miRNA在制备治疗AD的药物中的应用、药物组合物及其应用的制作方法

mirna在制备治疗ad的药物中的应用、药物组合物及其应用
技术领域
1.本发明涉及阿尔茨海默病的早期治疗技术领域，特别涉及制备治疗药物的方法技术领域，具体是指mirna在制备治疗ad的药物中的应用、药物组合物及其应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)俗称老年性痴呆，是以大脑淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，aβ)沉积和高度磷酸化的tau蛋白所致微管结构紊乱形成的神经元纤维缠结为主要病理学特征的神经退行性疾病。ad是一种慢性、非传染性、与年龄相关的病因复杂的疾病，是痴呆症最普遍的形式，占所有病例的50-60％。随着人口老龄化，ad已成为常见病、多发病和高负担疾病。阿尔茨海默病国际组织(adi)估计，2019年全球痴呆症患者超过5000万，到2050年，这一数字可能会增加到1.52亿。在我国，根据阿尔茨海默病中国(adc)的数据显示，到2019年，中国有超过1000万人患有ad，到2050年将约有2800万人患有ad。ad医疗和护理负担非常沉重，直接和间接医疗费用都很高，例如，在美国每位中晚期ad病人的年平均医疗护理费用高达5万美元，比未患ad的老年人的医疗护理费用增加2倍。据统计，2010年全球用于痴呆的医疗费用高达6040亿美元，占同期全球国民生产总值的1％。随着我国老龄化的加速，尤其是高龄老年人口绝对数增大，由ad所带来的医疗护理和经济负担问题会越来越严峻。令人感到沮丧的是，目前尚无可以从病因切入干预疾病进展的治疗方法，而目前fda批准的治疗方法大多是对症治疗即暂时改善认知功能而不能阻止疾病进展，包括靶向乙酰胆碱酯酶(ache)抑制剂和n-甲基d-天冬氨酸(nmda)受体拮抗剂。近几年针对ad晚期病理标志物药物的研发均在临床药物试验中宣告失败，ad对因治疗的新药研发仍未有获得认可的成功。因此，积极开展ad的早期诊断和早期治疗，是当下老龄化社会必须解决的医疗卫生和社会经济课题。
3.aβ沉积的产生会导致后续病理级联反应，正反馈式地推动疾病进展，这可能是近年aβ单克隆抗体和抗tau蛋白药物在临床试验中以失败告终的原因之一。bace1在aβ的病理性剪切中发挥着重要的作用，研究发现，aβ的沉积远远早于痴呆症状的出现，申请人的研究显示，微小rna(microrna,mirna)的遗传调控异常是其中的关键环节。mirna是一类在细胞内起作用的保守的内源性小(20-24nt)单链非编码rna。mirna是从初级转录物(pri-mirna)逐渐剪切产生的。pri-mirna在细胞核内通过rna聚合酶pol ii转录得到，并被drosha和dgcr8微处理复合亚基(dgcr8)加工成为含有茎环结构的前体mirna(pre-mirna)。pre-mirna被积极识别并通过exportin-5从细胞核转运至细胞质。在细胞质中，pre-mirna被dicer和tar rna结合蛋白(trbp)切割成约22nt的双链寡核苷酸。双链中的其中一条——代表着成熟mirna，随后被识别并与ago蛋白结合，在mirna诱导沉默复合体(mirisc)中起作用。另一条单链被释放并随后降解，或在mirna稳态调节和下游调节中发挥功能。mirna在转录后调控中发挥不可替代的作用。通过成熟mirna与靶信使rna(mrna)的3’非翻译区(utr)的结合，从而导致mrna降解或翻译抑制，继而调控蛋白质翻译及生物学功能发生变化。此外，研究发现bace1除了剪切app发挥酶功能外，还能破坏细胞生成蛋白激酶a(pka)——脑
中一种引起细胞代谢的蛋白——功能所需的其他分子，损伤神经元。特别是近年来研究发现，aβ的沉积远远早于痴呆症状的产生，这表明aβ不仅参与ad的发展过程，更是ad发生的种子和诱因。对于不同阶段ad患者脑组织rna进行分析，发现ad疾病进程中mirna-107表达不同程度的减少，bace1表达增加，从而出现相应的病理改变。该研究认为mirna-107可通过与靶基因bace1mrna的3’端utr区结合调控bace1的表达，进而影响相关蛋白生成。另有不同研究者的研究结果分别聚焦于mir-124、mir-15、mir-195、mir-19、mir-298、mir-328等mirnas在ad发病过程中的作用，认为这些mirnas也部分调控了ad病理发生发展，但均未进行深入的验证。近年来，众多aβ抗体在临床试验中或因为不能达到治疗有效的终点指标或因为脑水肿和出血等副作用而宣告失败。这提示我们，aβ可能不仅是ad疾病发生的诱因并且会导致其他不依赖aβ的病理过程的出现继而推动ad疾病的进展，同时，从清除aβ的角度进行的治疗研发并未给ad患者带来认知和日常生活方面的真正获益，却有造成脑组织损伤引起脑水肿和淀粉相关脑微出血的不良反应。
4.根据以上现状和研究进展，我们团队近10年致力于针对ad病因进行遗传物质调控的研究。申请人利用mirna遗传物质组合对aβ产生的限速酶bace1的表达进行早期调控，从而减少aβ产生，以达到在早期阻止ad病理的发生发展的目标。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的就是针对以上存在的问题，提供一种能够阻止ad病理发生和发展并且无明显副作用的mirna组合药物和其载体选择，优化ad药物开发的策略以期能运用于临床。
