一种油菜芥酸含量基因BnaA.FAE1特异KASP标记方法及应用与流程

一种油菜芥酸含量基因bnaa.fae1特异kasp标记方法及应用
技术领域
1.本发明涉及油菜选育技术领域，具体涉及一种油菜芥酸含量基因bnaa.fae1特异kasp标记方法及应用。


背景技术：

2.菜籽油的品质主要决定于其脂肪酸的组成，主要的脂肪酸包括棕榈酸(c16:0)、硬脂酸(c18:0)、油酸(c18:1)、亚油酸(c18:2)、亚麻酸(c18:3)、花生酸(c20:0)、二十碳烯酸(c20:1)和芥酸(c22:1)等。其中芥酸影响菜籽油消化吸收率以及人体健康，是油菜改良的主要对象。在甘蓝型油菜中，已报道了多个芥酸含量相关基因，其中bnaa.fae1基因位于a08染色体，是油酸(c18:1)延伸至芥酸(c22:1)的关键基因，该基因与白菜a08染色体的fae1高度同源(rahman等，2008)。
3.由于驯化历史短，甘蓝型油菜遗传资源匮乏，使得甘蓝型油菜的遗传改良受限。通过甘白种间杂交，可在甘蓝型油菜中转入白菜型油菜有利性状，如抗病、早熟等，可拓宽甘蓝型油菜遗传基础。然而，由于连锁累赘的存在，在导入白菜优异性状的同时，也会携带连锁的不利基因，如高芥酸、高硫苷等，因此需要对导入白菜优异性状的甘蓝型油菜进行选育。
4.传统的油菜育种依赖于育种家对具体油菜材料在田间的表型的观察与评价，受到自然环境和个人经验的影响，其育种周期长，效率低。分子标记技术的发展为提高育种效率提供了新的手段，使得育种家可以通过检测与主效基因紧密连锁的特定核苷酸序列，即分子标记来实现对目标基因的选择，大幅度提高育种的准确度及缩短育种年限。


