可激活聚集诱导发光探针及其在灵敏检测甲萘威中的应用

1.本发明属于农药检测领域，主要涉及可激活聚集诱导发光探针用于灵敏检测甲萘威。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.农药是用来消除病虫害和杂草、调节植物生长的合成化学物质，在环境防疫和农业生产中有着广泛的用途。然而，农药的不当或过量使用会在全球范围内造成环境和生态系统破坏、引发食品污染甚至健康相关问题。因此，世界卫生组织已经禁止使用具有较大的农药，各国也都颁布了限制农药残留允许水平的法规。甲萘威(1-萘基n-甲基氨基甲酸酯)是一种氨基甲酸酯类农药，因其广谱、高效、低毒等特点，在现代农业中被广泛用作杀虫剂。低毒的甲萘威持续滥用仍会引起生物累积，引发环境、食品和人类健康问题。因此，建立准确、灵敏、高效的甲萘威检测方法具有重要的意义，也是公共卫生的迫切需求。
4.在iso 17025认证标准中，传统的分析技术，如高效液相色谱、气相色谱和质谱已用于农药监测。尽管它们的灵敏度高、分辨率高、精密度好、痕量分析能力强，但其设备昂贵、操作步骤复杂、要求专业的实验技能，严重制约了它们在快速、简便研究中的应用。因此，科研工作者在建立快速、简便的研究方法中不断摸索。荧光分析法具有操作简便、稳定性好、灵敏度高、信噪比高、分析时间短等优点，成为农药分析的候选方法。然后，研究者们制备了各种荧光探针，如合成有机染料、碳点、量子点、金属有机骨架等，并与酶抑制平台集成，用于检测不同种类的农药。遗憾的是，大多数报道的探针仍然受到聚集诱导猝灭(acq)效应的影响，这可能导致小的斯托克斯位移和严重的背景干扰。此外，常用的单发射型探针通常受到仪器效率、样品基质以及荧光探针分布不均匀等因素的干扰。显然，探索聚集诱导发光(aie)探针对农药的比率传感仍然是一个巨大的需要。
5.aie于2001年由唐课题组首次发现，由于其高的量子产率(qy)、优异的光稳定性、低的检出限、可忽略不计的背景效应等优点，在传感和生物成像中得到了广泛的发展和成功的应用。分子内运动的限制是aie探针常见的发光机制。有趣的是，已报道的具有激发态分子内质子转移(esipt)特性的aie探针具有显著的优势。例如，大的斯托克斯位移(》150nm)，自荧光和自吸收最小，聚集态酮发射增强，光谱灵敏度高。毫无疑问，人们致力于设计和合成新型的aie esipt探针，比如邻羟基亚甲基苯胺、羟基苯基喹唑啉酮、2-(2
’‑
羟基苯基)苯并噻唑等。同时，与合成的探针相比，天然aie esipt探针(即黄酮醇衍生物)的发现极大地避免了复杂的有机合成过程且符合绿色化学理念。众所周知，esipt荧光团可以很容易地由反应单元形成，从而制备出选择性好、对比度高的开启型荧光探针。同时，反应单元作用前后的两个荧光基团可以完全用于构建比率传感系统。例如，2021年，蒋等人合成了一种新型荧光探针，其中cu
2
引发水解，释放出具有aie esipt性质的近红外探针，用于cu
2
的
比率传感和生物成像；曾课题组合理设计了一种亮氨酸氨肽酶激活的aie esipt探针用于亮氨酸氨肽酶的比率传感。然而，据本发明所知，迄今为止，基于可激活的aie esipt探针的农药比率分析尚未见报道。


技术实现要素：

6.针对上述所存在的问题，本发明设计了一种新型的荧光探针(即山奈酚四乙酸酯)，并开发了一种基于激活aie esipt探针的甲萘威比率传感策略。从杜仲叶中分离纯化出具有aie esipt特征和较大斯托克斯位移(165nm)的山奈酚，经一步酯化反应合成山奈酚四乙酸酯(acq探针)。山奈酚四乙酸能被酯酶快速、有效、选择性地水解为山奈酚。因此，山奈酚四乙酸酯415nm处的荧光发射降低，530nm处荧光发射增强。山奈酚的形成会开启esipt的发射，可用于酯酶的比值检测。甲萘威对酯酶活性有很好的抑制作用，可抑制山奈酚的产生。因此，本发明成功设计了比率分析策略，并将其应用于实际复杂样品中甲萘威的检测，且检测结果灵敏度高、选择性好、准确度高。此本发明首次报道了一种可激活aie esipt探针用于甲萘威的比率传感。值得肯定的是，该策略可为农药分析中新型传感探针的设计提供一个新的思路。
