一种cTnI抗体及其应用的制作方法

一种ctni抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种ctni抗体及其应用。


背景技术：

2.据世界卫生组织(world health organization，who)报告，心血管疾病(cardiovascular disease，cvd)已成为全球疾病死亡的首要原因。在cvd的预防、早期诊断、及时治疗、疗效评价及预后判断中，心肌标志物起到了重要的实验室支撑作用。心肌标志物的临床应用始于1954年，天冬氨酸氨基转移酶/谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，ast)作为诊断急性心肌梗死(acute myocardial infarction，ami)的第一个心肌标志物用于临床；随后肌酸激酶mb同工酶(creatine phosphokinase mb isoform,ck-mb)和肌红蛋白(myoglobin,mb)广泛应用于ami的诊断，但上述心肌标志物较低的敏感性和特异性，无法满足临床对于cvd的早期发现、早期诊断和及时治疗的迫切需求。
3.目前常用的心肌损伤标志物主要有肌钙蛋白i(cardiac troponin-i,ctni)、肌钙蛋白t(ctnt)、肌酸激酶同工酶质量(ck-mbmass)和肌红蛋白(myoglobin)。肌钙蛋白由3个亚单位组成，它们各自有独立的结构和不同的调节作用。近年来的研究表明，ctni具有高度的心肌特异性，当心肌细胞受损时，血液中ctni出现时间早，持续时间长，与心肌损伤程度及预后密切相关。它可作为心肌损伤的一种特异性指标，对心脏病的诊断有十分重要的意义。因此，对ctni进行纯化并寻找其相应的抗体用于对心脏病患者的诊断已成为当今心脏病诊断研究的前沿学科。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一是提供一种结合肌钙蛋白i的单域抗体；
5.本发明的目的之二是提供一种制备上述抗体的方法。
6.为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.本发明第一方面提供了一种抗肌钙蛋白i的单域抗体或其抗原结合片段，所述的单域抗体或其抗原结合片段包括互补决定区cdr1和cdr3，其中：
8.cdr1包含如seq id no.5或seq id no.9所示的氨基酸序列；
9.cdr3包含如seq id no.8或seq id no.11所示的氨基酸序列。
10.在本发明中，术语“单域抗体”或“单结构域抗体”是指具有单个可变结构域的抗体，该抗体能够在不存在其他抗体结构域的情况下特异性结合抗原或抗原表位。单域抗体包括例如vnar抗体，骆驼科动物vhh抗体，vh域抗体和vl域抗体。vnar抗体由软骨鱼产生，例如护士鲨，沃比贡鲨，多毛狗鱼和竹鲨。骆驼vhh抗体是由几种物种产生的，包括骆驼，美洲驼，羊驼，单峰骆驼和骆驼，它们产生的天然缺乏轻链的重链抗体。
11.可变新抗原受体(vnar)是在软骨鱼中发现的免疫球蛋白新抗原受体(ignar)抗体。vnar抗体仅包含两个cdr(cdr1和cdr3)，还包含两个高变区域(hv)，为hv2和hv4区域。
cdr和hv区在以下n端至c端的顺序中被构架区(fw)围绕：fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3 a-hv4-fw3b-cdr3-fw4。
12.如本文所用，术语“cdr”或“互补决定区”意指在重链或轻链多肽的可变区内发现的非邻接抗原结合位点。这些特定区域已描述于：kabat等人，j.biol.chem.，第252卷：第6609-6616页，1977年；kabat等人，美国卫生与公众服务部，“sequences of proteins ofimmunological interest”，1991年；chothia等人，j.mol.biol.，第196卷：第901-917页，1987年；al-lazikani b.等人，j.mol.biol.，第273卷：第927-948页，1997年；maccallum等人，j.mol.biol.，第262卷：第732-745页，1996年；abhinandan和martin，mol.immunol.，第45卷：第3832-3839页，2008年；lefranc m.p.等人，dev.comp.immunol.，第27卷：第55-77页，2003年；以及honegger和pl
ü
