来自荞麦的C-糖苷化酶基因及其应用的制作方法

来自荞麦的c-糖苷化酶基因及其应用
技术领域
1.本发明涉及来自荞麦的c-糖苷化酶(cgt)基因或其同源基因，及包含使用这些而使花翠素型花色素苷(anthocyanin)与黄酮单-c-糖苷在植物的细胞内共存的工序的用于制作具有蓝色系花色的转化植物的方法。


背景技术：

2.蔷薇、菊花、康乃馨等为世界性产业上重要的花卉。尤其蔷薇为最受欢迎的花卉植物，有从公元前开始就已经进行栽培的记录，跨越数百年经历了人为的品种改良。然而，由于在可杂交的近缘种中没有蓝色系的花色的野生种等问题，在以往的杂交育种、突变育种中制作具有蓝色系花色的蔷薇品种存在困难。全新的蓝色系花色的创造，伴随花卉的利用场合的扩大而唤起的新需要，且关系到生产或消费的扩大。于是，尝试了通过基因工程的方法创造具有蓝色系花色的蔷薇。
3.例如，已知在由紫色至蓝色的花中，富含以花翠素、矮牵牛素及二甲花翠素为骨架的花翠素型花色素苷，然而由于蔷薇等花卉无法生产这样的花翠素型花色素苷，因此正在进行通过使他们的合成所必需的类黄酮3’,5
’‑
羟化酶基因表达，而人为地生产花翠素的研究(非专利文献1)。然而，即使为了在转基因植物中使生产目标物质的酶基因进行表达而人为地改变植物的代谢，但多数情况下目标物质的累积完全或者几乎不发生。
4.进一步，花色除了根据花色素苷自身的结构，还根据共存的类黄酮(称作辅色素)或金属离子、液泡的ph等而变化。黄酮或黄酮醇为代表性的辅色素，通过与花色素苷堆积成三明治状，具有使花色素苷变蓝，看起来浓的效果(非专利文献2)。已知这是辅色素效果。尤其已知黄酮表现出强辅色素效果，例如报告称在转基因康乃馨的分析中黄酮表现出显著的辅色素效果(非专利文献3)。此外，报告称在荷兰鸢尾中，相对于总花翠素量的总黄酮量的比越高越表现出辅色素效果，颜色越蓝(非专利文献4)。
5.然而，并不是所有的植物都能够生产黄酮，蔷薇或矮牵牛等并不累积黄酮。从而，正在进行使编码具有由黄烷酮合成黄酮的活性的蛋白质的基因在这样的植物中表达进而改变花色的尝试(专利文献1)。
6.此外，已知在植物中，黄酮除游离状态以外还以糖苷的形式分布，主要生成黄酮o-糖苷和黄酮c-糖苷，特别是黄酮c-糖苷表现出强辅色素效果。例如，报告称作为黄酮c-糖苷的一种的异牡荆素，在花菖蒲(iris ensata thunb.)中对于花色素苷表现出辅色素效果，通过对花色素苷进行稳定化，可使花色蓝色化(非专利文献5)。作为黄酮c-糖苷的生物合成路径之一，已知通过黄烷酮2-羟化酶(f2h)及c-糖苷化酶(cgt)、脱水酶(fdh)催化的反应由黄烷酮合成(非专利文献6)。
7.至今为止报告了将来自风铃草的f3
’5’
h基因和来自蓝猪耳的mt基因、来自甘草的f2h基因、来自稻子的cgt基因、来自百脉根的fdh基因导入，通过使花翠素型花色素苷与黄酮c-糖苷在植物细胞内共存，从而制作具有蓝色系花色的蔷薇(专利文献2)。然而，这样制作的蔷薇系统的花色有强烈的发红的倾向，从而依然期望开发用于可制作均匀且稳定地具
有更蓝的花色的蔷薇的蓝色表达控制技术。
8.专利文献
9.专利文献1：日本特开2000-279182号公报
10.专利文献2：国际公开第2019/069946号
11.专利文献3：国际公开第2008/156206号
12.非专利文献
13.非专利文献1：phytochemistry reviews 5,283-291
14.非专利文献2：prog.chem.org.natl.prod.52
15.非专利文献3：phytochemistry,63,15-23(2003)
16.非专利文献4：plant physiol.bioch.72,116-124(2013)
17.非专利文献5：euphytica 115,1-5(2000)
18.非专利文献6：febs lett.589,182-187(2015)


技术实现要素：

19.本发明所要解决的课题在于，通过查明花色中发红的原因，而制作均匀且稳定地具有蓝色系花色(rhs色谱标准第5版：violet-blue组/blue组且/或色相角度：339.7
°
～270.0
°
)的转化植物。
20.本技术发明者等，为了解决上述课题进行了深入研究，重复进行试验，结果发现，发红的原因在于黄酮二-c-糖苷，就与花翠素型花色素苷的辅色素效果而言，黄酮单-c-糖苷显著高于黄酮二-c-糖苷。进一步，本技术发明者等，在各种cgt基因之中，通过导入来自荞麦的cgt基因，成功地在植物的花瓣中，仅使黄酮单-c-糖苷显著累积。基于这样的见识，从而完成了本发明。
21.本发明如下所示。
