建立和维持早期胚胎样细胞的培养基和方法

技术特征：
1.一种用于培养灵长类多能干细胞(psc)的化学成分确定的培养基，其特征在于，所述培养基含有用于培养干细胞的基础培养基，并补充了hdac抑制剂以及prc抑制剂和/或ezh2抑制剂。2.如权利要求1所述的化学成分确定的培养基，其特征在于，所述prc抑制剂和/或ezh2抑制剂是sah抑制剂。3.如权利要求1和2所述的化学成分确定的培养基，其特征在于，所述培养基还补充有选自l-抗坏血酸或其衍生物、jak/stat3信号传导激活剂、mapk/erk信号传导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂中的一种或多种组分；任选地，所述培养基还补充有选自activin/nodal信号传导激活剂、rock抑制剂和胞外基质中的一种或多种组分。4.如权利要求1和2所述的化学成分确定的培养基，其特征在于，所述prc抑制剂和/或ezh2抑制剂或所述sah抑制剂选自3-去氮腺嘌呤a(3-deazaneplanocin a，dznep)和cpi-1205；优选地，所述培养基中dznep的终浓度为5至80nm、优选5至50nm；优选地，所述培养基中cpi-1205的终浓度为0.5至5mm、优选1至3mm；和/或所述hdac抑制剂选自曲古抑菌素a(trichostatin a，tsa)、丙戊酸(valproic acid，vpa)和丁酸钠(sodium butyrate，nab)；优选地，所述培养基中古抑菌素a的终浓度为3至30nm、优选3至25nm；优选地，所述培养基中丙戊酸的终浓度为0.25至2mm、优选0.5至1.5mm；优选地，所述培养基中丁酸钠的终浓度为0.25至2mm、优选0.5至1.5mm。5.如权利要求3所述的化学成分确定的培养基，其特征在于，所述培养基中l-抗坏血酸的终浓度为40至70μg/ml；和/或所述培养基中所述jak/stat3信号传导激活剂的终浓度为10至50ng/ml；优选地，所述jak/stat3信号传导激活剂为lif；和/或所述培养基中所述mapk/erk信号转导抑制剂的终浓度为0.5至3μm；优选地，所述mapk/erk信号转导抑制剂为pd0325901；和/或所述培养基中所述端锚聚合酶抑制剂的终浓度为2至8μm；优选地，所述端锚聚合酶抑制剂选自iwr1和xav939；和/或所述activin/nodal信号传导激活剂的终浓度为10至25ng/ml；优选地，所述activin/nodal信号转导激活剂选自activin a和nodal；和/或所述培养基中rock抑制剂的终浓度为0.5至2μm；优选地，所述rock抑制剂选自y27632、thiazovivin和羟基法舒地尔(hydroxyfasudil)；和/或所述培养基中胞外基质的量为0.1至0.5％(v/v)；优选地，所述胞外基质选自matrigel
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。6.如权利要求1所述的化学成分确定的培养基，其特征在于，所述培养基包含：(a)终浓度为5至15nm的dznep或终浓度为0.5至2mm的cpi-1205，以及终浓度为3至30nm的曲古抑菌素a、或终浓度为0.25至2mm的丙戊酸、或终浓度为0.25至2mm的丁酸钠，优选终浓度为3至10nm的曲古抑菌素a、或终浓度为0.25至1mm的丙戊酸、或终浓度为0.25至1mm的丁酸钠；或者，终浓度为5至80nm、优选5至50nm的dznep或终浓度为0.5至5mm、优选0.5至3mm的cpi-1205，以及终浓度为3至10nm的曲古抑菌素a、或终浓度为0.25至0.5mm的丙戊酸、或终浓度为0.25至0.5mm的丁酸钠；(b)终浓度为40至70μg/ml的l-抗坏血酸；
(c)终浓度为10至30ng/ml的lif；(d)终浓度为0.5至1.5μm的pd0325901；(e)终浓度为3至6μm的iwr1或xav939；并进一步补充有：(1)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(2)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或(3)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(4)终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(5)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；或终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质。7.如权利要求6所述的化学成分确定的培养基，其特征在于，所述培养基包含10nm的dznep或1mm的cpi-1205；5nm的曲古抑菌素a，或0.5mm的丙戊酸，或0.5mm的丁酸钠；50μg/ml的l-抗坏血酸；20ng/ml的lif；1μm的pd0325901；和5μm的iwr1或5μm的xav939；并进一步补充有(1)20ng/ml的activin a或nodal，1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(2)20ng/ml的activin a或nodal，以及1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；(3)20ng/ml的activin a或nodal，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(4)1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，以及0.2％(v/v)的细胞外基质；或(5)20ng/ml的activin a或nodal，或1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，或0.2％(v/v)的细胞外基质。