一种减毒沙门氏菌分泌表达RBD结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统及其应用的制作方法

一种减毒沙门氏菌分泌表达rbd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种减毒沙门氏菌分泌表达rbd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统及其应用。


背景技术：

2.由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(sars-cov-2)引起的2019年冠状病毒疾病(covid-19)大流行是一个世纪以来人类面临的最严峻挑战，截至2020 年9月1日，累计感染超过2700万人，并造成超过80万人的死亡。这种新型冠状病毒与2003年爆发的sars冠状病毒(sars-cov)的基因组有约82％相似度，两种冠状病毒也共享相同的细胞受体，即血管紧张素转换酶2(ace2) (lan j等人,2020,nature 581:215-220.)。尽管存在这些相似之处，新型冠状病毒比sars病毒扩散得更广泛，更快速，也更致命(zhu n等人,2020,n engl j med, 382:727-733.)。因此，为了有效地防治新型冠状病毒的传播，人们急需开发出一种安全、高效、廉价的sars-cov-2疫苗。在早期针对sars-cov疫苗的开发过程中，研究人员发现针对病毒刺突蛋白(s蛋白)的抗体能高效的中和病毒并预防感染(yang zy等人,2005,proc natl acad sci u s a 102:797-801.)，因此针对 sars-cov-2的s蛋白，尤其是该蛋白中的rbd区域，是当下抗病毒药物及疫苗开发的首要靶点(walls ac等人,2020,cell 181:281-292.e6.)。
3.现阶段已有多家研究所与制药公司在快速开发新型冠状病毒疫苗，涉及减毒活疫苗、重组病毒载体疫苗、灭活病毒疫苗、蛋白亚基疫苗、病毒样颗粒(vlp) 疫苗以及核酸疫苗等多种类型(jeyanathan m等人,2020,nat rev immunol 20: 615-632.)。尽管减毒活疫苗显示出较高的保护力，但也伴随着高风险；灭活疫苗、重组病毒疫苗和核酸疫苗面临费用高昂，接种不便等问题；而直接接种传统的重组蛋白疫苗因不能很好的激起细胞免疫反应，而无法提供较好的保护效果，往往需要额外佐剂的添加(guy b等人,2007,nat rev microbiol 5:505-517.)。迄今为止，国内外所有研发的疫苗都是通过注射给药，目前国际上已经多个国家报道了新冠疫苗的副作用，甚至有出现死亡案例的报道。注射给药是最为直接的给药途径，但是也是所有给药途径中风险最高、成本最大的给药方式。迄今为止，在新冠疫苗的研发中还缺乏其他更为方便和安全的给药方式或给药途径。
4.疫苗的工作原理是：当疫苗抗原接种到动物机体后，刺激动物机体免疫系统，动物机体的抗原提呈细胞将疫苗进行处理、加工和递呈给特异性淋巴细胞(t 和b淋巴细胞)，然后淋巴细胞对疫苗的识别、活化、增殖、分化最后产生免疫效应分子(抗体和细胞因子)及免疫效应细胞，并最终将抗原从动物机体中清除，这个过程称为免疫应答。由此可见，目前国际上普遍的新型冠状病毒疫苗研发中注射抗原的给药方式，很可能导致注射的抗原在全身组织中可能产生一些副作用，其发挥疫苗引发免疫的过程实际上是通过抗原提呈细胞产生的。因此，如果将抗原限制在抗原提呈细胞中产生，就有可能限制抗原在全身组织中可能产生的副作用，达到更安全的目标。
