一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法与流程

1.本发明涉及生物检测的技术领域，尤其涉及一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法。


背景技术：

2.橄榄油以其独特的理化特性和营养价值越来越受到人们的青睐，其不饱和脂肪酸高达 82％
‑
87％，油酸、亚油酸、亚麻油酸含量的比例是最适合人体需要的比例。橄榄油具有抗氧化、预防癌症、美容等功效，价格比其他植物油要高得多。然而有的高价的橄榄油中会掺入低价的植物油或者其他初榨橄榄油及橄榄油果渣等。这种掺假油单从颜色、气味等外观上很难进行辨别真伪，严重损害了消费者的健康和权益。因此，为保障消费者的权益和健康，开发一种橄榄油真伪的鉴定方法，对控制食品质量安全和杜绝橄榄油掺假事件有着重要意义。
3.近年来，橄榄油掺杂的鉴定技术主要有原子转换质谱、核磁共振、光谱分析、高效液相色谱及其他方法。然而，由于橄榄油的化学组成成分随着生长季节及环境的变化而变化，通过理化方法无法准确鉴别橄榄油真伪。由于精炼食用植物油经过脱胶、脱酸、脱色等复杂的加工过程，其核酸遭到严重的破坏，含量非常低，再加上植物油的主要成分是脂类物质，水溶性的dna含量相当少且质量差。提取时经常会遇到提不到dna或是提到少量dna 但却扩增不出来的各种情况。因此，提取橄榄油中dna的重点在于如何有效、方便的富集和提取橄榄油中dna。橄榄油中残留的微量核酸说明代表物种特异性的基因可能被保留下来，不同物种其遗传性质都有不同的特异性，可通过检验其特异性基因来鉴别物种。因此基于dna分析的分子生物学方法为鉴定橄榄油掺杂的检测提供了有力保障。
4.有鉴于此，本发明人研究和设计了一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法。
6.为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
7.一种鉴定橄榄油掺杂的检测方法，包括以下步骤：
8.步骤一、引物设计：针对ncbi库中棕榈脂肪酸合成的基因设计并筛选：
9.针对橄榄油，筛选出第一引物对gl1及第二引物对gl2,所述第一引物对gl1包括上游引物gl1f及下游引物gl1r，所述第二引物对gl2包括上游引物gl2f及下游引物gl2r，所述gl1f、gl1r、gl2f、gl2r的核苷酸碱基序列分别如序列表seq id no:1至seq id no:4所示；
10.针对目标检测物，筛选出第一引物对eo1及第二引物对eo2，所述第一引物对eo1及第二引物对eo2根据实际目标检测物的ncbi库中棕榈脂肪酸合成的基因设计并筛选得到；
11.作为实时荧光定量pcr的内参，采用引物对ty2，所述引物对ty2包括上游引物ty2f 及下游引物ty2r，所述ty2f及所述ty2r的核苷酸碱基序列分别如序列表seq id no:5 及seq id no:6所示；
12.步骤二、待检测橄榄油的dna提取：采用质粒抽提试剂盒提取，得到待检测dna油
样；
13.作为实施例的优选方式，所述质粒抽提试剂盒采用上海碧云天生物技术有限公司生产销售的质粒抽提试剂盒d0026。
14.步骤三、实时荧光定量pcr反应：在所述待检测dna油样中加入引物对gl1、gl2、 eo1、eo2及ty2进行扩增，以在40个循环内是否读取到ct值为标准，判断是否得到阳性扩增，据此判断橄榄油是否掺杂。
15.作为实施例的优选方式，所述步骤一中，所述目标检测物为棕榈油，所述第一引物对 eo1包括上游引物eo1f及下游引物eo1r，所述第二引物对eo2包括上游引物eo2f及 eo2r，所述eo1f、所述eo1r、所述eo2f及所述eo2r的核苷酸碱基序列分别如序列表 seq id no:7至seq id no:10所示。