8.如权利要求1所述的化学成分确定的培养基，其特征在于，所述培养基包含终浓度为40至70nm的dznep或终浓度为2至4mm的cpi-1205；终浓度为10至30nm的曲古抑菌素a，或终浓度为0.5至1.5mm的丙戊酸，或终浓度为0.5至1.5mm的丁酸钠；终浓度为40至70μg/ml的l-抗坏血酸；终浓度为10至30ng/ml的lif；终浓度为0.8至1.5μm的pd0325901；以及终浓度为3至6μm的iwr1或xav939；并进一步补充有：(1)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(2)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或(3)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(4)终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(5)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；或终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质。9.如权利要求8所述的化学成分确定的培养基，其特征在于，所述培养基包含50nm的
dznep或3mm的cpi-1205；20nm的曲古抑菌素a，或1mm的丙戊酸，或1mm的丁酸钠；50μg/ml的l-抗坏血酸；20ng/ml的lif；1μm的pd0325901；和5μm的iwr1或5μm的xav939；并进一步补充有(1)20ng/ml的activin a或nodal，1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和0.2％(v/v)的胞外基质；或(2)20ng/ml的activin a或nodal，以及1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；(3)20ng/ml的activin a或nodal，和0.2％(v/v)的胞外基质；或(4)1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，以及0.2％(v/v)的胞外基质；或(5)20ng/ml的activin a或nodal，或1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，或0.2％(v/v)的胞外基质。10.如权利要求1至9中任一项所述的化学成分确定的培养基，其特征在于，所述基础培养基选自dulbecco改良eagle培养基(dmem)、最小必需培养基(mem)、基础培养基eagle(bme)、rpmi1640、f10、f12、α最小必需培养基(αmem)、glasgow最小必需培养基(gmem)、iscove改良dulbecco培养基、神经基础培养基、dmem/f12和高级dmem/f12，以及它们的组合；优选地，所述基础培养基是高级dmem/f12和神经基础培养基的1:1(v/v)的混合物。11.如权利要求1至9中任一项所述的化学成分确定的培养基，其特征在于，所述培养基还补充有选自血清替代物、替代碳源、非必需氨基酸、l-谷氨酰胺或其替代物和抗生素的一种或多种组分。12.如权利要求11所述的化学成分确定的培养基，其特征在于，所述血清替代物选自kosr、n2和b27及其组合；优选地，所述血清替代物是n2和b27的1:1(w/w)的混合物；所述替代碳源是丙酮酸盐，例如丙酮酸钠；所述l-谷氨酰胺或其替代物是含l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽的0.85％氯化钠溶液的glutamax
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补充物；和/或所述抗生素选自青霉素、链霉素或青霉素和链霉素的混合物。13.一种将灵长类psc转化成着床前内细胞团样细胞(iclc)和/或8细胞胚胎样细胞(8clc)的方法，或将iclc转化成8clc的方法，其特征在于，所述方法包括在prc和/或ezh2抑制剂以及hdac抑制剂的存在下培养所述灵长类psc或iclc；优选地，所述prc和/或ezh2抑制剂为sah抑制剂。14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括在以下条件下培养灵长类psc或iclc：存在所述prc和/或ezh2抑制剂以及hdac抑制剂，以及选自l-抗坏血酸、jak/stat3信号传导激活剂、mapk/erk信号传导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂的一种或多种组分，并且任选地存在选自activin/nodal信号传导激活剂、rock抑制剂和胞外基质的一种或多种组分。15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述prc和/或ezh2抑制剂或所述sah抑制剂选自dznep和cpi-1205；所述hdac抑制剂选自曲古抑菌素a、丙戊酸和丁酸钠；优选地，所述灵长类psc或iclc在终浓度为5至80nm、优选为5至50nm的dznep或终浓度为0.5至5mm、优选为1至3mm的cpi-1205存在下，且在终浓度为3至30nm、优选为3至25nm的曲古抑菌素a，或终浓度为0.25至2mm、优选0.5至1.5mm的丙戊酸，或终浓度为0.25至2mm、优选0.5至1.5mm的丁酸钠的存在下培养。