5.基于减毒菌株的口服疫苗因接种简单，价格低廉等优势，广泛的应用于多种感染性疾病的疫苗开发。减毒沙门氏菌作为一种应用广泛的细菌口服疫苗载体，同时也是一种天然的粘膜免疫佐剂、抗原表达和投递工具。通过基因工程改造的重组疫苗株，经口服后通过肠道中m细胞进入机体内部(jensen vb等人,1998, infect immun 66:3758-3766.)，进入体内环境的菌株可被抗原呈递细胞(apc) 所快速吞噬处理，此时若借助菌体的分泌系统便可有效地将抗原蛋白分泌至 apc细胞内部，进一步被有效分解成多肽段并通过组织相容性复合体mhc-i或 mhc-ii途径展示给辅助t细胞(t-help cell)，以激发机体产生针对抗原分子的细胞、体液以及粘膜免疫应答(mei y等人,2017,cancer immunol res 5:503-514.)。
6.但是开发一种用于预防新冠病毒的高效且应用性强的口服减毒沙门氏菌疫苗，仍面临以下技术难题：a)维持重组细菌的表型稳定性，利用减毒细菌作为外源抗原的表达工具，需要建立一种合适的表达策略，以优化抗原表达量与质粒兼容性，否则会出现菌株毒性过高，工程质粒丢失严重而丧失免疫效果等问题；b)抗原蛋白经菌体分泌至细胞中的有效性，因为多数细菌在进入抗原递呈细胞后，会被一种膜包裹的囊泡结构(scv)所包裹，这种结构在很大程度的限制了抗原分子的有效递呈(zhang xl等人,2008,cell mol immunol 5:91-7.)，若不能实现真正的有效呈递，将大大降低疫苗的预防效果；c)选用怎样的启动子，使得抗原分子只在抗原递呈细胞中表达，而不在血液和正常组织中表达，提供抗原分子的安全性。d)病毒抗原表位筛选与区域选择的最优性，由于新冠病毒s蛋白分子量大且结构复杂(hsieh cl等人,2020,science 369:1501-1505.)，需要针对其多个结构域不同表位进行筛选，以避免过于复杂的蛋白结构无法被有效分泌，并通过尽可能多的呈递有效抗原决定簇来诱导产生更佳的免疫应答。
7.因此，要获得一个高效的基于减毒沙门氏菌分泌表达系统的(sars-cov-2) 新冠病毒疫苗，必须构建一个安全、高效且稳定的沙门氏菌分泌表达载体，以实现抗原分子在沙门氏菌中的表达并可有效分泌至抗原呈递细胞内，以高效诱导机体免疫应答，这是本发明要解决的问题。
8.由于不同的蛋白质具有不同的一级序列导致不同蛋白质的疏水性质和电荷分布差异很大、而不同蛋白质的不同的一级序列又导致不同蛋白质具有不同的空间结构或高级结构从而导致蛋白质的空间构型以及蛋白质表面的物理和化学性质差异很大。因此，要实现不同抗原蛋白质在沙门氏菌中的高效、稳定、分泌的表达是异常困难的，无法预测或推断的，需要依照不同的蛋白质进行逐一研究、探索的，需要付出创造性的劳动。


技术实现要素：

9.本发明的主要目的是构建一种高效的减毒沙门氏菌表达分泌载体，并筛选出能够诱导最佳免疫应答的新冠病毒抗原表位组合，从而为建立表达稳定、保护性效率高的以减毒沙门氏菌为运输载体的新型冠状病毒口服疫苗奠定基础。
10.为了达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种减毒沙门氏菌分泌表达rbd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统，所述的减毒沙门氏菌分泌表达rbd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统包括iii型分泌系统启动子和信号肽序列；能够通过减毒沙门氏菌实现新型冠状病毒抗原在抗原递呈细胞中的分泌表达，在小鼠
模型中诱导机体产生高效价抗体。
11.进一步地，利用抗原递呈细胞胞内诱导型启动子调控细菌分泌信号分泌表达的抗原，利用沙门氏菌分泌表达系统使抗原能够获得分泌，添加质粒防丢失元件提高表达载体在沙门氏菌内的质粒稳定性，从而获得高效、稳定的、抗原递呈细胞胞内调控的减毒沙门氏菌分泌表达的抗原递呈系统。