7.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一个方面，提供了一种可激活聚集诱导发光探针的合成方法，包括：
9.将山奈酚与乙酸酐、吡啶混合，进行酯化反应，得到山奈酚四乙酸酯，即：可激活聚集诱导发光探针。
10.本发明的第二个方面，提供了上述的方法合成的可激活聚集诱导发光探针。
11.本发明的第三个方面，提供了上述的探针在检测样品中氨基甲酸酯类农药和有机磷农药含量中的应用。
12.本发明的有益效果在于：
13.(1)本发明设计了一种酯酶激活的aie esipt探针，即山奈酚四乙酸酯，用于甲萘威的灵敏比率传感。山奈酚四乙酸酯中的乙酸基团作为酯酶的反应位点，乙酸基团的水解产生了具有aie esipt特性的山奈酚。甲萘威能抑制酯酶活性，调节山奈酚四乙酸酯的f415和山奈酚f530的比值，实现比值传感。
14.(2)与以往报道的合成荧光探针相比，山奈酚四乙酸酯是天然山奈酚的一步酯化反应，包含的合成步骤较少，对环境友好等优点。此外，酯酶具有高特异性，具有aie性质的山奈酚克服了背景干扰和光稳定性低的缺点。
15.(3)此外，比率传感策略的制作具有可靠性好、精度高、精度高、灵敏度高等特点。因此，山奈酚四乙酸酯将是一种有效的甲萘威检测荧光探针。该策略在实际样品中的应用成功，为农药检测开辟了新的视角，将为构建稳健的农药检测项目提供新的思路。
16.(4)本技术的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。
附图说明
17.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
18.图1：山奈酚的hrms(a)和1h nmr(b)光谱；山奈酚四乙酸酯的hrms(c)和1h nmr(d)
光谱。
19.图2：山奈酚(10.00μg ml-1
)在水/thf体系中的荧光光谱(a)；不同水/thf体系中山奈酚(10μg ml-1
)的粒径和f
530
(水分数0％-90％)(b)；不同浓度山奈酚在水/thf(80/20,v/v)中的荧光光谱(c)；山奈酚四乙酸酯(10.00μg ml-1
)在水/thf体系中的荧光光谱(d)；在b3lyp/6-31g*水平上，基于td-dft计算山奈酚的esipt过程，山奈酚的homo和lumo分子轨道处于基态和激发态(e)。
20.图3：可激活的aie esipt探针用于甲萘威比率传感的示意图。
21.图4：山奈酚四乙酸酯、山奈酚四乙酸酯 甲萘威、酯酶 山奈酚四乙酸酯、酯酶 甲萘威 山奈酚四乙酸酯的荧光光谱(a)；山奈酚和山奈酚四乙酸酯 酯酶的紫外可见光谱(b)；酯酶 山奈酚四乙酸酯的hrms谱图(c)；山奈酚与ce7蛋白的分子对接图像(pdb id:5jib)(d)；山奈酚四乙酸酯在ce7催化结合位点上的结合模式分析(黄虚线表示氢键，蓝虚线表示π
···
π相互作用)(e)；酯酶催化山奈酚四乙酸酯反应的双倒数图(f)。
22.图5：山奈酚四乙酸酯(a)和山奈酚(b)在不同ph值下的荧光光谱；山奈酚四乙酸酯(c)和山奈酚(d)在不同温度下的荧光光谱；不同紫外照射时间山奈酚四乙酸酯(f
415
)(e)和山奈酚(f
530
)(f)的荧光图。
23.图6：山奈酚四乙酸酯(10.00μg ml-1
)与酯酶(0.60u ml-1
)反应不同时间的荧光谱图(a)；f
530
/f
415 vs不同孵育时间(b)；山奈酚四乙酸酯(10.00μg ml-1
)与不同浓度酯酶(0.00-1.00u ml-1
)反应的荧光光谱图(c)；f
530
/f
415 vs不同浓度酯酶(反应8min)(d)；温度(e)和ph(f)对山奈酚四乙酸酯酶水解的影响；f
530
/f
415 vs甲萘威-酯酶系统中不同孵育时间(g)。
24.图7：山奈酚四乙酸(10.00μg ml-1
)与甲萘威(0.00-2.50μg l-1
)，酯酶(0.60uml-1
)在ph 7.4条件下的反应的荧光光谱(a)；f
530
/f