6.为了实现上述目的，本发明第一方面提供了mirna在制备治疗ad的药物中的应用，所述的mirna选自由mir-1185-2-3p、mir-107组成的组中的一个或多个。
7.本发明第二方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物为mirna，所述的mirna选自由mir-1185-2-3p或mir-107组成的组中的一个或多个。
8.较佳地，所述的药物组合物包括包装所述的mirna的载体，所述的载体包括但不限于腺相关病毒颗粒载体。
9.本发明的第三方面提供了所述的药物组合物在制备治疗ad的药物中的应用。
10.采用本发明的有益效果在于：一方面筛选可能运用于临床的最优的纳米载体；另一方面通过严谨的试验和统计分析，首次发现对ad具有较高治疗效果的mirna组合mir-1185-2-3p、mir-107。通过腺相关病毒装载mirna可行性的研究、研制和应用，突破了目前药物研发的作用机理，提供了制备ad药物的新方法和思路。
附图说明
11.图1a～1b为水迷宫实验的分析结果。
12.图2为y迷宫实验的分析结果。
13.图3a～3c分别为adneg组、107组、1185组小鼠大脑海马区的gfap荧光免疫结果。
14.图4a～4c分别为adneg组、107组、1185组小鼠大脑海马区内iba-1荧光免疫结果。
15.图5a～5c分别为adneg组、107组、1185组小鼠大脑neun荧光免疫结果。
16.图6a～6c分别为adneg组、107组、1185组小鼠大脑aβ荧光免疫结果。
17.图7为本发明的研究治疗ad药物的方法流程图。
具体实施方式
18.为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
19.申请人研究发现，mir-1185-2-3p、mir-107在早期ad患者外周血浆中含量异常，同时通过细胞实验证实调节细胞内这些mirnas的含量能有效调控胞内bace1和aβ的量。组合mirna作为ad治疗药物的一大阻碍是，外源性mirna在体内的稳定性、靶向性、血脑屏障穿透性和生物分布问题。腺相关病毒(aav)载体由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低，在体内长期稳定表达外源基因，不同血清型可以相对特异性地感染不同器官组织等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。aav2/9型对中枢神经有较高地亲和性，研究显示其能绕过血脑屏障并优先靶向神经元。
20.如图7所示，本发明利用aav载体，装载mirna组合，通过脑立体定位注射给药，观测ad小鼠行为学和生化指标的变化，为ad药物制备提供新的方法。需要说明，本发明所利用的载体并不仅限于腺相关病毒载体。
21.一、研究对象
22.药物接受对象为app/ps1双转基因ad模型雄性小鼠，对照组为年龄、体重、性别匹配的app/ps1小鼠。
23.二、研究方法
24.1、药物制备
25.利用不同mirna的核苷酸链，将其装载入aav2/9载体中。
26.2、早期干预
27.在小鼠达到4月龄的时候，将装载mirna的aav通过脑立体定位注射的方式处理实验组小鼠。将无mirna的阴性对照aav通过脑立体定位注射的方式处理对照组小鼠。饲养两个月。实验组分为各个亚组，给予不同的aav装载的内容包括：mir-1185-2-3p或mir-107。
28.3、行为学实验
29.将6月龄小鼠进行行为学实验，包括：y迷宫实验和morris水迷宫实验。比较实验组和对照组小鼠的行为学表现差异。
30.(1)y迷宫实验：动物放在一个臂的末端，记录10分组内动物进入各个臂的顺序。alternation被定义为连续进入三个臂，如(1，2，3或1，3，2)最大alternation为进臂次数的总和-2，然后计算百分数＝实际的alternation/最大alternation
×
100％，最终要给出的值包括实际alternation数，最大alternation数，二者的百分数、动物活动的总路程和总进臂数。
31.(2)水迷宫实验：将小鼠头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录动物找到水下平台的时间。在前几次训练中，如果这个时间超过60秒，则引导动物到平台。让动物在平台上停留10秒。每只动物每天训练4次，每天放入象限不重复。连续训练5天。第六条，将平台撤除，开始60s的探查训练。将动物由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物在目标象限(原先放置平台的象限)所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。
32.4、生化检测
33.在进行完行为学实验后，检测小鼠体内放射性核素，记录纳米颗粒的体内生物分布情况。将小鼠用4％水合氯醛麻醉后，用0.9％生理盐水灌注，取出大脑。通过免疫荧光和免疫印迹，检测小鼠脑内aβ