22.[1]一种来自荞麦的cgt基因或其同源基因，其为来自荞麦的c-糖苷化酶，即cgt基因或其同源基因，其特征在于，所述来自荞麦的cgt基因或其同源基因选自：
[0023]
(1-a)由序列号11的碱基序列构成的多聚核苷酸；
[0024]
(1-b)在严谨条件下与由与序列号11的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交，且与(1-a)中记载的多聚核苷酸具有同样活性的多聚核苷酸；
[0025]
(1-c)编码由序列号12的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸。
[0026]
[2]根据1所述的来自荞麦的cgt基因或其同源基因，其特征在于，附加有来自拟南芥adh基因的非翻译区域(5
’‑
utr)，即序列号15，或来自拟南芥hspro基因的非翻译区域(5
’‑
utr)，即序列号13。
[0027]
[3]一种载体，其为含有来自荞麦的cgt基因或其同源基因的载体，其特征在于，所述来自荞麦的cgt基因或其同源基因选自：
[0028]
(1-a)由序列号11的碱基序列构成的多聚核苷酸；
[0029]
(1-b)在严谨条件下与由与序列号11的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交，且与(1-a)中记载的多聚核苷酸具有同样活性的多聚核苷酸；
[0030]
(1-c)编码由序列号12的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
[0031]
(1-d)编码由在序列号12的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/
或附加而得的氨基酸序列构成，且与(1-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
[0032]
(1-e)编码具有相对于序列号12的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列，且与(1-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸。
[0033]
[4]根据3所述的载体，其特征在于，在所述来自荞麦的cgt基因或其同源基因上附加有来自拟南芥adh基因的非翻译区域(5
’‑
utr)，即序列号15，或来自拟南芥hspro基因的非翻译区域(5
’‑
utr)，即序列号13。
[0034]
[5]根据3或4所述的载体，其特征在于，进一步含有黄烷酮2-羟化酶，即f2h基因或其同源基因，以及脱水酶，即fdh基因或其同源基因。
[0035]
[6]根据5所述的载体，其特征在于，所述f2h基因或其同源基因选自：
[0036]
(2-a)由序列号5的碱基序列构成的多聚核苷酸；
[0037]
(2-b)在严谨条件下与由与序列号5的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交，且与(2-a)中记载的多聚核苷酸具有同样活性的多聚核苷酸；
[0038]
(2-c)编码由序列号6的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
[0039]
(2-d)编码由在序列号6的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成，且与(2-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
[0040]
(2-e)编码具有相对于序列号6的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列，且与(2-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸，
[0041]
所述fdh基因或其同源基因选自：
[0042]
(3-a)由序列号9的碱基序列构成的多聚核苷酸；
[0043]
(3-b)在严谨条件下与由与序列号9的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交，且与(3-a)中记载的多聚核苷酸具有同样活性的多聚核苷酸；
[0044]
(3-c)编码由序列号10的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
[0045]