技术实现要素：

5.本发明公开一种kasp分子标记引物，具有快速、特异性强、灵敏度高的显著优点，可应用于筛选、鉴定或培育低芥酸油菜品种。本发明基于snp技术开发出一种bnaa.fae1紧密连锁kasp分子标记设计方法，实现快速、准确地检测油菜芥酸基因，同时开发的kasp标记可实现目标位点的高效、低成本和高通量鉴定，简化低芥酸甘蓝型油菜品种育种过程。
6.具体技术方案如下：
7.一种kasp分子标记引物，该kasp分子标记引物包括正向引物a、正向引物b以及通用反向引物，具体如下：
8.正向引物a：
9.5'-gaaggtgaccaagttcatgctgggacttttgggtaaatagctttggact-3'；
10.正向引物b：
11.5'-gaaggtcggagtcaacggattggacttttgggtaaatagctttggaca-3'；
12.通用反向引物：
13.5'-aacagagtggagacgtgccctacaag-3'。
14.本发明还公开一种油菜芥酸含量基因bnaa.fae1特异kasp标记方法，其特征在于，
包括以下步骤：提取待测作物基因组dna；将待测样品通过snp芯片进行基因分型；筛选bnaa.fae1基因特异snp标记；将特异snp标记转化为kasp分子标记引物。
15.本发明还公开一种用于检测bnaa.fae1基因的检测试剂盒，含有上述kasp分子标记引物。
16.本发明还公开一种对油菜bnaa.fae1基因的检测方法，使用上述kasp分子标记引物或上述检测试剂盒进行检测。
17.优选的，包括以下步骤：结合所述kasp分子标记引物将bnaa.fae1基因进行kasp反应；进行snp信号检测。
18.优选的，进行snp信号检测的具体步骤包括：若样品pcr产物只检测到引物primerx对应荧光信号，则检测位点为x型等位基因型；若只检测到引物primery对应荧光信号，则检测位点为y型等位基因型；若同时检测到两种荧光信号则检测位点，判断待测样本为杂合基因型。
19.本发明还公开一种低芥酸油菜品种选育的方法，使用上述kasp分子标记引物或上述检测试剂盒。
20.除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
21.构成本技术的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
22.图1是实施例1中bn900052分子标记的开发示意图。
具体实施方式
23.以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
24.实施例1：
25.一种油菜芥酸含量基因bnaa.fae1特异kasp分子标记引物，该引物组包括正向引物a、正向引物b以及通用反向引物，具体如下：
26.正向引物a(详见seq id no:1)：
27.5'-gaaggtgaccaagttcatgctgggacttttgggtaaatagctttggact-3'；
28.正向引物b(详见seq id no:2)：
29.5'-gaaggtcggagtcaacggattggacttttgggtaaatagctttggaca-3'；
30.通用反向引物(详见seq id no:3)：
31.5'-aacagagtggagacgtgccctacaag-3'。
32.上述kasp分子标记引物的获取方式如下：
33.一、与bnaa.fae1共分离的差异snp获得
34.具体是：
35.1、分离群体构建：以包含有高芥酸基因bnaa.fae1的白菜型油菜品系湘油4号(zhan et al.2020)为父本，以待改良的油菜品系20b为母本，进行杂交获得f1，进一步将f1
与20b回交获得bc1f1群体。
36.2、dna提取，详情如下：
①
取约2段1.5cm长叶片或种子至1.3ml的96孔板中，将96孔板置于-80℃冰箱4小时或以上；
②
将1.3ml96孔板至于烘箱中，65℃烘干10小时或以上，烘干结束后，取出1.3ml96孔板，向1.3ml 96孔板每孔中加入2颗4mm钢珠；
③
迅速封上硅胶膜，置于genogrinder 2010中，转速调至1500rpm并研磨1分钟，效果不好时可适当延长研磨时间，研磨后置于深孔板离心机中瞬离，将磨碎组织离心到孔底；
④
取出96孔板，小心撕开硅胶板，每孔加含tris-hcl的提取液500ul，随后盖上新的硅胶板并将1.3ml96孔板置于漩涡振荡器上适当振荡；
⑤
将96孔板置于调温至75℃的烘箱中温浴约40分钟；
⑥
温浴结束后取出96孔板，将其于深孔板冷冻离心机中，转速调至4000rpm温度调至室温，离心10分钟；
⑦
离心结束后，取出96孔板，抽取上清液190ul至另一块预加190ul异丙醇的0.8ml 96孔板，并封上硅胶膜，于漩涡振荡器上振荡数次，后将其置于-20℃冰箱沉淀1小时或以上；
⑧
取出96孔板置于深孔板冷冻离心机中，转速调至4000rpm温度调至4℃并离心10分钟；
⑨
去掉上清液并将96孔板置于65℃烘箱中30分钟将其烘干；
⑩
取出96孔板，每孔加500ul超纯水，盖上硅胶盖，于漩涡振荡器上振荡数次，后置于室温下过夜，隔夜即可使用。
37.3、bnaa.fae1基因的差异snp标记的获取，具体是：
38.以20b、sc4、westar和zs11等低芥酸常规甘蓝型油菜为对照，与高芥酸白菜湘油4号通过50k snp芯片分析。snp芯片分析过程：样本37℃扩增，dna片段化与纯化，95℃变性，48℃杂交，单碱基延伸，扫描并获取基因型。hiscan扫描获取图片后，使用genomestudio软件(illumina inc.,san diego,ca,usa)获取基因型数据并进一步分析。
39.得到基因型数据后，利用excel(microsoft corp.,redmond,wa,usa)的if函数进行多态性snp筛选。筛选的标准为：(1)在4个低芥酸常规甘蓝型油菜基因型一致；(2)低芥酸常规甘蓝型油菜和湘油4号之间存在多态性；(3)位于bnaa.fae1基因上下游50kb，通过比对发现bnaa.fae1位于a08染色体10.187mbp至10.189mbp。根据以上标准共获得4个差异snp标记详见表1：
40.表1 4个差异snp标记统计表
[0041][0042]
二、kasp标记开发
[0043]
选取snp1
[0044]
snp1：seq-new-rs42497,chra08-10219211,[t/a]
[0045]
进行kasp标记开发，然后在特异性引物5’端分别加上fam和hex荧光接头序列，选择page或者ipage的纯化方式，最终获得引物组。
[0046]
本实施例在kasp标记开发过程中，利用8份湘油4号、8份20b、20b、sc4、westar和zs11，以及4份湘油4号和20b的混合样品(mix)，验证标记assay分型情况，具体是：按照表2
说明进行kasp反应检测使用：
[0047]
表2 kasp反应检测条件
[0048] 终浓度用量100um primer c0.42μm0.0033μl100um primer x0.17μm0.0013μl100um primer y0.17μm0.0013μl2
×
kasp master mix1
×
0.3945μl超纯水 0.3995μldna(干燥) 20ng-50ng总体积 0.8μl
[0049]
touchdown pcr反应条件为：
[0050]
①
94℃，15m；
②
95℃，20s；
③
65℃-56℃，60s；(第
②
和第
③
两个步骤进行10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃)
④
94℃，20s；
⑤
57℃，60s。(第
④
和第
⑤
两个步骤进行30个循环)。
[0051]
应用本实施例的kasp分子标记引物进行验证，具体操作如下：
[0052]
利用湘油4号和20b为亲本构建的f2群体对bn900052进行验证(详见图1)，检测的188个样品。同时对其中24个单株芥酸含量进行测定，利用近红外分析仪(matrix-1，bruker，germany，opus/quant5.5software)测定其种子的芥酸和硫苷含量。2次重复，取均值进行数据分析。结果显示基因型为a：a(纯合低芥酸基因型)芥酸含量为0至1.7％，达到低芥酸标准，杂合基因性芥酸含量6.5％-11.6，a∶a(纯合高芥酸基因型)为15.8％-21.5％，表明bn900052与bnaa.fae1共分离。
[0053]
表3 bn900052及对照的检测结果
[0054]
[0055][0056]
如果样品pcr产物只检测到引物primerx对应荧光信号，则检测位点为x型等位基因型；若只检测到引物primery对应荧光信号，则检测位点为y型等位基因型；若同时检测到两种荧光信号则检测位点，判断待测样本为杂合基因型。
[0057]
表3中：bn900052的t:t代表高芥酸基因型，a:a代表低芥酸，t:a为杂合基因型。说明bn900052可用于低芥酸油菜品种选育的分子标记辅助选择。
[0058]
实施例2：
[0059]
采用如实施例1中的kasp分子标记引物制作成用于油菜bnaa.fae1基因的检测试剂盒。
[0060]
该试剂盒可用于低芥酸油菜分子标记辅助选择育种。
[0061]
实施例3：
[0062]
采用如实施例1中所述kasp分子标记引物或如实施例2所述检测试剂盒在甘白杂
交后代中低芥酸油菜品种改良中的应用。
[0063]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。