16.作为实施例的优选方式，所述步骤二的具体步骤为，取两支50ml的试管，每管各加入悬浮液6.5ml和裂解液6.5ml，并加入待检测样品至50ml，颠倒混匀震荡10min，10000r/min 离心2min，去油相，在水相中加入橄榄油至50ml，重复上述动作4次；在两支试管中第4 次离心后保留的水相中加入13ml试剂盒中的结合液随即上下颠倒6次，10000r/min离心 20min，然后按照试剂盒后续操作说明进行，合并两支试管的dna油样，制得待检测dna 油样，最后将待检测dna油样存于
‑
20℃中。
17.作为实施例的优选方式，所述实时荧光定量pcr的扩增参数如下：扩增反应体积为20ul， rox i 0.25ul，2x syker mix 10ul，浓度为10umol/l的引物0.4ul，ddh2o 7.35ul，dna模板2.0ul；扩增反应条件：95℃5min，95℃5s，60℃31s，循环数40。
18.作为实施例的优选方式，还包括实时荧光定量pcr标准曲线的绘制：即采用已知拷贝数的橄榄油及目标检测物作为标准样品；扩增后，测定各油样中相关荧光标记物的ct值，该ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制sybr green i实时荧光定量pcr标准曲线。
19.本发明针对植物油脂中核酸含量低、破坏严重且dna难以提取等一系列问题，采用一种核酸富集方法和dna提取试剂盒法，有效地从橄榄油和棕榈油中提取到可用于pcr扩增反应的dna模板，另外，设计并通过荧光定量pcr筛选出能够有效扩增dna模板的引物。本发明能够有效的从橄榄油中鉴别出掺入的其他油品，用设计的引物对油样dna进行 sybr green i实时荧光定量pcr检测，只要在混合的油样中扩增出其他植物油的基因片段，就可以确认橄榄油中掺杂其他植物油。
具体实施方式
20.实施例1橄榄油的检测
21.材料：橄榄油
22.试剂：质粒大量抽提试剂盒(型号：d0026)和质粒小量抽提试剂盒(型号：d0003)，均购自上海碧云天生物技术有限公司。
23.橄榄油dna的提取步骤：取两支50ml的试管，每管各加入试剂盒中的悬浮液6.5ml 和裂解液6.5ml，并加入橄榄油至50ml，颠倒混匀震荡10min，10000r/min离心2min，去油相，在水相中加入橄榄油至50ml，重复上述动作4次。在两支试管中第4次离心后保留的水相中加入13ml试剂盒中的结合液随即上下颠倒6次，10000r/min离心20min，然后按照试剂盒后
续操作说明进行，合并两支试管的dna油样，制得待检测dna油样，最后将待检测dna油样存于
‑
20℃中。
24.在待检测dna油样中加入引物gl1、gl2、ty2(内参)进行实时荧光定量pcr扩增：
25.实时荧光定量pcr扩增的参数如下：扩增反应体积为20ul，rox i 0.25ul，2x syker mix 10ul，浓度为10umol/l的引物0.4ul，ddh2o 7.35ul，dna模板2.0ul；
26.实时荧光定量pcr扩增反应条件：95℃5min，95℃5s，60℃31s，循环数40，以水做空白对照，根据标准曲线和ct值判断是否从油样中提取到dna及引物特异性。
27.其中：gl1：f：5
’‑
actcgcacacactccctttcc
‑3’
；
28.r：5
’‑
tttttagctcactggccatcc
‑3’
；
29.gl2：f：5
’‑
ggtgttattcccgtggcttcag
‑3’
；
30.r：5
’‑
ggtgttattcccgtggcttcag
‑3’
；
31.ty2：f：5
’‑
tctgccctatcaactttcgatggta
‑3’
32.r：5
’‑
aatttgcgcgcctgctgccttcctt
‑3’
。
33.结果：以在40个循环内是否读取到ct值为标准，判断是否得到阳性扩增。gl1、gl2、 ty2均得到100％阳性扩增率。但ct值较大，可能原因是因为橄榄油核酸破坏严重，提取到dna浓度较低，引物的扩增效率各不相同，综合分析可以得出所有样品都提取到dna 且引物具有特异性。
34.实施例2棕榈油的检测
35.材料：棕榈油
36.试剂：质粒大量抽提试剂盒(型号：d0026)和质粒小量抽提试剂盒(型号：d0003)，均购自上海碧云天生物技术有限公司。