(3-d)编码由在序列号10的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成，且与(3-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
[0046]
(3-e)编码具有相对于序列号10的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列，且与(3-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸。
[0047]
[7]根据3～6中任一项所述的载体，其特征在于，进一步含有类黄酮f3
’5’
羟化酶，即f3
’5’
h基因或其同源基因，以及甲基转移酶，即mt基因或其同源基因。
[0048]
[8]根据7所述的载体，其特征在于，所述f3
’5’
h基因或其同源基因选自：
[0049]
(4-a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；
[0050]
(4-b)在严谨条件下与由与序列号1的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交，且与(4-a)中记载的多聚核苷酸具有同样活性的多聚核苷酸；
[0051]
(4-c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
[0052]
(4-d)编码由在序列号2的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成，且与(4-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
[0053]
(4-e)编码具有相对于序列号2的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列，且与(4-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸，且，
[0054]
所述mt基因或其同源基因选自：
[0055]
(5-a)由序列号3的碱基序列构成的多聚核苷酸；
[0056]
(5-b)在严谨条件下与由与序列号3的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交，且与(5-a)中记载的多聚核苷酸具有同样活性的多聚核苷酸；
[0057]
(5-c)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
[0058]
(5-d)编码由在序列号4的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成，且与(5-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
[0059]
(5-e)编码具有相对于序列号4的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列，且与(5-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸。
[0060]
[9]一种转化植物或其自繁或者杂交后代，其特征在于，含有1或2所述的来自荞麦的cgt基因或其同源基因，或者3～8中任一项所述的载体。
[0061]
[10]根据9所述的转化植物或其自繁或者杂交后代，其特征在于，所述植物选自蔷薇、菊花、康乃馨或百合。
[0062]
[11]根据10所述的转化植物或其自繁或者杂交后代，其特征在于，所述植物为蔷薇。
[0063]
[12]一种营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞，其特征在于，为9～11中任一项所述的转化植物或其自繁或者杂交后代的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞。
[0064]
[13]一种切花，或由该切花制成的加工品，其特征在于，为9～11中任一项所述的转化植物或其自繁或者杂交后代的切花，或由该切花制成的加工品。
[0065]
[14]一种方法，其为用于制作具有蓝色系花色的转化植物的方法，其特征在于，包含通过将来自荞麦的c-糖苷化酶，即cgt基因或其同源基因导入宿主植物，使花翠素型花色素苷与黄酮单-c-糖苷在植物的细胞内共存的工序。
[0066]
[15]根据14所述的方法，其特征在于，所述黄酮单-c-糖苷为芹菜素6-c-糖苷、木犀草素6-c-糖苷、三粒小麦黄酮6-c-糖苷、芹菜素8-c-糖苷、木犀草素8-c-糖苷、三粒小麦黄酮8-c-糖苷或它们的衍生物。