415 vs甲萘威浓度(b)；山奈酚四乙酸 酯酶体系对甲萘威的选择性(c)和山奈酚四乙酸酯 酯酶 甲萘威体系的抗干扰活性(d)。
具体实施方式
25.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
26.一种可激活聚集诱导发光探针的合成方法，包括：
27.将山奈酚与乙酸酐、吡啶混合，进行酯化反应，得到山奈酚四乙酸酯，即：可激活聚集诱导发光探针。
28.在一些实施例中，山奈酚从杜仲叶中分离纯化而得。需要说明的是：本技术中对山奈酚提取的原料并不作特殊的限定，含有山奈酚的植物都可以作为提取原料，例如：金线莲、菟丝子、八角莲、苦荞麸皮、金花茶叶、人字草、紫菀、柳叶鼠李叶等。
29.在一些实施例中，所述山奈酚与乙酸酐、吡啶的质量比为143：27～30：48
×
10-3
～50
×
10-3
。
30.在一些实施例中，所述酯化反应的条件为70～75℃回流1.5～2h。
31.在一些实施例中，酯化反应完成后，进行冷却、萃取、脱除溶剂后，重结晶处理。
32.在一些实施例中，从杜仲叶中分离纯化山奈酚的具体步骤包括：
33.将杜仲叶干燥、粉碎，醇提，得到粗提物；
34.将所述粗提物溶于水中，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，乙酸乙酯部分经乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱结晶，经反复硅胶色谱分离得到山奈酚。
35.本发明还提供了上述可激活聚集诱导发光探针在检测样品中氨基甲酸酯类农药和有机磷农药含量中的应用。
36.在一些实施例中，所述氨基甲酸酯类农药为甲萘威。
37.在一些实施例中，所述检索方法为荧光比率法。
38.下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
39.实施例1
40.1.实验过程
41.1.1山奈酚的提取
42.杜仲叶采自慈利杜仲林业中心(张家界,中国)，将杜仲叶进行干燥、粉碎和提取(杜仲叶350g，使用95％乙醇2l，回流提取3次，每次2h)。粗提物(39.50g)溶于水中，用石油醚(400ml
×
3次)、乙酸乙酯(400ml
×
3次)、正丁醇(400ml
×
3次)萃取(溶剂极性逐渐增大)。乙酸乙酯部分(2.20g)经乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱结晶，经反复硅胶色谱分离得到山奈酚(163.72mg)。山奈酚:esi-ms[m h]

:m/z287.0547(c
15h11
o6,-1.1ppm error)(图1a)；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm)8.05(d,j＝8.8hz,2h,h-2'and h-6'),6.93(d,j＝8.8hz,2h,h-3'and h-5'),6.45(d,j＝2.0hz,1h,h-8),6.19(d,j＝2.0hz,1h,h-6)。
[0043]
1.2山奈酚酯的合成
[0044]
将山奈酚(143.00mg)与乙酸酐(2.5ml)、吡啶(50μl)混合，70℃回流1.5h。反应完成后，将溶液冷却至室温，加入冰水(10ml)，搅拌10min。之后用乙酸乙酯(15ml
×
3次)萃取反应物。乙酸乙酯部位经无水na2so4干燥，减压蒸馏至干，甲醇(15ml)重结晶得山奈酚四乙酸酯(79.66mg)。山奈酚四乙酸酯：esi-ms[m na]

:m/z 477.0759(c
23h18o10
na,-6.9ppm error)(图1c)；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm)7.96(d,j＝8.4hz,2h,h-2'and h-6'),7.64(s,1h,h-8),7.39(d,j＝8.3hz,2h,h-3'and h-5'),7.17(s,1h,h-6),2.34(s,6h,2
×‑
ch3),2.32(s,6h,2
×‑