12.进一步地，新型冠状病毒疫苗抗原是经过筛选的、能诱导最佳免疫应答的新冠病毒抗原表位组合，具体的，所述的能诱导最佳免疫应答的新冠病毒抗原表位组合是sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)rbd结构域，所述rbd结构域的基因序列为seq id no.6所示的核苷酸序列，位于s蛋白整体氨基酸序列的 319-541位氨基酸。
13.更进一步地，抗原递呈细胞胞内诱导型启动子为沙门氏菌sifb启动子；所述沙门氏菌sifb启动子的基因序列为seq id no.4所示的核苷酸序列。
14.更进一步地，抗原递呈细胞胞内诱导型启动子为大肠杆菌nirb启动子、或沙门氏菌ssea启动子、或沙门氏菌ssej启动子；所述大肠杆菌sifb启动子的基因序列为seq id no.1所示的核苷酸序列，所述沙门氏菌ssea启动子的基因序列为seq id no.2所示的核苷酸序列，所述沙门氏菌ssej启动子的基因序列为seq id no.3所示的核苷酸序列。
15.进一步地，细菌分泌信号分泌表达系统是沙门氏菌iii型分泌表达系统，所述的iii型分泌信号为沙门氏菌毒力岛2(spi-2)效应蛋白ssej信号肽，所述沙门氏菌毒力岛2(spi-2)效应蛋白ssej信号肽的基因序列为seq id no.5所示的核苷酸序列。
16.进一步地，所述的质粒防丢失元件为at元件序列，所述at元件序列的基因序列为seq id no.8所示的核苷酸序列。
17.进一步地，通过减毒沙门氏菌实现疫苗抗原的表达，所述的减毒沙门氏菌是vnp20009，htra基因缺陷型减毒沙门氏菌vnp20009(ah-1)。
18.本发明所述的减毒沙门氏菌分泌表达rbd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统的应用，通过口服含有减毒沙门氏菌分泌表达rbd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统的减毒沙门氏菌在小鼠模型中诱导机体产生高效价抗体。
19.本发明一种减毒沙门氏菌分泌表达rbd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统在作为制备新型冠状病毒疫苗、预防新型冠状病毒的药物中的应用。
20.有益效果：本发明的一种全新的、高效的、安全的、抗原递呈细胞胞内表达的、低廉的、方便的、可用于人和动物的新型冠状病毒疫苗分泌表达载体及其应用。本发明通过构建可控的、稳定的、分泌表达rbd结构域蛋白的表达质粒和对减毒沙门氏菌的工程化改造，可以通过口服途径、在给药后可借助其特有的分泌系统，向抗原呈递细胞高效递送抗原性蛋白。递送的抗原性蛋白可被抗原呈递细胞有效地处理并呈递，最终实现激活/调节免疫系统，产生抗体，发挥疫苗的作用。
21.与现有的以及正在研发进程中的新型冠状病毒疫苗相比，本发明的特色和创新之处在于：
22.(1)本发明了一种利用沙门氏菌iii型分泌系统信号指导新型冠状病毒疫苗抗原表达载体，实现了新型冠状病毒抗原的分泌表达，并在小鼠模型中诱导机体产生了高效价的抗体。
23.(2)本发明了一种新型口服菌制新型冠状病毒疫苗，该疫苗使用新型的减毒沙门
pssej-ssej p2引物的基因序列为seq id no.18所示的核苷酸序列。
54.以50ng沙门氏菌基因组dna作为模板。
55.rbd p1:5
’‑
agcggaggtggaggcagcccgaacatcaccaacctg-3’；所述rbd p1引物的基因序列为seq id no.19所示的核苷酸序列。