[0067]
[16]根据14或15所述的方法，其特征在于，所述花翠素型花色素苷选自二甲花翠素、花翠素、矮牵牛素及它们的组合。
[0068]
[17]根据14～16中任一项所述的方法，其特征在于，包含将1或2所述的来自荞麦的cgt基因或其同源基因，或者3～8中任一项所述的载体导入宿主植物的细胞内的工序。
[0069]
[18]根据14～17中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物选自蔷薇、菊花、康乃馨或百合。
[0070]
[19]根据18所述的方法，其特征在于，所述植物为蔷薇。
[0071]
根据本发明，可制作均匀且稳定地具有蓝色系花色(rhs色谱标准第5版：violet-blue组/blue组且/或色相角度：339.7
°
～270.0
°
)的植物品种。
附图说明
[0072]
图1表示植物中的黄酮单-c-糖苷的生物合成路径。
[0073]
图2表示pspb6486的结构。
[0074]
图3表示pspb7473的结构。
[0075]
图4表示pspb7473的详细结构。
[0076]
图5表示pspb7472的详细结构。
[0077]
图6表示pspb7808的详细结构。
[0078]
图7表示pspb7809的详细结构。
具体实施方式
[0079]
已知花色素苷是植物中广泛存在的色素群，呈现红色、蓝色、紫色的花色。根据作为糖苷配基的花青素(anthocyanidins)部位的b环的羟基数，分类为天竺葵素、矢车菊素及花翠素的3个系统。发色团为糖苷配基部分，天竺葵素型花色素苷呈现橙色、矢车菊素型花色素苷呈现红色、花翠素型花色素苷呈现紫～蓝色。本技术说明书中，例如“花翠素型花色素苷”可列举以花翠素、二甲花翠素、矮牵牛素为骨架的它们的衍生物，优选为二甲花翠素。
[0080]
通过使花翠素型花色素苷与黄酮、黄酮醇、有机酸酯类、单宁类等的物质共存，与它们进行分子间相互作用从而有时表达带蓝色的颜色。该现象被称作辅色素作用，引起该现象的物质被称作辅色素(辅助色素)。在辅色素作用中不仅有引起蓝色表达的深色效果，还有浓色效果、提高颜色稳定性的效果。本发明者们确认通过花翠素型花色素苷和黄酮c-糖苷的辅色素作用，蔷薇的花瓣表达蓝色(专利文献2)。
[0081]
黄酮是有机化合物的一种，为黄烷衍生物的环状酮，在植物内主要作为糖苷存在。黄酮狭义上是指化学式c
15h10
o2、分子量222.24的化合物，2,3-二脱氢黄烷-4-酮，广义的黄酮(黄酮类)是类黄酮的分类之一，在类黄酮中以黄酮结构为基本骨架，进一步在3位上不具有羟基的类黄酮被分类为“黄酮”。本技术说明书中，“黄酮c-糖苷”是指广义的黄酮，即，属于黄酮类的衍生物的糖苷中，醛糖的端基碳上直接键合糖苷配基的糖苷。作为黄酮c-糖苷，可列举木犀草素c-糖苷、三粒小麦黄酮c-糖苷、芹菜素c-糖苷、金合欢素c-糖苷，但并不限定于此。黄酮c-糖苷另外还包含芹菜素、木犀草素、三粒小麦黄酮、金合欢素衍生物的糖苷。在植物中，作为黄酮c-糖苷的生物合成路径之一，已知示于图1的路径。该路径中，通过f2h、cgt及fdh的作用，来生产黄酮c-糖苷。
[0082]
在这样的合成路径中，除黄酮单-c-糖苷外，维采宁(vicenin)-2(芹菜素6，8-二-c-糖苷)等黄酮二-c-糖苷也被合成，而发明者等，此次惊人地发现发红的原因在于黄酮二-c-糖苷，就与花翠素型花色素苷的辅色素效果而言，黄酮单-c-糖苷高于黄酮二-c-糖苷。为了制作均匀且稳定地具有蓝色系花色的转化植物，需要极力减少黄酮二-c-糖苷的累积，而仅使黄酮单-c-糖苷在花瓣中显著累积。黄酮单-c-糖苷，典型而言为黄酮6-c-糖苷或黄酮8-c-糖苷，优选为黄酮6-c-糖苷。作为这样的黄酮单-c-糖苷，例如可列举芹菜素6-c-糖苷(异牡荆素)、木犀草素6-c-糖苷(异荭草素)、三粒小麦黄酮6-c-糖苷、芹菜素8-c-糖苷(牡荆素)、木犀草素8-c-糖苷(荭草素)、三粒小麦黄酮8-c-糖苷或它们的衍生物。
[0083]
在植物的细胞内，黄酮c-糖苷的累积可通过以含有上述合成路径中所必需的基因(即，f2h基因、cgt基因及fdh基因)或它们的同源基因的载体对宿主植物进行转化来达成。
且，通过作为cgt基因，使用来自荞麦的cgt基因或其同源基因，尤其是作为翻译增强序列附加有来自拟南芥adh基因的非翻译区域(5
’‑
utr)(序列号15)或来自拟南芥hspro基因的非翻译区域(5
’‑
utr)(序列号13)的来自荞麦的cgt基因或其同源基因，与黄酮二-c-糖苷相比，可使黄酮单-c-糖苷在花瓣中显著累积。