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述l-抗坏血酸的终浓度为40至70μg/ml；和/或所述jak/stat3信号传导激活剂的终浓度为10至50ng/ml；优选地，所述jak/stat3信号传导激活剂为lif；和/或所述mapk/erk信号转导抑制剂的终浓度为0.5至3μm；优选地，所述mapk/erk信号转导抑制剂为pd0325901；和/或所述端锚聚合酶抑制剂的终浓度为2至8μm；优选地，所述端锚聚合酶抑制剂选自iwr1和xav939；和/或所述activin/nodal信号传导激活剂的终浓度为10至25ng/ml；优选地，所述activin/nodal信号转导激活剂选自activin a和nodal；和/或所述rock抑制剂的终浓度为0.5至2μm；优选地，所述rock抑制剂选自y27632、thiazovivin和羟基法舒地尔；和/或所述细胞外基质的量为0.1至0.5％(v/v)；优选地，所述细胞外基质选自matrigel
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。17.一种将灵长类psc转化成着床前内细胞团样细胞(iclc)的方法，其特征在于，所述方法包括在权利要求6或7所述的培养基中培养所述灵长类psc；其中，所述培养基的基础培养基选自dulbecco改良eagle培养基(dmem)、最小必需培养基(mem)、基础培养基eagle(bme)、rpmi1640、f10、f12、α最小必需培养基(αmem)、glasgow最小必需培养基(gmem)、iscove改良dulbecco培养基、神经基础培养基、dmem/f12和高级dmem/f12及其组合；优选地，所述基础培养基是高级dmem/f12和神经基础培养基的1:1(v/v)的混合物。18.一种将灵长类psc或着床前内细胞团样细胞(iclc)转化成8细胞胚胎样细胞(8clc)的方法，其特征在于，所述方法包括在权利要求8或9所述的培养基中培养所述灵长类psc或iclc；其中，所述培养基的基础培养基选自dulbecco改良eagle培养基(dmem)、最小必需培养基(mem)、基础培养基eagle(bme)、rpmi1640、f10、f12、α最小必需培养基(αmem)、glasgow最小必需培养基(gmem)、iscove改良dulbecco培养基、神经基础培养基、dmem/f12和高级dmem/f12及其组合；优选地，所述基础培养基是高级dmem/f12和神经基础培养基的1:1(v/v)的混合物。19.一种将灵长类psc转化成着床前内细胞团样细胞(iclc)的方法，该方法包括：(a)通过基因工程敲降或敲除所述灵长类psc的一个或多个相关基因，从而抑制sah、prc和/或ezh2的活性；(b)用化学成分确定的培养基培养步骤(a)获得的经基因工程改造的细胞；其中，所述培养基包含：终浓度为3至30nm的曲古抑菌素a、或终浓度为0.25至2mm的丙戊酸、或终浓度为0.25至2mm的丁酸钠，优选终浓度为3至10nm的曲古抑菌素a、或终浓度为0.25至1mm的丙戊酸、或终浓度为0.25至1mm的丁酸钠，和任选的终浓度为5至15nm的dznep或终浓度为0.5至2mm的cpi-1205，或终浓度为3至10nm的曲古抑菌素a、或终浓度为0.25至0.5mm的丙戊酸、或终浓度为0.25至0.5mm的丁酸钠和任选的终浓度为5至80nm、优选5至50nm的dznep或终浓度为0.5至5mm的cpi-1205；终浓度为40至70μg/ml的l-抗坏血酸；终浓度为10至30ng/ml的lif；终浓度为0.5至1.5μm的pd0325901；终浓度为3至6μm的iwr1或xav939；；且所述培养基进一步补充有：
(1)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(2)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或(3)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(4)终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(5)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；或终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质。优选地，所述培养基包含：5nm的曲古抑菌素a，或0.5mm的丙戊酸，或0.5mm的丁酸钠；50μg/ml的l-抗坏血酸；20ng/ml的lif；1μm的pd0325901；5μm的iwr1或5μm的xav939；和任选的10nm的dznep或1mm的cpi-1205；且所述培养基进一步补充有(1)20ng/ml的activin a或nodal，1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(2)20ng/ml的activin a或nodal，以及1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；(3)20ng/ml的activin a或nodal，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(4)1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，以及0.2％(v/v)的细胞外基质；或(5)20ng/ml的activin a或nodal，或1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，或0.2％(v/v)的细胞外基质。20.