可选方式，在上述质量检测方法中，在橙皮苷、辛弗林的含量测定中：
[0022]
(1)对照品溶液的制备：精密称定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林标准品适量，置于10ml容量瓶中，加入甲醇溶解，定容，混匀，制得0.708mg/ml柚皮苷、0.374mg/ml橙皮苷、0.783mg/ml新橙皮苷与0.459mg/ml辛弗林的混合标准品溶液，备用；
[0023]
(2)供试品溶液的制备：取采用权利要求1至3中所述制备方法制备得到的并且过四号筛的炙枳实粉末0.2g，精密称定，置于锥形瓶中，加入25ml甲醇，称重后超声提取45min，超声功率150w，频率40hz，待超声结束后，锥形瓶放置降至室温，再称定其质量，用溶剂补足减少的重量，摇匀，抽滤，滤液以0.45μm微孔滤膜滤过即为供试品溶液。
[0024]
作为可选方式，在上述质量检测方法中，所述炙枳实按干燥品计算柚皮苷不得少于8.0％，橙皮苷不得少于2.4％，新橙皮苷不得少于6.4％，以及辛弗林不得少于1.2％。
[0025]
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
[0026]
本发明首次建立了一种适用于特定炮制方法制备的炙枳实的质量检测方法，该检
测方法能够测定针对大柴胡汤内泻阳明热结的功效的药效标志物(q-markers)橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷，以及炙枳实中含量较高的活性成分辛弗林的含量，色谱峰峰形良好，分离度较高，检测时间较短。该质量检测方法简单、准确、重现性好，可为全面评价和控制大柴胡汤专用炙枳实饮片的质量提供依据。
附图说明
[0027]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0028]
图1：大柴胡汤功效q-markers精准分析的流程图。
[0029]
图2：枳实供试品溶液。1.柚皮苷，2.橙皮苷，3.新橙皮苷，4.辛弗林。
具体实施方式
[0030]
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
[0031]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
[0032]
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
[0033]
实施例1：与大柴胡汤内泻阳明热结功效对应的q-markers的筛选
[0034]
采用如图1中所示的流程对与大柴胡汤内泻阳明热结功效对应的q-markers进行筛选，得出与枳实相关的q-markers，结果如下表1所示。
[0035]
表1：涉及枳实的与大柴胡汤内泻阳明热结功效对应的q-markers
[0036][0037]
注：加粗的药效为关键药效；加粗的成分为q-markers。
[0038]
实施例2：
[0039]
在实验中使用的炙枳实的制备方法为采用烘烤法处理，以200℃的烘烤温度，烤制
8min，待枳实饮片卷翘，边缘隆起，穰囊突出，有油迹，颜色棕黄，闻之芳香，味苦，取出，放凉，即得。
[0040]
表2：药品与试剂信息表
[0041][0042][0043]
1.实验方法
[0044]
色谱条件：采用ods c
18
色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相：乙腈(a相)，乙腈：水(取十二烷基硫酸钠2.0g，溶于1000ml水中，滴加磷酸1滴)＝20∶80(b相)，按下表4中的规定进行梯度洗脱；流速：1ml/min；柱温：25℃；紫外检测器，检测波长为283nm。
[0045]
表4：
[0046][0047]
对照品溶液的制备：精密称定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林标准品适量，置于10ml容量瓶中，加入甲醇溶解，定容，混匀，制得0.708mg/ml柚皮苷、0.374mg/ml橙皮苷、0.783mg/ml新橙皮苷与0.459mg/ml辛弗林的混合标准品溶液，备用。
[0048]
供试品溶液的制备：取枳实粉末(过四号筛)0.2g，精密称定，置于锥形瓶中，加入25ml甲醇，称重后超声提取45min(功率150w，频率40hz)。待超声结束后，锥形瓶放置降至室温，再称定其质量，用溶剂补足减少的重量。摇匀，抽滤，滤液以0.45μm微孔滤膜滤过即为供试品溶液。
[0049]
测定法：分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0050]
方法学考察：
[0051]
线性关系的考察：精密量取吸取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林混合对照品溶液进样1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、40μl、60μl、80μl、100μl测得各色谱峰面积。以横坐标(x)表示对照品质量(μg)，纵坐标(y)表示峰面积绘制回归方程直线，得到柚皮苷的回归方程：y＝2e 06x 309536，r2＝0.9991；橙皮苷的回归方程：y＝180352.856x-14838.889，r2＝0.9999；新橙皮苷的回归方程：y＝2e 06x 452877，r2＝0.9987；辛弗林的回归方程：y＝151604.749x 44055.446，r2＝0.9990，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的质量浓度线性范围分别为7.08-212.4μg/ml、1.995-199.5μg/ml、7.83-234.9μg/ml和2.535-253.5μg/ml。结果显示四种待测成分在线性范围内呈良好线性关系。
[0052]
精密度考察：取供试品溶液，连续进样6次，每次进样10μl，记录柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的峰面积，计算rsd值分别为0.93％，1.01％，0.95％，2.55％，说明仪器精密度良好，符合含量测定的要求。
[0053]
稳定性考察：取同一供试品溶液，在0h、2h、4h、8h、12h、16h、24h分别进样，记录柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的峰面积，计算rsd值分别为2.10％，0.69％，2.10％，1.44％。表明供试品溶液中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林在24h内稳定性良好。
[0054]
重复性考察：取同一样品，平行制备6份供试品溶液，分别进样，记录柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的峰面积，计算rsd值分别为1.87％，0.73％，1.72％，2.46％，说明此方法测重复性良好。
[0055]
加样回收率实验：精密称取已知含量的同一样品6份，分别加入适量柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林对照品，按上述方法制得供试品溶液并检测，计算回收率，结果见表5。
[0056]
表5：橙皮苷、辛弗林加样回收率试验(n＝8)
[0057][0058]
2.实验结果
[0059]
图2给出了柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的炙枳实供试品溶液的hplc色谱图。从图中可以看出，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林色谱峰峰形良好，分离度较高，检测时间较短。
[0060]
此外，还对生品枳实、市售麸炒炙枳实和采用本发明方法制备的炙枳实中针对大柴胡汤内泻阳明热结的功效的药效标志物(q-markers)橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷，以及炙枳实中含量较高的活性成分辛弗林的含量进行了比较。结果如下表6所示：
[0061]
表6：不同枳实样品中橙皮苷、辛弗林、柚皮苷和新橙皮苷的含量测定值(n＝3)
[0062]
[0063][0064]
由表6的实验结果可以看出，采用本发明方法炮制的炙枳实中橙皮苷、辛弗林、柚皮苷和新橙皮苷的含量与生品和麸炒品存在较大差异。采用优选烘烤条件以200℃的烘烤温度，烤制8min制备得到的炙枳实中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的含量(％)分别可达13.38％、7.16％、9.76％和1.34％。
[0065]
因此，可以通过本发明的炙枳实质量检测方法对采用本发明所述的特定炮制方法制备的大柴胡汤专用炙枳实饮片的内在质量进行监控，从而最大限度地保证使用这种炙枳实的大柴胡汤的临床疗效。
[0066]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。