[0084]
所述来自荞麦的cgt基因或其同源基因选自以下多聚核苷酸：
[0085]
(1-a)由序列号11的碱基序列构成的多聚核苷酸；
[0086]
(1-b)在严谨条件下与由与序列号11的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交，且与(1-a)中记载的多聚核苷酸具有同样活性的多聚核苷酸；
[0087]
(1-c)编码由序列号12的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
[0088]
(1-d)编码由在序列号12的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成，且与(1-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
[0089]
(1-e)编码具有相对于序列号12的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列，且与(1-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸。
[0090]
所述f2h基因或其同源基因，只要具有所期望的功能即可，关于其起源并无特别限制，优选为来自甘草的f2h基因或其同源基因，选自以下多聚核苷酸：
[0091]
(2-a)由序列号5的碱基序列构成的多聚核苷酸；
[0092]
(2-b)在严谨条件下与由与序列号5的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交，且与(2-a)中记载的多聚核苷酸具有同样活性的多聚核苷酸；
[0093]
(2-c)编码由序列号6的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
[0094]
(2-d)编码由在序列号6的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成，且与(2-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
[0095]
(2-e)编码具有相对于序列号6的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列，且与(2-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸。
[0096]
所述fdh基因或其同源基因，只要具有所期望的功能即可，关于其起源并无特别限制，优选为来自百脉根的fdh基因或其同源基因，选自以下多聚核苷酸：
[0097]
(3-a)由序列号9的碱基序列构成的多聚核苷酸；
[0098]
(3-b)在严谨条件下与由与序列号9的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交，且与(3-a)中记载的多聚核苷酸具有同样活性的多聚核苷酸；
[0099]
(3-c)编码由序列号10的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
[0100]
(3-d)编码由在序列号10的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成，且与(3-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
[0101]
(3-e)编码具有相对于序列号10的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列，且与(3-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸。
[0102]
植物的细胞内的花翠素型花色素苷的累积，可通过将类黄酮f3
’5’
羟化酶(f3
’5’
h)基因或其同源基因及甲基转移酶(mt)基因或其同源基因编入宿主植物来达成(专利文献3)。从而，除上述黄酮单-c-糖苷的合成路径中的必需基因或它们的同源基因外，通过以进
一步含有f3
’5’
h基因或其同源基因及mt基因或其同源基因的载体对宿主植物进行转化，可使花翠素型花色素苷与黄酮单-c-糖苷在宿主植物的细胞内共存。
[0103]
f3
’5’
h基因或其同源基因，只要具有所期望的功能即可，关于其起源并无特别限制，优选为来自风铃草的f3
’5’
h基因或其同源基因，选自以下多聚核苷酸：