37.棕榈油dna的提取步骤：取两支50ml的试管，每管各加入试剂盒中的悬浮液6.5ml 和裂解液6.5ml，并加入棕榈油至50ml，颠倒混匀震荡10min，10000r/min离心2min，去油相，在水相中加入棕榈油至50ml，重复上述动作4次。在两支试管中第4次离心后保留的水相中加入13ml试剂盒中的结合液随即上下颠倒6次，10000r/min离心20min，然后按照试剂盒后续操作说明进行，最后将dna油样存于
‑
20℃中。
38.在dna油样中加入引物eo1、eo2、ty2(内参)进行实时荧光定量pcr扩增；
39.实时荧光定量pcr扩增的参数如下：扩增反应体积为20ul，rox i 0.25ul，2x syker mix 10ul，浓度为10umol/l的引物0.4ul，ddh2o 7.35ul，dna模板2.0ul；
40.实时荧光定量pcr扩增反应条件：95℃5min，95℃5s，60℃31s，循环数40，以水做空白对照，根据标准曲线和ct值判断是否从油样中提取到dna及引物特异性。
41.其中：eo1：f：5
’‑
tccttcttatccgtggtccg
‑3’
42.r：5
’‑
gtgcgacggtaataggagga
‑3’
43.eo2：f：5
’‑
cggagaagaagcaatgacgg
‑3’
44.r：5
’‑
aaattccctctgcccctacc
‑3’
。
45.结果：以在40个循环内是否读取到ct值为标准，判断是否得到阳性扩增。eo1、eo2、 ty2均得到100％阳性扩增率。但ct值较大，可能原因是因为棕榈油核酸破坏严重，提取到dna浓度较低，引物的扩增效率各不相同，综合分析可以得出所有样品都提取到dna 且引物具有特异性。
46.实施例3混有棕榈油的橄榄油检测
47.材料：混有棕榈油的橄榄油
48.试剂：质粒大量抽提试剂盒(型号：d0026)和质粒小量抽提试剂盒(型号：d0003)，均购自上海碧云天生物技术有限公司。
49.混合油dna的提取步骤：取两支50ml的试管，每管各加入悬浮液6.5ml和裂解液6.5ml，并加入混合油至50ml，颠倒混匀震荡10min，10000r/min离心2min，去油相，在水相中加入混有棕榈油的橄榄油至50ml，重复上述动作4次。在两支试管中第4次离心后保留的水相中加入13ml试剂盒中的结合液随即上下颠倒6次，10000r/min离心20min，然后按照试剂盒后续操作说明进行，最后将dna油样存于
‑
20℃中。
50.在dna提取液中加入引物gl1、gl2、eo1、eo2、ty2(内参)进行实时荧光定量 pcr扩增；
51.实时荧光定量pcr扩增的参数如下：扩增反应体积为20ul，rox i 0.25ul，2x syker mix 10ul，浓度为10umol/l的引物0.4ul，ddh2o 7.35ul，dna模板2.0ul；
52.实时荧光定量pcr扩增反应条件：95℃5min，95℃5s，60℃31s，循环数40，以水做空白对照，根据标准曲线和ct值判断是否从油样中提取到dna及是否橄榄混合油中扩增出棕榈油特异性基因片段。
53.结果：以在40个循环内是否读取到ct值为标准，判断是否得到阳性扩增。eo1、eo2、 gl1、gl2、ty2均得到100％阳性扩增率。但ct值较大，可能原因是因为混合油的核酸破坏严重，提取到dna浓度较低，引物的扩增效率各不相同，综合分析可以得出所有样品都提取到dna且橄榄混合油中检测到棕榈油特异性基因。
54.虽然橄榄油经过多次脱胶、脱酸、脱色等复杂的加工过程，本发明通过dna富集及提取方法，发现橄榄油等植物油中还残留微量核酸，并且本发明能够运用此方法检测出橄榄油掺杂其他植物油品种，用设计的引物对油样dna进行sybr green i实时荧光定量pcr 检测，只要在混合的油样中扩增出其他植物油的基因片段，就可以确认橄榄油中掺杂其他植物油，类似本发明的检测方法，所不同的是设计的引物不同，即需要根据具体的目标检测物而设计引物。
55.以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。