ckthun，j.mol.biol.，第309卷：第657-670页，2001年，其中在相互比较时，这些定义包括氨基酸残基的重叠或子集。不过，涉及抗体或其嫁接抗体或变体的cdr时，任一定义的应用均处于如本文定义和使用的术语的范围内。cdr预测算法和界面在本领域中是已知的，包括例如abhinandan和martin，mol.immunol.，第45卷：第3832-3839页，2008年；ehrmann f等人，nucleicacids res.，第38卷：第d301-d307页，2010年；以及adolf-bryfogle j等人，nucleic acids res.，第43卷：第d432-d438页，2015年。本段中引用的参考文献的内容全文以引用方式并入本文，以用于本技术，并且可能包括在本文的一项或多项权利要求中。
13.术语“氨基酸”包括标准的20种遗传编码的氨基酸及其相应的“d”形式的立体异构体(与天然的“l”形式相比)、ω-氨基酸、其它天然存在的氨基酸、非常规的氨基酸(例如，α,α-双取代氨基酸、n-烃基氨基酸等)和经化学衍生化的氨基酸。
14.在明确列举氨基酸，诸如“丙氨酸”或“ala”或“a”时，术语指l-丙氨酸和d-丙氨酸两者，除非另有明确规定。其它非常规的氨基酸也可以是适合于本发明多肽的组分，只要多肽保留期望的功能性特性。对于显示的肽，每个编码的氨基酸残基(在适当的情况中)由对应于常规氨基酸俗名的单字母名称代表。
15.作为本发明的优选的技术方案，所述的单域抗体或其抗原结合片段包括含有氨基酸序列seq id no.5的cdr1和含有氨基酸序列seq id no.8的cdr3。
16.作为本发明的优选的技术方案，所述的单域抗体或其抗原结合片段包括含有氨基酸序列seq id no.9的cdr1和含有氨基酸序列seq id no.11的cdr3。
17.作为本发明的优选的技术方案，所述的单域抗体或其抗原结合片段还包括高变区域hv2和hv4。
18.作为本发明的更为优选的技术方案，hv2包含如seq id no.6或seq id no.10所示的氨基酸序列。
19.作为本发明的更为优选的技术方案，hv4包含如seq id no.7所示的氨基酸序列。
20.作为本发明的优选的技术方案，其特征在于，所述的单域抗体或其抗原结合片段包括如seq id no.3或seq id no.4所示的氨基酸序列。
21.本发明第二方面提供了一种编码本发明第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段的dna分子。
22.作为本发明的优选的技术方案，所述的dna分子包含如seq id no.1或seq id no.2所示的核苷酸序列。
23.术语“核苷酸序列”和“核酸”、dna序列在本文中可互换使用，并且是指将被递送到靶细胞中的序列。通常，核酸包含编码感兴趣的多肽或非翻译rna(例如用于递送至细胞或受试者)的开放阅读框。核酸序列可进一步包含调节序列，其组合可称为转基因或表达构建体。
24.本发明第三方面提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第二方面所述的dna分子。
25.作为本发明的优选的技术方案，所述的表达载体包括质粒、病毒来源的载体。
26.作为本发明的更为优选的技术方案，所述的病毒来源的载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。
27.如本文所用，术语“载体”是指包含完整复制子的非染色体核酸，使得当置于允许的细胞内时，载体可以被复制，例如通过转化过程。载体可以是病毒的或非病毒的。用于递送核酸的示例性非病毒载体包括裸露的dna；和单独或与阳离子聚合物结合的与阳离子脂质复合的dna；阴离子和阳离子脂质体；dna-蛋白质复合物和包含与阳离子聚合物(如异质聚赖氨酸，定长寡肽和聚乙烯亚胺)缩合的dna的颗粒，在某些情况下还包含在脂质体中。
28.构建本发明的重组载体的载体包括(但不限于)由celltrion inc.(韩国)生产的marex表达载体；市场上可广泛买到的pcdna载体；f、r1、rp1、col、pbr322、tol、ti载体；粘粒；噬菌体，诸如λ噬菌体、λ形噬菌体、m13噬菌体、mu噬菌体、p1噬菌体、p22噬菌体、qμ噬菌体、t-偶数噬菌体、t2噬菌体、t4噬菌体、t7噬菌体等；植物病毒。本发明中可使用本领域技术人员已知的各种载体的任意一种，且载体的选择依赖于所选择的细胞的性质。细胞中载体的导入可通过(但并不限于)磷酸钙转染、病毒感染、deae-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔实现，且本领域的任何技术人员可选择和使用适用于所用的载体和细胞的导入方法。
29.优选地，上述载体包含一种或多种选择标记，但并不限于此，且还可使用不包含选择标记的载体。选择标记的选择可依赖于选择的细胞(如本领域的技术人员公知的)，但这对于本发明并不是关键性的。
30.本发明第四方面提供了一种细胞，所述的细胞由本发明第三方面所述的表达载体转化得到。