[0104]
(4-a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；
[0105]
(4-b)在严谨条件下与由与序列号1的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交，且与(4-a)中记载的多聚核苷酸具有同样活性的多聚核苷酸；
[0106]
(4-c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
[0107]
(4-d)编码由在序列号2的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成，且与(4-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
[0108]
(4-e)编码具有相对于序列号2的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列，且与(4-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸。
[0109]
mt基因或其同源基因，只要具有所期望的功能即可，关于其起源并无特别限制，优选为来自蓝猪耳的mt基因或其同源基因，选自以下多聚核苷酸：
[0110]
(5-a)由序列号3的碱基序列构成的多聚核苷酸；
[0111]
(5-b)在严谨条件下与由与序列号3的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸进行杂交，且与(5-a)中记载的多聚核苷酸具有同样活性的多聚核苷酸；
[0112]
(5-c)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
[0113]
(5-d)编码由在序列号4的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成，且与(5-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸；
[0114]
(5-e)编码具有相对于序列号4的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列，且与(5-c)中记载的多聚核苷酸所编码的蛋白质具有同样活性的蛋白质的多聚核苷酸。
[0115]
所述mt基因或其同源基因中，作为翻译增强序列可附加来自拟南芥adh基因的非翻译区域(5
’‑
utr)(序列号15)或来自拟南芥hspro基因的非翻译区域(5
’‑
utr)(序列号13)。
[0116]
本说明书中，用语“多聚核苷酸”是指dna或rna。
[0117]
本说明书中，所谓用语“严谨条件”为使多聚核苷酸或寡核苷酸能与基因组dna进行选择性且可检出的特异性结合的条件。严谨条件通过盐浓度、有机溶剂(例如，甲酰胺)、温度及其他公知的条件的适当组合进行定义。即，通过降低盐浓度，或增加有机溶剂浓度，或者提高杂交温度增加严谨度(stringency)。进一步杂交后的洗净条件也影响严谨度。该洗净条件也可根据盐浓度和温度进行定义，通过盐浓度的减少和温度的上升增加洗净的严谨度。从而，所谓用语“严谨条件”，是指仅在各碱基序列间的“一致性”程度，例如，全体平均为约80％以上，优选为约90％以上，更优选为约95％以上，进一步优选为97％以上，最优选为98％以上的具有高度一致性的碱基序列之间，进行特异性杂交的条件。作为“严谨条件”，例如可列举在温度60℃～68℃下，钠浓度150～900mm，优选600～900mm，ph6～8的条件，作为具体例可列举，在5
×
ssc(750mm nacl、75mm柠檬酸三钠)、1％sds、5
×
denhard溶液50％甲醛及42℃的条件下进行杂交，在0.1
×
ssc(15mm nacl、1.5mm柠檬酸三钠)、0.1％sds及55
℃的条件下进行洗净。
[0118]
杂交可根据例如，分子生物学现代实验室指南(current protocols in molecular biology(edited by frederick m.ausubel et al.,1987))中记载的方法等业界公知的方法或以其为基准的方法进行实施。此外，使用市售的库时，可根据附加的使用说明书中记载的方法进行实施。作为由这样的杂交而被选择的基因，可为来自天然的基因，例如来自植物的基因，也可为来自植物以外的基因。此外，由杂交而被选择的基因可为cdna，也可为基因组dna，还可为化学合成的dna。