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、神经元存活情况和炎症反应。神经元数量和突触结构指标：neun、synaptophysin和synapsin。炎症反应指标包括：gfap、iba1。
34.石蜡切片制作：取材后，4％pfa溶液中固定，24小时后用70％酒精洗涤。脱水：30％、50％、70％、80％、90％各级乙醇溶液脱水各40min，放入95％、100％各两面三刀次，每次20min。透明：纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h(或至透明为止)，须换一次二甲苯。透蜡：放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡ⅰ、石蜡ⅱ透蜡各20～30分钟。包埋：将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块。切片。贴片。脱蜡复水：石蜡切片经二甲苯ⅰ、ⅱ脱蜡各5～10min，然后放入100％、95％、90％、80％、70％等各级酒精溶液中各3～5min，再放入蒸馏水中3min。染色：切片放入苏木精中染色约10～30min。水洗：用自来水流水冲洗约15min。分化。漂洗。脱水ⅰ：切片入50％乙醇
→
70％乙醇
→
80％乙醇中各3～5min。复染：用0.5％伊红乙醇液对比染色2～5min。脱水ⅱ：放入95％乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3～5min，用吸水纸吸干多余的乙醇。透明：切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中约5min，然后放入纯二甲苯ⅰ、ⅱ中各3～5min。封藏：中性树胶封存。
35.5、统计分析
36.使用spss 24.0软件包进行数据分析。在各组间比较时，首先进行方差齐性检验，对于方差齐的数据，采用单因素方差分析进行分析比较；对于方差不齐的数据，采用非参数检验的k个独立样本检验。通过事后比较，得到治疗ad小鼠效果最优的mirna组合。
37.6、实验结果
38.(1)水迷宫实验：
39.a.训练阶段：假设检验汇总：方差分析用于方差齐性检验，非参数k个独立样本检验用于比较总体有无差异，非参数独立样本检验用于两两比较。
40.表1方差齐性分析
[0041][0042]
图1a为多重比较的结果，图1b为单独比较的结果。
[0043]
如图1a所示，在训练阶段第5天，三组间出现显著性差异。组间分析发现给予mir-107组(107)的小鼠与ad阴性对照组(adneg)的小鼠有显著差异，说明mir-107能改善ad小鼠的学习记忆能力。
[0044]
将mir-1185组(1185)组与adneg单独比较，发现p值由原来的0.265，变为趋于0.05(0.055)，由此可推断当提高小鼠样本量后，1185组将与adneg组出现显著差异，以证明mir-1185-2-3p能改善ad小鼠的学习记忆能力。
[0045]
b.探查阶段：
[0046]
建设检验汇总：k-s检验用于正态性检验，方差分析用于方差齐性检验、比较总体有无显著性差异和多重比较，独立样本t检验用于比较adneg组与1185组。
[0047]
表2k-s检验和正态性
[0048][0049]
表3方差齐性分析和anova
[0050][0051]
图1b为多重比较的结果。
[0052]
在探查阶段，各组小鼠在目标象限中探查时间出现差异。如图1b所示，107组与adneg组出现显著性差异，说明mir-107能改善ad小鼠的学习记忆能力。将1185组与adneg组单独比较，发现p值由原来的0.095变为趋于0.05(0.069)，由此可推断当提高小鼠样本量后，1185组将与adneg组出现显著差异，以证明mir-1185-2-3p能改善ad小鼠的学习记忆能力。
[0053]
(2)y迷宫实验
[0054]
在y迷宫自发交替实验中，如图2所示，107组和1185组均与adneg组出现显著性差异。107组与adneg组p值为0.014，1185组与adneg组p值为0.002。证明mir-107和mir-1185-2-3p能改善ad小鼠的空间记忆能力。
[0055]
(3)荧光免疫
[0056]
由图3a～3c可知，mir-107和mir-1185-2-3p均能减少星形胶质细胞的激活，减轻小鼠脑内的炎症反应。
[0057]
由图4a～4c可知，mir-107和mir-1185-2-3p均能减少小胶质细胞的激活，减轻小鼠脑内的炎症反应。
[0058]
由5a～5c可知，mir-107和mir-1185-2-3p均能增加小鼠脑内成熟神经元含量，尤其在海马区。
[0059]
由6a～6c可知，mir-107和mir-1185-2-3p均能减少小鼠脑内aβ的形成。
[0060]
本发明的有益效果在于：通过严谨的试验和统计分析，首次发现对ad具有有效对因治疗效果的mirna组合mir-1185-2-3p和/或mir-107。通过腺相关病毒装载mirna可行性的研究、研制和应用，突破了目前药物研发的作用机理，提供了制备ad药物的新方法和思路。
[0061]
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。