31.作为本发明的优选的技术方案，所述的细胞包括原核细胞、真核细胞。
32.作为本发明更为优选的技术方案，所述的原核细胞包括细菌细胞。
33.作为本发明更为优选的技术方案，所述的真核细胞包括原生生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞，优选的，所述的动物细胞包括哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞。
34.本发明第五方面提供了一种制备本发明第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段的方法，所述的方法包括：
35.a)提供一表达载体，该表达载体含有本发明第二方面所述的dna分子序列；
36.b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；
37.c)在适合条件下培养步骤b)所得的宿主细胞：和
38.d)从宿主细胞培养液中分离纯化获得所述的单域抗体或其抗原结合片段。
39.本发明第六方面提供了一种非诊断目的的检测肌钙蛋白i的方法，所述的方法包括使用本发明第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段。
40.作为本发明的优选的技术方案，所述的可用于检测的标记物包括荧光色素、亲和素、顺磁原子、放射性同位素。
41.作为本发明的更为优选的技术方案，所述的荧光色素包括荧光素、罗丹明、texas红、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白。
42.作为本发明的更为优选的技术方案，所述的亲和素包括生物素、卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素、类亲和素。
43.作为本发明的更为优选的技术方案，所述的放射性同位素包括放射性碘、放射性铯、放射性铱、放射性钴。
44.本发明第七方面提供了如下任一项所述的应用：
45.(1)本发明第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段在制备肌钙蛋白i检测产品中的应用；
46.(2)本发明第二方面所述的dna分子在制备肌钙蛋白i检测产品中的应用；
47.(3)本发明第三方面所述的表达载体在制备肌钙蛋白i检测产品中的应用；
48.(4)本发明第四方面所述的细胞在制备肌钙蛋白i检测产品中的应用；
49.(5)本发明第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段在制备肌钙蛋白i相关疾病的诊断产品中的应用；
50.(6)本发明第二方面所述的dna分子在制备肌钙蛋白i相关疾病的诊断产品中的应用；
51.(7)本发明第三方面所述的表达载体在制备肌钙蛋白i相关疾病的诊断产品中的应用；
52.(8)本发明第四方面所述的细胞在制备肌钙蛋白i相关疾病的诊断产品中的应用；
53.作为本发明的优选的技术方案，所述的肌钙蛋白i相关疾病为心血管疾病，
54.作为本发明的优选的技术方案，所述的心血管疾病包括急性心肌梗死、急性冠状动脉综合征、肺梗、不稳定性心绞痛和/或心肌损伤。
55.术语“诊断”是指识别病理状况的存在或性质，例如但不限于肌钙蛋白i相关疾病。诊断方法的敏感性和特异性不同。诊断测定的“敏感性”是指检测出阳性的患病个体的百分比(真实阳性的百分比)。诊断测定的“特异性”是一个减去假阳性率的值，其中假阳性率定义为没有疾病的人呈阳性的比例。
附图说明
56.图1是心肌肌钙蛋白i的vnar诱导表达前后的考马斯亮蓝染色结果图；
57.图2是心肌肌钙蛋白i的vnar诱导表达后上清和包涵体的考马斯亮蓝染色结果图；
58.图3是利用直接抗原包被酶联免疫吸附实验检测克隆1的实验结果图；
59.图4是利用直接抗原包被酶联免疫吸附实验检测克隆2的实验结果图；
60.图5是利用酶联免疫吸附实验比较ctni的vnar和商业化的ctni的鼠源单克隆抗体的实验结果图；
61.图6是克隆1用于夹心酶联免疫吸附法进行ctni浓度检测的实验结果图；
62.图7是克隆2用于夹心酶联免疫吸附法进行ctni浓度检测的实验结果图。
具体实施方式
63.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
64.实施例1心肌肌钙蛋白i(cardiac troponin-i,ctni)vnar的获取
65.一、实验方法
66.首次获得本发明实施例提供的心肌肌钙蛋白i(cardiac troponin-i,ctni)vnar的方法如下：
67.1、vnar库的获取：