[0119]
本说明书中，所谓“1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列”，是指例如1～20个，优选1～5个，更优选1～3个任意数量的氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列。基因工程的方法之一的部位特定诱导突变法为在特定的位置导入特定的突变的方法，因而有用，可依据molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,1989等中记载的方法来实施。通过使用适当的表达系使该突变dna表达，可得到由1个或多个氨基酸缺失、取代、插入及/或附加而得的氨基酸序列构成的蛋白质。
[0120]
此外，多聚核苷酸可通过本领域技术人员所公知的方法，例如通过亚磷酰胺法等进行化学合成的方法，以植物的核酸样本为模板，使用基于目标基因的核苷序列而设计的引物的核酸扩增法等来获得。
[0121]
本说明书中，所谓用语“一致性”，是指多肽序列(或氨基酸序列)或多聚核苷酸序列(或碱基序列)中的2条链之间，构成该链的各氨基酸残基彼此或者各碱基彼此的适合关系中可确定为一致的物质的量(数目)，为表示两个多肽序列或两个多聚核苷酸序列间的序列相关性的程度的用语，“一致性”可简单地计算。已知许多测定两个多聚核苷酸序列或多肽序列间的一致性的方法，用语“一致性”对于本领域技术人员是周知的(例如，参考lesk,a.m.(ed.),computational molecular biology,oxford university press,new york,(1988)；smith,d.w.(ed.),biocomputing:informatics and genome projects,academic press,new york,(1993)；grifin,a.m.&grifin,h.g.(ed.),computer analysis of sequence data:part i,human press,new jersey,(1994)；von heinje,g.,sequence analysis in molecular biology,academic press,new york,(1987)；gribskov,m.&devereux,j.(ed.),sequence analysis primer,m-stockton press,new york,(1991)等)。
[0122]
此外，本说明书中记载的“一致性”的数值，除特别明示时以外，可为使用本领域技术人员公知的一致性检索程序进行计算的数值，优选为使用macvector应用(版本9.5oxford molecular ltd.,oxford,england)的clustalw程序计算的数值。在本发明中，各多聚核苷酸序列间或各氨基酸序列间的“一致性”的程度例如为约90％以上，优选为约95％以上，进一步优选为约97％以上，最优选为约98％以上。
[0123]
本发明的多聚核苷酸(核酸、基因)为“编码”着眼的蛋白质的物质。在此，所谓“编码”是指使着眼的蛋白质以具备其活性的状态进行表达。此外，所谓“编码”含有将着眼的蛋白质作为连续的结构序列(外显子)进行编码或通过间插序列(内含子)进行编码两种意义。
[0124]
具有天然的碱基序列的基因例如可通过由dna测序仪进行解析来得到。此外，编码具有经修饰的氨基酸序列的酶的dna能够以具有天然的碱基序列的dna作为基础，使用常用
的部位特定诱导突变法、pcr法来合成。例如，通过天然的cdna或基因组dna的限制酶处理来得到欲修饰的dna片段，并以其为模板使用导入了所期望的突变的引物来实施部位特定诱导突变法、pcr法，从而得到所期望的修饰后的dna片段。其后，只要将导入了该突变的dna片段与编码作为目标的酶的其他部分的dna片段进行连接即可。
[0125]
或者为了得到编码由缩短的氨基酸序列组成的酶的dna，例如，将编码比作为目标的氨基酸序列长的氨基酸序列，例如，通过所期望的限制酶对编码全长氨基酸序列的dna进行切断，其结果所得到的dna片段不能编码作为目标的氨基酸序列整体时，只要合成由不足部分的序列组成的dna片段并进行连接即可。
[0126]
此外，通过使用大肠杆菌及酵母中的基因表达系使得到的多聚核苷酸表达并测定酶活性，可确认得到的多聚核苷酸对具有期望的活性的蛋白质进行编码。
[0127]
本发明还涉及含有上述多聚核苷酸的(转基因)载体，特别是表达载体，进一步涉及通过该载体而转化的植物。
[0128]