一种将灵长类psc或iclc转化成8细胞胚胎样细胞(8clc)的方法，该方法包括：(a)通过基因工程敲降或敲除灵长类psc或iclc的一个或多个相关基因，从而抑制sah、prc和/或ezh2的活性；(b)用化学成分确定的培养基培养步骤(a)获得的经基因工程改造的细胞；其中，所述培养基包含：终浓度为终浓度为10至30nm的曲古抑菌素a，或终浓度为0.5至1.5mm的丙戊酸，或终浓度为0.5至1.5mm的丁酸钠；终浓度为40至70μg/ml的l-抗坏血酸；终浓度为10至30ng/ml的lif；终浓度为0.5至1.5μm的pd0325901；终浓度为3至6μm的iwr1或xav939；和任选的终浓度为40至70nm的dznep或终浓度为2至4mm的cpi-1205；且所述培养基进一步补充有：(1)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(2)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或(3)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(4)终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(5)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；或终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质。优选地，所述培养基包含20nm的曲古抑菌素a，或1mm的丙戊酸，或1mm的丁酸钠；50μg/ml的l-抗坏血酸；20ng/ml的lif；1μm的pd0325901；5μm的iwr1或5μm的xav939；和任选的
50nm的dznep或3mm的cpi-1205；且所述培养基进一步补充有(1)20ng/ml的activin a或nodal，1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(2)20ng/ml的activin a或nodal，以及1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；(3)20ng/ml的activin a或nodal，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(4)1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，以及0.2％(v/v)的细胞外基质；或(5)20ng/ml的activin a或nodal，或1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，或0.2％(v/v)的细胞外基质。21.一种将灵长类psc转化成着床前内细胞团样细胞(iclc)的方法，该方法包括：(a)通过基因工程敲降或敲除所述灵长类psc的一个或多个相关基因，从而抑制hdac的活性；(b)用化学成分确定的培养基培养步骤(a)获得的经基因工程改造的细胞；其中，所述培养基包含：终浓度为5至80nm、优选5至50nm的dznep或终浓度为0.5至5mm的cpi-1205，优选终浓度为5至15nm的dznep或终浓度为0.5至2mm的cpi-1205，和任选的终浓度为终浓度为3至10nm的曲古抑菌素a、或终浓度为0.25至0.5mm的丙戊酸、或终浓度为0.25至0.5mm的丁酸钠，或终浓度为5至15nm的dznep或终浓度为0.5至2mm的cpi-1205，和任选的终浓度为3至30nm的曲古抑菌素a、或终浓度为0.25至2mm的丙戊酸、或终浓度为0.25至2mm的丁酸钠；终浓度为40至70μg/ml的l-抗坏血酸；终浓度为10至30ng/ml的lif；终浓度为0.5至1.5μm的pd0325901；终浓度为3至6μm的iwr1或xav939；且所述培养基进一步补充有：(1)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(2)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或(3)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(4)终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(5)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；或终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质。优选地，所述培养基包含：5nm的曲古抑菌素a，或0.5mm的丙戊酸，或0.5mm的丁酸钠；50μg/ml的l-抗坏血酸；20ng/ml的lif；1μm的pd0325901；5μm的iwr1或5μm的xav939；和任选的10nm的dznep或1mm的cpi-1205；且所述培养基进一步补充有(1)20ng/ml的activin a或nodal，1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(2)20ng/ml的activin a或nodal，以及1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；(3)20ng/ml的activin a或nodal，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(4)1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，以及0.2％(v/v)的细胞外基质；或(5)20ng/ml的activin a或nodal，或1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，或0.2％(v/v)的细胞外基质。22.一种将灵长类psc或iclc转化成8细胞胚胎样细胞(8clc)的方法，该方法包括：(a)通过基因工程敲降或敲除所述灵长类psc或iclc的一个或多个相关基因，从而抑制hdac的活性；(b)用化学成分确定的培养基培养步骤(a)获得的经基因工程改造的细胞；其中，所述