68.(1)以健康的成年(0.5～1.5年龄)条纹斑竹鲨作为免疫对象，采用心肌肌钙蛋白i(cardiac troponin-i,ctni)为抗原进行免疫，共免疫4-8次，且相邻两次免疫的时间间隔为10-20天；在一些实施方式中，共免疫5次，并且每隔14天免疫一次。
69.(2)完成免疫后，采集鲨鱼外周血淋巴细胞或者脾脏细胞，提取rna，并采用逆转录试剂盒反转录为cdna，随后经pcr法扩增获得vnar区编码基因。
70.(3)采用sfii限制性内切酶进行酶切后克隆进噬菌粒(phagemid)中，进行质粒构建；在一些实施方式中，噬菌粒包括pcomb3xss载体、pcantab5e载体、pcantab5l载体及pcantab5x载体等中的任一种。
71.(4)将构建好的质粒转化入大肠杆菌，将采用心肌肌钙蛋白i(cardiac troponin-i,ctni)vnar的展示在噬菌体m13的表面，得到初级文库菌，即由此获得vnar库。
72.2、vnar库的扩增：
73.具体包括以下步骤：
74.(1)取1支初级文库菌接种到50ml无抗性的2
×
ytg(g为2wt％的葡萄糖)中，在37℃、250rpm的条件下振荡培养至od600达0.5左右。
75.(2)加入感染复数(moi)为20：1的vcsm13噬菌体，在37℃的条件下静置15min，随后在37℃、250rpm的条件下振荡培养45min，再取100μl的菌液分别涂布在2
×
ytg amp tet和2
×
ytg kan的平板上，于37℃的条件下过夜培养。
76.(3)按照4000rpm的转速离心10min，弃去上清。
77.(4)用200ml新鲜的2
×
yt amp tet kan培养液重悬菌体，在30℃、150rpm的条件下振荡培养过夜。
78.(5)将上清转移到无菌管里，在4℃、14000rpm的条件下离心10分钟，随后将上清液转移到新管中，并按照每400μl上清液中加入100μl 40％的peg 4000和2.5m的nacl溶液，冰浴条件下剧烈震动15分钟。
79.(6)在4℃、14000rpm的条件下离心15分钟，随后去掉上清，得到ctni的vnar库，用4ml 1
×
te缓冲液溶解。
80.3、vnar的筛选和富集：
81.对ctni的vnar库进行三轮筛选和富集，其中，第一轮筛选和富集过程如下：
82.(1)吸取30μg的ctni抗原，溶于2ml的pbs溶液(ph＝7.2)中，转移至容量为5ml的免疫试管中，在4℃的条件下过夜。
83.(2)先用tris-hcl液清洗免疫试管3次，尽量去除上清，加入4ml 0.1m的tris-hcl
缓冲液(ph＝8.0)，室温静置2小时。
84.(3)将4ml 3％的bsa放入免疫试管中，室温缓慢摇动2小时，以封闭潜在蛋白结合位点，随后以pbs清洗3次。
85.(4)将1ml的噬菌体抗体库溶液加入免疫试管中，室温下，混合器缓慢摇晃30分钟，然后室温静置90分钟，以pbst清洗免疫试管10次，pbs清洗免疫试管10次，甩干。
86.(5)向免疫试管中加入600μl的glycine-hcl，缓慢摇晃，室温30分钟，然后加入100μl 0.1m的tris-hcl将ph调至7.5，加入2ml的新鲜xl1-blue菌液(od＝0.7)，在37℃的条件下静置50分钟，随后转移至50ml的离心管中，并加入5ml的2
×
yt，在37℃的条件下摇荡30分钟。
87.(6)加入1μl的vcsm13辅助噬菌体，在37℃的条件下静置50分钟，随后在3000g的离心力下离心5分钟，去掉上清，沉淀溶于50ml的2
×
yt amp kan培养基，在30℃的条件下过夜。
88.(7)采用peg4000沉淀培养基上清液中的噬菌体，在14000rpm的条件下离心，随后以2ml的1
×
te溶解噬菌体。
89.第二轮、第三轮的筛选和富集步骤同第一轮，在此不再展开赘述。
90.4、vnar的富集度检测：
91.采用elisa检测vnar的富集度，具体包括以下步骤：
92.(1)抗原包被：用ctni抗原分别包被elisa板，包被浓度为1μg/ml。
93.(2)bsa封闭。
94.(3)每个elisa孔加入不同富集度的ctni的vnar，稀释到pbst中，100μl/孔，静置1小时。
95.(4)抗m13噬菌体抗体(兔源)，稀释度为1:5000，100μl/孔，在37℃的条件下静置1小时。
96.(5)羊抗兔igg抗体(hrp)，稀释度为1:10000，100μl/孔，在37℃的条件下静置1小时。
97.(6)显色：pbst洗涤5次，轻轻拍干每孔加入100μl的显色剂，室温反应5-10min。
98.(7)每孔中加入100μl的终止液并混匀，终止显色反应。
99.(8)用酶标仪在450nm处测定吸光值；从吸光值看出，随着三轮筛选的进行，能够特异性识别结合ctni的vnar逐渐被富集，获得ctni的vnar库。
100.5、单克隆vnar菌落的选取：