ch3)。
[0045]
1.3计算模型
[0046]
采用含时密度泛函理论(td-dft)对山奈酚的esipt机理进行了理论研究。通过几何优化得到了局部极小点和过渡态结构。几何构型和能量分别采用b3lyp/6-31 g(d)和b3lyp/6-311 g(d,p)基组，采用gauss 9.0软件包测定。
[0047]
从蛋白质数据库(pdb id：5jib，http://www.rcsb.org/)中提取酯酶(ce7)的晶体结构，通过chemdoodle网站获得山奈酚四乙酸酯的三维结构。然后，利用autodock 4.2程序对ce7与山奈酚四乙酸酯进行分子对接，并利用拉马克遗传算法搜索对接构象。网格尺寸设置为网格空间设置为通过设置网格中心，所有催化位点均被网格盒覆盖。对接结果采用开源pymol软件进行分析。
[0048]
1.4酯酶活性荧光检测
[0049]
在pbs(10mm,ph 7.4)中加入不同浓度的酯酶溶液(0.00-1.00u ml-1
,3.0ml)，37℃孵育8min。然后测量荧光光谱(激发波长365nm,发射波长390-700nm)。为考察酶解动力学参
数，将含有不同浓度山奈酚四乙酸酯(2.00-10.00μgml-1
)和酯酶(0.60u ml-1
)在pbs(10mm,ph 7.4,3.0ml)溶液，37℃孵育8min。每隔30s记录一次荧光光谱。初始反应速度由反应曲线的斜率(f
530
/f
415 vs时间)求得。由米氏方程(v＝v
max
[s]/(km [s]))和双倒数图求得km和v
max
参数，其中v为初始反应速率，v
max
为最大反应速率，[s]为山奈酚四乙酸酯浓度，km为米氏常数。
[0050]
1.5实际样品中甲萘威的检测
[0051]
将甲萘威(0.00-2.50μg l-1
)和酯酶(0.60u ml-1
)在pbs(10mm,ph 7.4,3.0ml)溶液中37℃孵育15min。然后加入山奈酚四乙酸酯(1.00mg ml-1
,30μl)，37℃孵育8min。记录荧光光谱(激发波长365nm,发射波长415nm和530nm)。由此，得到了检测甲萘威的标准曲线。
[0052]
选取叶莴苣、绿豆和韭菜作为实际蔬菜样品，评估其甲萘威水平。将10.00g蔬菜样品切成薄片，用pbs(10mm,ph 7.4,10ml)溶液超声提取10min。提取液经0.22μm滤膜过滤，弃去固体物质。取滤液(3.0ml)加入不同浓度的甲萘威。加标样品中加入酯酶(终浓度为0.60u ml-1
)，37℃孵育15min。然后，引入山奈酚四乙酸酯(30μl,1.0mg ml-1
)，继续孵育8min。最后，测量了溶液的荧光光谱用于甲萘威含量分析。
[0053]
2.结果与讨论
[0054]
2.1山奈酚与山奈酚四乙酯的光学活性
[0055]
成功从杜仲叶中纯化出山奈酚，通过一步酯化反应合成了山奈酚四乙酸酯。其高分辨质谱(hrms)和1h nmr谱图见图1中a-d，表明山奈酚和山奈酚四乙酸酯有较高的纯度。
[0056]
在水(不良性溶剂)/thf(四氢呋喃,良性溶剂)溶液中研究了山奈酚和山奈酚四乙酸酯的荧光光谱。如图2中a所示，在纯thf溶液中，山奈酚在365nm激发下，在415nm处出现一个发射峰(烯醇式发射)。随着水分数从0％增加到80％，415nm(f
415
)处的荧光强度逐渐降低，出现一个530nm(酮发射)的发射峰，530nm(f
530
)处的荧光强度明显增强，且有较大的斯托克斯位移(165nm)。当水分含量从80％增加到90％时，f
530
和f
415
均显著下降(图2中a和图2中b)，这种现象可能是山奈酚的沉积导致。显然，在图2中b中，山奈酚的粒径随着水含量的增加而急剧增大。此外，山奈酚在纯thf溶液中530nm处的qy为2.55％，而在水/thf(80/20,v/v)溶液中的qy为7.85％。因此，可证明山奈酚的酮式发射是aie活性。此外，在水/thf(80/20,v/v)溶液中，随着山奈酚浓度的增加，f
530