56.rbd p2：5
’‑
tctggaacatcgtatgggtacggcgcgtgcagcagttc-3’；所述rbd p2引物的基因序列为seq id no.20所示的核苷酸序列。
57.以商业质粒mc_0101082作为模板；
58.vec p1:5
’‑
tacccatacgatgttccagattacg-3’；所述vec p1引物的基因序列为 seq id no.21所示的核苷酸序列。
59.vec p2:5
’‑
gctgcctccacctccgctgc-3’；所述vec p2引物的基因序列为seqid no.22所示的核苷酸序列。
60.以本实验室带有at元件的质粒pqe30作为模板。信号肽与目的蛋白间的 linker序列使用热退火自连法获取。通过pcr获得各个片段后，将相应片段利用同源重组法进行组装，最终获得iii型分泌系统的各种的蛋白表达分泌载体，包括ah-jp-rbd，ah-ns-rbd，ah-ss-rbd，ah-jj-rbd，ah-bj-rbd。
61.实施例2
62.重组减毒沙门氏菌的电穿孔转化:
63.沙门氏菌电转感受态的制备：接种新鲜减毒沙门氏菌到200ml lb培养基中，37℃摇床培养至od值在0.4-0.6之间，离心5000rpm，5min收集菌体，用无菌双蒸水清洗一次后，5000rpm，离心5min，并用灭菌的10％甘油洗涤菌体3-5次，离心5000rpm，5min，用500μl 10％甘油重悬，分装50μl/管，用于电转。采用电穿孔方法将重组疫苗dna载体转化到减毒沙门氏菌内：在无菌条件下，将0.5-5μg构建好的重组载体加入在电转感受态中，混匀后，转移到2mm的电转杯中，用于电击，电转条件为1.8kv,25μf,500ω。电转后涂布在卡纳霉素平板上筛选,长出的菌落即为构建的重组菌，挑选单克隆菌株进行测序验证。
64.实施例3
65.抗原性蛋白有效分泌检测
66.将获得的重组减毒沙门氏菌于卡纳霉素抗性液体lb培养基中培养至od600 0.8-1.0，收集菌体并用pbs调节od600值至1.0左右。放置4度备用。使用100 ng/ml lps诱导巨噬细胞系raw264.7，以获得m1型巨噬细胞，诱导时长为24 小时(下述记作raw264.7(m1))。将获得的raw264.7(m1)与上述获得的 ah-ns-rbd，ah-ss-rbd，ah-jj-rbd，ah-bj-rbd共计4种重组减毒沙门氏菌以1：10共培养90分钟，吸弃上清并用pbs清洗2-3次，于添加有100ng/ml 庆大霉素的细胞培养液(10％血清，不加双抗)中培养6小时。收集细胞并通过热裂解法收集细胞总蛋白，即100μl pbs重悬细胞，加入25μl 5x loadingbuffer后，100度裂解10-15分钟。9,000rpm离心5分钟收集lb中4种重组菌后，使用相同方法收集菌体中的总蛋白。
67.对于ah-jp-rbd重组减毒沙门氏菌，将接种的菌体扩大培养于50ml卡纳抗性液体lb中培养至od600约1.0左右。使用tca(三氯乙酸)-丙酮沉淀法收集上清中总蛋白，简单来说，转移上清至50ml离心管中，使用超速离心机 15,000g，4度，离心10min。取上清转移至新的50ml离心管中，加入10％tca，涡旋以充分混合，冰上静置30min。再7,000g，4度离心20min，以300μl pbs 重悬沉淀，并转至1.5ml无菌ep管中。加入1.2ml预冷的丙酮(提前放
置-20)， 17,000g，4度，离心20min。去上清，再次加入300μl pbs，重复上述操作。去上清，加入40μl pbs重悬，即获得菌体分泌于上清中的总蛋白。将离心收集的菌体加入loading buffer后，于100度下煮沸10分钟，获得菌体总蛋白。收集到的总蛋白使用蛋白免疫印迹(wb)法检测有无目的蛋白的产生与分泌。使用兔单克隆ha标签抗体作为一抗，使用偶联hrp的山羊抗兔igg抗体作为二抗。