培养基包含：终浓度为终浓度为10至30nm的曲古抑菌素a，或终浓度为0.5至1.5mm的丙戊酸，或终浓度为0.5至1.5mm的丁酸钠；终浓度为40至70μg/ml的l-抗坏血酸；终浓度为10至30ng/ml的lif；终浓度为0.5至1.5μm的pd0325901；终浓度为3至6μm的iwr1或xav939；和任选的终浓度为40至70nm的dznep或终浓度为2至4mm的cpi-1205；且所述培养基进一步补充有：(1)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(2)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或(3)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(4)终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；以及0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质；或(5)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；或终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或0.1％至0.5％(v/v)的胞外基质。优选地，所述培养基包含20nm的曲古抑菌素a，或1mm的丙戊酸，或1mm的丁酸钠；50μg/ml的l-抗坏血酸；20ng/ml的lif；1μm的pd0325901；5μm的iwr1或5μm的xav939；和任选的50nm的dznep或3mm的cpi-1205；且所述培养基进一步补充有(1)20ng/ml的activin a或nodal，1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(2)20ng/ml的activin a或nodal，以及1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；(3)20ng/ml的activin a或nodal，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(4)1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，以及0.2％(v/v)的细胞外基质；或(5)20ng/ml的activin a或nodal，或1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，或0.2％(v/v)的细胞外基质。23.如权利要求13至22中任一项所述的方法，其特征在于，所述灵长类psc选自：(i)esc系和/或ecc系的细胞；(ii)ipsc系的细胞；(iii)体外培养的着床前囊胚的内细胞团(icm)的细胞；(iv)体外培养的着床后囊胚的内细胞团的细胞；(v)体外培养的8细胞(8c)阶段至桑椹胚阶段的胚胎的细胞。24.如权利要求13至22中任一项所述的方法，其特征在于，所述灵长类psc或iclc在选自以下的一种或多种条件下培养：(i)在饲养细胞上；(ii)在没有饲养细胞的胞外基质上；(iii)在没有饲养细胞的悬浮液中；(iv)在约37℃的低氧或常氧条件下；(v)以单细胞每3至4天传代，分裂比为1:4至1:8；(vi)每日更换培养基。25.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂存在下培养体细胞以重编程所述体细胞产生灵长类iclc的步骤。26.一种分离的灵长类着床前内细胞团样细胞(iclc)，其特征在于，所述iclc具有与相应灵长类着床前内细胞团相近的转录组、转座元件(te)特征、dna甲基化组、染色质开放状态和代谢状态。27.如权利要求26所述的灵长类iclc，其特征在于，所述细胞还具有以下一种或多种特
征：1)能够自我更新，并在培养中保持多能性；2)根据核型保持培养中基因组的稳定性；3)能够产生3个生殖层的细胞；4)能够产生原始生殖细胞样细胞；5)能够嵌合到小鼠胚胎中，并分化为胚胎和胚胎外组织；6)能够在体外转化至胚胎外细胞命运；以及7)能够在体外形成囊胚样结构。28.如权利要求26所述的iclc，其由权利要求17所述的方法获得。29.一种分离的灵长类8细胞胚胎样细胞(8clc)，其特征在于，所述细胞的8细胞胚胎(8c)特异性标志基因表达水平显著高于产生该8clc的iclc和/或始发态psc；优选地，所述细胞具有与相应的灵长类8细胞胚胎相近的转录组、转座元件(te)特征和染色质开放状态；优选地，所述8clc由权利要求18所述的方法获得。30.如权利要求29所述的8clc，其特征在于，所述细胞还具有以下一种或多种特征：1)在培养过程中保持稳定的核型；2)能够产生3个生殖层的细胞；3)能够产生原始生殖细胞样细胞；4)能够嵌合到小鼠胚胎中，并分化为胚胎和胚胎外组织；5)能够在体外转化至胚胎外细胞命运；以及6)能够在体外形成囊胚样结构。31.一种包含权利要求26至30中任一项所述的细胞和培养基的细胞培养物；优选地，所述培养基如权利要求1至12中任一项所述。32.一种试剂盒，包含sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂，和任选的：(1)选自l-抗坏血酸、jak/stat3信号传导激活剂、mapk/erk信号转导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂的一种或多种组分；(2)选自activin/nodal信号传导激活剂、rock抑制剂和胞外基质的一种或多种组分；(3)选自基础培养基、血清替代物、替代碳源、非必需氨基酸、l-谷氨酰胺或其替代物和抗生素的一种或多种组分。