得到增强，进一步证明山奈酚具有aie esipt特性(图2中c)。山奈酚四乙酸酯在415nm处呈现单一发射峰，在415nm处的荧光强度随水分数从0％增加到80％而降低(图2中d)。山奈酚四乙酸酯的qy从纯thf溶液的6.68％减弱到水/thf(80/20,v/v)溶液的2.88％。由此推断山奈酚四乙酸酯为acq类化合物。
[0057]
山奈酚中特定的c3-oh(氢键供体)和c4＝o(氢键受体)骨架归因于aie和esipt特性。在聚集态，山奈酚的芳香环转动受限可以提高esipt效率，增加辐射衰减。此外，在激发态，由于分子内质子转移过程势垒降低，esipt过程得到改善。为了进一步确定山奈酚的esipt特性，本发明进行了高斯理论计算(图2e)。在光激发下，山奈酚的烯醇基态(e)吸收3.72ev能量后转移到激发态(e*)，发生homo-lumo跃迁。此时山奈酚的电荷可以重新分配，导致c3-oh的酸性和c4＝o的碱性增加。在e*态下，分子内氢键长度(c4＝o
···
h)为比e态短。相比之下，c3-o-h的氢键长度略有延长，从e态的延长到e*态的因此，快速esipt过程伴随酮骨架(k*)形成。最后，在释放2.59ev能量后，
发生了k*-k跃迁过程。显然，esipt的发生诱导了山奈酚的烯醇和酮骨架在激发态下的互变异构化，从而导致山奈酚有两个荧光发射峰。
[0058]
3.2甲萘威的传感策略
[0059]
荧光传感技术因其操作简便、成本低、灵敏度高、稳定性好、特异性好等优点，是分析物检测的有力工具。在此，本发明合理地制备了一种新型酯酶激活的aie esipt荧光探针山奈酚四乙酸酯(图3)。由于分子内电荷转移过程，山奈酚四乙酸酯没有分子内氢键作用，在415nm(图4中a,黑色线)处出现单一的荧光峰。山奈酚四乙酸酯中的乙酸酯基团被设计为酯酶反应位点，在c-3位消除乙酸酯基团可以引发esipt。引入酯酶后，山奈酚四乙酸酯可水解成山奈酚(图4中b和图4中c)。然后，具有aie esipt特征的山奈酚在530nm(酮式结构发射)有荧光发射峰(图4中a,蓝色线)。因此，可以选择415nm和530nm处的2个荧光发射进行酯酶的比率检测。为了解酯酶水解山奈酚四乙酸酯的机理，以已报道的ce7晶体结构(pdb id：5jib)为基本模型进行分子对接分析(图4中d-e)。山奈酚四乙酸酯通过氢键和π
···
π相互作用与ce7的氨基酸残基(ser-188、his-303、trp-124、gly-91、tyr-92和asn-93)有很强的结合(结合能,-7.4kal mol-1
)，其中ser-188、his-303和tyr-92已被证明是ce7的催化位点。此外，通过双倒数图(图4中f)测量米氏常数(km,3.30
×
10-6
m)、最大反应速率(v
max
,1.10μm
·
min-1
)、催化速率常数(k
cat
,1.83min-1
)和k
cat
/km(5.50
×
106m-1
·
min-1
)。显而易见，相对较低的结合能、与生物活性位点的结合以及微摩尔水平km值说明了山奈酚四乙酸酯与酯酶之间的特异相互作用。
[0060]
选择甲萘威作为模型农药，其可以抑制酯酶的催化活性。在甲萘威存在下，酯酶活性受到抑制，从而减少了山奈酚的产生，导致荧光信号逆转(图4中a-,绿色线)。此外，在山奈酚四乙酸酯溶液中仅加入甲萘酰几乎没有荧光变化(图4中a,红线)。因此，将酯酶激活的aie esipt策略与甲萘威对酯酶的抑制作用相结合，开发了甲萘威的荧光传感策略，并在实际检测中成功应用。
[0061]
3.3甲萘威检测条件优化
[0062]
荧光探针的高稳定性对传感至关重要。因此，对不同的传感条件(即温度、ph和紫外光照射时间)进行了考察和优化。如图5中a和图5中b所示，ph在4.0-9.0范围内，山奈酚四乙酸酯和山奈酚的荧光光谱相对稳定，可以在生物条件下应用。图5中c和图5中d表明，当温度从25℃升高到40℃时，山奈酚四乙酸酯和山奈酚的荧光光谱变化不大，随后整个实验均选择37℃作为实验温度。此外，山奈酚四乙酸酯的f
415
和山奈酚的f
530
在365nm持续紫外光照射90min(图5中e和5中f)后变化不大，表明其具有优异的光稳定性。
[0063]