68.检测结果表明，ah-jp-rbd重组减毒沙门氏菌能够有效的表达并分泌产生 rbd蛋白(图3)。而对ah-ns-rbd，ah-ss-rbd，ah-jj-rbd，ah-bj-rbd 4种重组减毒沙门氏菌，在菌体存在于液体lb中时，4种菌都未出现rbd蛋白的表达与分泌，而当菌体处于巨噬细胞内部时，受到细胞内环境的诱导刺激， ah-jj-rbd与ah-bj-rbd重组减毒沙门氏菌均有效表达了带有信号肽的rbd 蛋白(较大条带)，并且该蛋白被有效分泌入细胞内部后，被剪切掉信号肽(较小条带)。但ah-ns-rbd与ah-ss-rbd两种工程菌中未能有效实现rbd蛋白的表达与分泌，故在后续的实验中舍弃这两种工程菌(图3)。
69.借助免疫荧光分析细胞内ah-jj-rbd，ah-bj-rbd重组菌对抗原性蛋白的表达与分泌情况，在按以上所述方法获得吞噬了ah-bj-nc，ah-jj-rbd或 ah-bj-rbd重组菌的raw264.7(m1)细胞爬片后，pbs清洗3次，使用4％多聚甲醛室温固定30分钟，并用pbs清洗3次。借助pbs配置的0.5％ tritonx-100室温打孔30分钟。pbs清洗3次，使用3％bsa室温封闭30分钟后，pbs清洗3次，使用兔单克隆ha标签抗体作为一抗4度过夜孵育爬片。 pbst清洗3次后，使用猴抗兔荧光二抗与沙门氏菌荧光抗体室温避光孵育1小时。pbst清洗3次后，添加核染料dapi并使用荧光显微镜观察拍摄。荧光拍摄结果表明，存在于巨噬细胞内部的ah-jj-rbd或ah-bj-rbd重组减毒沙门氏菌可有效表达并分泌rbd-ha蛋白，而携带空载质粒的重组减毒沙门氏菌未检测到ha相关荧光信号(图4)。
70.实施例4
71.免疫程序及方法
72.6-8周龄雌性c57bl/6小鼠按照每组4-5只进行分组,每只小鼠按照口服 1
×
109cfu细菌剂量接种空载细菌或ah-jp-rbd，ah-jj-rbd与ah-bj-rbd3 种重组减毒沙门氏菌，间隔一周一次，第三次后一周进行进行眼球取血，检测血清中特异性抗体浓度(图5)。
73.实施例5
74.rbd蛋白抗体检测
75.免疫血清的制备：按上述方法获得免疫小鼠的血液后，室温静置2-4小时， 3,000rpm 4度，离心15分钟，收集血清保存至-80度备用。
76.elisa测定总igg抗体滴度：1.抗原包被，利用50mm,ph 9.6的碳酸盐缓冲液按照10μg/ml稀释sars-cov-2的重组s蛋白抗原，每孔滴加100μl，4 度包被酶标板过夜，pbst洗三次(5分钟一次)；2.封闭，包被板每孔加入300 μl 3％的bsa在37度封闭3个小时，经pbst洗三次(5分钟一次)；3.加样，用100μl pbs将血清梯度稀释(50-400倍)加入孔中，37℃反应1-2个小时， pbst洗三次(5分钟一次)；4.二抗，加入hrp(辣根过氧化物酶)偶联的羊抗小鼠igg二抗(pbst 1:5000稀释)，37℃反应1个小时，pbst洗三次(5分钟一次)；5.显色，洗板后加入tmb底物液100μl室温显色5-10分钟后，待颜色变蓝时，每孔加入100μl 2m浓硫酸终止，测定450nm吸收光。
77.抗体效价检测结果表明，ah-jp-rbd，ah-jj-rbd，ah-bj-rbd 3种重组减毒沙门氏
菌均可有效诱导机体产生相应的rbd蛋白抗体，其中ah-bj-rbd重组菌株诱导效果更佳(图6)，表明该体系更强的应用价值。
78.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。