33.如权利要求32所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1至12中任一项所述的培养基。34.一种组合物，包含sah/prc/ezh2抑制剂和hdac抑制剂，和任选的：(1)选自l-抗坏血酸、jak/stat3信号传导激活剂、mapk/erk信号转导抑制剂和端锚聚合酶抑制剂的一种或多种组分；和(2)选自activin/nodal信号传导激活剂和rock抑制剂的一种或多种组分。35.如权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有：dznep或cpi-1205；曲古抑菌素a或丙戊酸或丁酸钠；以及任选的l-抗坏血酸，任选的lif，任选的pd0325901，和任选的iwr1或xav939；优选地，组合物中各组分的量足以使得含该组合物的培养基含有：5至15nm、优选10nm的dznep或0.5至2mm、优选1mm的cpi-1205；3至6nm、优选5nm的曲古抑菌素a，或0.25至1mm、优选0.5mm的丙戊酸，或0.25至
1mm、优选0.5mm的丁酸钠；和任选的40至90μg/ml、优选50μg/ml的l-抗坏血酸，任选的10-30ng/ml、优选20ng/ml的lif，任选的0.5至1.5μm、优选1μm的pd0325901，任选的3至6μm、优选5μm的iwr1或xav939；优选地，所述组合物进一步地包含activin a或nodal，和/或y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和/或胞外基质；优选地，组合物中所述组分的含量使得含该组合物的培养基含有：10至25ng/ml、优选20ng/ml的activin a或nodal，和/或0.5至2μm、优选1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和/或0.1至0.5％(v/v)、优选0.2％(v/v)的胞外基质；或所述组合物含有：dznep或cpi-1205；曲古抑菌素a或丙戊酸或丁酸钠；和任选的l-抗坏血酸，任选的lif，任选的pd0325901，任选的iwr1或xav939；优选地，组合物中各组分的含量使得该该组合物的培养基含有：40至70nm、优选50nm的dznep或2至4mm、优选3mm的cpi-1205；10至30nm、优选20nm的曲古抑菌素a，或0.5至1.5mm、优选1mm的丙戊酸，或0.5至1.5mm、优选1mm的丁酸钠；和任选的40至90μg/ml、优选50μg/ml的l-抗坏血酸，任选的10至30ng/ml、优选20ng/ml的lif，任选的0.5至1.5μm、优选1μm的pd0325901，任选的3至6μm、优选5μm的iwr1或xav939；优选地，所述组合物进一步地包含activin a或nodal，和/或y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和/或胞外基质；优选地，组合物中所述组分的含量使得含该组合物的培养基含有10至25ng/ml、优选20ng/ml的activin a或nodal，和/或0.5至2μm、优选1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和/或0.1至0.5％(v/v)、优选0.2％(v/v)的胞外基质。36.能促进stella表达或提高stella活性的物质在制备试剂、培养基或试剂盒中的用途，所述试剂、培养基或试剂盒用于使体细胞重编程为iclc、促进灵长类psc向iclc转化、或促进灵长类psc或iclc向8clc转化；和能促进stella表达或提高stella活性的物质在使体细胞重编程为iclc、促进灵长类psc向iclc转化、或促进灵长类psc和/或iclc向8clc转化中的用途。37.如权利要求36所述的用途，其特征在于，所述能促进stella的表达或提高stella活性的物质是sah/prc/ezh2的抑制剂，所述抑制剂包括dznep和cpi-1205。38.能促进khdc1l、trim60和/或包括tprx1和rgfx的真哺乳亚纲全能细胞同源盒(etchbox)家族基因表达，或提高khdc1l、trim60和/或包括tprx1和rgfx的etchbox家族蛋白活性的物质在制备试剂、培养基或试剂盒中的用途，所述试剂、培养基或试剂盒用于促进灵长类psc或iclc向8clc转化；和能促进khdc1l、trim60和/或包括tprx1和rgfx的etchbox家族基因表达，或提高khdc1l、trim60和/或包括tprx1和rgfx的etchbox家族蛋白活性的物质在促进灵长类psc和/或iclc向8clc转化中的用途。39.如权利要求33所述的用途，其特征在于，所述能促进khdc1l、trim60和/或包括tprx1和rgfx的etchbox家族基因表达，或提高khdc1l、trim60和/或包括tprx1和rgfx的etchbox家族蛋白活性的物质是sah/prc/ezh2的抑制剂，所述抑制剂包括dznep和cpi-1205。

技术总结
本发明提供建立和维持哺乳动物早期胚胎样细胞的培养基和方法。本发明的培养基用于培养哺乳动物多能干细胞(PSC)，化学成分确定，含有用于培养干细胞的基础培养基，并补充了S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAH)/多梳抑制复合体(PRC)/EZH2抑制剂和HDAC抑制剂。利用本发明的培养基能够将灵长类(人和非人)动物PSC转化成着床前内细胞团样细胞(ICLC)或8细胞胚胎样细胞(8CLC)。胞(8CLC)。


技术研发人员：米格尔
受保护的技术使用者：中国科学院广州生物医药与健康研究院
技术研发日：2020.11.11
技术公布日：2022/5/16