在传感过程中，酯酶连接山奈酚四乙酸酯水解和甲萘威检测。然后，在37℃的pbs缓冲液(10mm,ph 7.4)中，首先考察了不同孵育时间，酯酶(0.60u ml-1
)对山奈酚四乙酸酯的水解程度。如图6中a所示，随着孵育时间延长至8min，山奈酚四乙酸酯的f
415
逐渐减小，f
530
急剧增大。f
530
/f
415
在8min时达到最大值，在随后的12min内保持稳定(图6中b)，表明酯酶催化反应在8min内完成。因此，酯酶对山奈酚四乙酸酯的水解是一个快速的过程。之后，研究了山奈酚四乙酸酯(10.00μg ml-1
)和不同浓度酯酶(0.00-1.00u ml-1
)孵育体系的荧光光谱(图6中c)。随着酯酶浓度的增加，f
530
/f
415
值逐渐增大，在0.60u ml-1
达到最大值(图6中d)。此外，山奈酚四乙酸酯-酯酶体系在温度为37℃和ph 7.4的条件下水解效果最好(图6中e和6中f)。因此，在酯酶浓度(0.60u ml-1
)、山奈酚四乙酸酯浓度(10.00μg ml-1
)、孵育时
间(8min)、温度(37℃)、ph(7.4)条件下，进行下面的甲萘威检测实验。
[0064]
甲萘威-酯酶体系的孵育时间也是一个重要的研究参数。如图6中g所示，f
530
/f
415
值随着孵育时间的延长而减小，在15min左右达到最小值。因此，将甲萘威-酯酶的孵育时间设定为15min，也是一个相对快速的过程。
[0065]
3.4甲萘威的比率检测
[0066]
在最佳条件下，对甲萘威进行了比率检测(图7中a)。显然，随着甲萘威浓度的增加，f
530
逐渐减小，f
415
则表现出相反的趋势。在0.02-2.00μg l-1
范围内，f
530
/f
415
值与甲萘威浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为y＝-1.42x 3.76(r2＝0.996)，检出限低至0.007μg l-1
(图7中b)。表1总结了已报道的甲萘威的荧光检测方法，可以清楚地看出本工作相对较为灵敏。
[0067]
表1.已报道用于甲萘威检测的荧光探针.
[0068][0069]
传统的基于单一荧光发射的传感方法易受环境影响，导致灵敏度降低。更为重要的是，所开发的高灵敏度策略能够满足实际样品中甲萘威检测的要求。
[0070]
特异性和抗干扰性对于甲萘威检测传感系统的评价至关重要。然后，对农业和生物样品中一些常见的共存物质，包括有机小分子(l-组氨酸，l-his；l-甘氨酸,l-gly；l-色氨酸,l-trp；l-酪氨酸，l-tyr；l-丝氨酸，l-ser；l-亮氨酸，l-leu；谷胱甘肽，gsh)、金属离子(cu
2
,na

,mg
2
,k

,ca
2
)、农药(甲基硫菌灵,tm；对硫磷)进行了筛选和评价。这些干扰物浓度比甲萘威高出3000倍，但除甲萘威外没有明显的抑制活性(图7中c)，对甲萘酰的测定影响不大。酯酶激活策略不仅对底物具有很好的识别特异性，而且对抑制剂甲萘威的反应
也很稳定(图7中d)。因此，基于激活aie esipt探针的传感体系对甲萘威检测具有良好的特异性和抗干扰能力。
[0071]
3.5实际样品中甲萘威的检测
[0072]
抓住该传感策略的突出可行性，有望可靠、准确地定量真实样品中的甲萘威。选取叶用莴苣、绿豆和韭菜为实验对象，分别添加不同浓度的甲萘威，结果见表2。
[0073]
表2蔬菜中甲萘威的检测(n＝3)
[0074][0075]a未检测到
[0076]
正如预期的那样，这3种被检测的蔬菜中没有发现甲萘威。实验中，甲萘威的平均回收率在92.00％-107.67％之间，rsd值均小于8.04％。结果表明，所开发的传感策略在实际样品的甲萘威的分析中具有较高的准确度、可靠性和重复性。比率型荧光传感可以最大限度地减少复杂样品中背景干扰的影响，从而允许更精确、定量的读出。
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最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。