101.phage-elisa初步检测抗原阳性重组vnar，具体步骤如下：
102.(1)取1.5ml ep管，加入2
×
ytg amp tet培养基，400μl/管。
103.(2)在三级vnar库(即第三轮筛选得到的ctni的vnar库)中随机挑取vnar单菌落，接种至上面各ep管中，在37℃、250rpm的条件下振荡培养过夜。
104.(3)次日，另取新ep管，每管加入400μl含有2.5
×
1010pfu/ml vcsm13的2
×
ytg amp tet kan培养基，再加入40μl过夜培养的菌液，在37℃、150rpm的条件下振荡培养2小时。
105.(4)1500
×
g离心20min，小心去上清，向ep管中加入400μl2
×
yt amp tet kan培养基，在37℃、250rpm的条件下振荡培养过夜。
gssg，50mm tris-hcl，ph8.0)，4℃透析24h。
129.(2)蛋白纯化：收集透析后的蛋白样品，0.45μm滤膜过滤后，通过常规his-tag亲和层析方法纯化vnar。
130.(3)超滤浓缩：将纯化后的蛋白样品加入millipore amicon-ultra-15超滤管，4000rpm，超滤离心30min，将收集管中剩余的液体回收，即为超滤浓缩后的vnar样品。
131.8、单克隆vnar的大规模获取
132.在上述基础上，需要再次获取本发明实施例的ctni的vnar时，只需要将含有所示核苷酸序列的ctni的vnar在原核或真核细胞中进行表达和纯化，即可获得大规模的ctni的vnar，具体在原核或真核细胞中的表达和纯化为基因工程领域的常规方法，为节约篇幅，在此不再展开赘述。
133.实施例2心肌肌钙蛋白i(cardiac troponin-i,ctni)vnar的性能检测
134.1、利用直接抗原包被酶联免疫吸附实验(elisa)检测vnar：
135.(1)抗原包被：用不同浓度的ctni抗原分别包被elisa板，包被浓度为0，10，50，200ng/孔,4℃放置过夜。
136.(2)弃去包被液后，用pbst洗涤3次，每孔加入150μl的1％bsa，37℃封闭1小时。
137.(3)pbst洗涤3次后，每孔加入100μl ctni的vnar(克隆1或者克隆2)，37℃孵育2小时。
138.(4)pbst洗涤3次后，加入100μl稀释后的hrp标记的二抗，37℃孵育1小时；
139.(5)显色:pbst洗涤5次,轻轻拍干,每孔加入100μl显色剂,室温反应5～10min；
140.(6)每孔中加入终止液100μl并混匀，终止显色反应；
141.(7)用酶标仪在450nm处测定吸光值。
142.结果如图3和图4所示。
143.2、利用酶联免疫吸附实验(elisa)比较ctni的vnar和商业化的ctni的鼠源单克隆抗体：
144.通过与上一段描述中相同的方法，比较了克隆1和商业化的ctni的鼠源单克隆抗体。结果如图5所示。与商业化的ctni的鼠源单克隆抗体相比，克隆1具有比鼠单抗好一些的抗原结合信号。
145.3利用夹心酶联免疫吸附实验(elisa)进行ctni浓度检测的应用：
146.(1)用商业化的ctni的鼠源ctni单克隆抗体包被elisa板，100μl/孔,4℃放置过夜。
147.(2)弃去包被液后，用pbst洗涤3次，每孔加入150μl的1％bsa，37℃封闭1小时。
148.(3)用pbst洗涤3次，加入不同浓度的ctni抗原，浓度为0，10，50，200ng/孔,37℃孵育2小时。
149.(4)pbst洗涤3次后，每孔加入100μl ctni的vnar(克隆1或者克隆2)，37℃孵育2小时。
150.(5)pbst洗涤3次后，加入100μl稀释后的hrp标记的二抗，37℃孵育1小时；
151.(6)显色:pbst洗涤5次,轻轻拍干,每孔加入100μl显色剂,室温反应5～10min；
152.(7)每孔中加入终止液100μl并混匀，终止显色反应；
153.(8)用酶标仪在450nm处测定吸光值。
154.结果如图6和图7所示。本发明的克隆1或克隆2可以用于夹心酶联免疫吸附法(elisa)进行ctni浓度检测的应用，比如试剂盒等。
155.以上结合附图详细描述了本技术的优选实施方式，但是，本技术并不限于上述实施方式中的具体细节，在本技术的技术构思范围内，可以对本技术的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本技术的保护范围。
156.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本技术对各种可能的组合方式不再另行说明。
157.此外，本技术的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本技术的思想，其同样应当视为本技术所公开的内容。