此外，本发明的载体，依赖于导入他们的宿主植物的种类而含有表达控制区域，例如，启动子、终止子、复制起点等。作为使在植物细胞内多聚核苷酸组成型表达的启动子的例子，可列举花椰菜花叶病毒的35s启动子、连接两个35s启动子的增强区域的el235s启动子、rd29a基因启动子、rbcs启动子、mac-1启动子等。此外，为了组织特异性的基因表达，可使用在该组织中进行特异性表达的基因的启动子。
[0129]
载体的制作，可依照使用限制酶、连接酶等的常用方法进行实施。此外，基于表达载体的宿主植物的转化也可依照常用方法进行实施。
[0130]
在目前的技术水平下，可利用将多聚核苷酸导入植物并使该多聚核苷酸组成型或组织特异性表达的技术。向植物中的dna的导入，可通过本领域技术人员公知的方法例如农杆菌法、双元载体法、电穿孔法、peg法、粒子枪法等来进行。
[0131]
本发明中，可用作宿主的植物并无特别限定，可使用蔷薇科蔷薇属、菊花科菊花属、石竹科石竹属(康乃馨等)、百合科百合属的植物，特别优选为蔷薇科蔷薇属的栽培蔷薇(学名rosa hybrida)。另外，所谓本说明书中使用的用语“蔷薇植物”，为在分类学上的定位中蔷薇科蔷薇属的栽培蔷薇(学名rosa hybrida)。蔷薇根据树形和花的大小，主要分为杂交茶香月季(hybrid tea)类、丰花月季(floribunda)类、西洋樱草(polyantha)类等，在任一系统中花瓣中所含的主要的色素(花色素苷)皆仅为矢车菊素型和天竺葵素型这两种。在本发明中，对于可用作宿主的蔷薇植物的种类无特别限定，可适当使用这些品种或系统。例如，作为可用作宿主的蔷薇品种可列举海洋之歌(ocean song)、贵族(noblesse)、rita
·
perfumera、冷水(cool water)、fame、topless、蜜桃雪山(peach avalanche)等。
[0132]
根据本发明可制作均匀且稳定地具有蓝色系花色的转化植物，优选为蔷薇科蔷薇属、菊花科菊花属或石竹科石竹属(康乃馨等)，特别优选为蔷薇植物。获得的转化植物表现出rhs色谱标准下的blue组或violet-blue组，且/或ciel*a*b*表色系的色相角度339.7
°
～270.0
°
，优选315
°
以下的花色。
[0133]
进一步，本发明还涉及通过上述方法获得的转化植物或其自繁或者杂交后代的切花、它们的营养繁殖体、植物的一部分、组织或细胞、或者由该切花制成的加工品(尤其是切花加工品)。在此作为切花加工品，包括使用该切花的压花、保鲜花、干花、树脂密封品等，但并不限定于此。
[0134]
以下通过实施例对本发明进行具体地说明。
[0135]
实施例
[0136]
[实施例1：黄酮c-糖苷相对于花色素苷(二甲花翠苷)的辅色素效果的模拟]
[0137]
为了进行黄酮c-糖苷相对于花色素苷(二甲花翠苷)的辅色素效果的模拟，对二甲花翠苷及黄酮c-糖苷进行调整。本实验中使用的二甲花翠苷(二甲花翠素3，5-二糖苷)及黄酮c-糖苷(牡荆素(芹菜素8-c-糖苷)、异牡荆素(芹菜素6-c-糖苷)、荭草素(木犀草素8-c-糖苷)、异荭草素(木犀草素6-c-糖苷)、维采宁-2(芹菜素6，8-二-c-糖苷))由nacalai tesque株式会社购入。
[0138]
相对于如此获得的二甲花翠苷，在ph5.0的缓冲液中，以5当量的摩尔浓度比添加各黄酮c-糖苷(牡荆素、异牡荆素、荭草素、异荭草素、维采宁-2)，测定吸收光谱。二甲花翠苷的浓度设为0.5mm。
[0139]
[表1]
[0140]
添加黄酮c-糖苷时的二甲花翠苷水溶液的吸收极值(λmax)及色相角度(
°
)
[0141][0142]
通过添加黄酮c-糖苷，二甲花翠苷水溶液的吸光度增加，添加任一种黄酮c-糖苷时，与二甲花翠苷单独的情况相比，吸收极值(λmax)均向长波长侧移动。此外，其效果为确认以异牡荆素＞异荭草素＞荭草素＞牡荆素＞维采宁-2的顺序，吸收极值向长波长侧移动。进一步确认，关于色相角度同样以异牡荆素＞异荭草素＞荭草素＞牡荆素＞维采宁-2的顺序变小。由上明确黄酮单-c-糖苷的辅色素效果比黄酮二-c-糖苷高。进一步明确黄酮单-c-糖苷中，黄酮6-c-糖苷的辅色素效果尤其高。
[0143]
[实施例2：向蔷薇品种“海洋之歌”中导入来自风铃草的f3
’5’
h基因和来自蓝猪耳的mt基因、来自甘草的f2h基因、来自稻子的改变密码子使用的cgt基因、来自百脉根的fdh基因]
[0144]
pspb6486以pbinplus为基本骨架，并含有以下5种表达盒。
[0145]
(1)el235s启动子和来自风铃草的f3
’5’
h全长cdna(序列号1)和d8终止子
[0146]
(2)el235s启动子和来自蓝猪耳的mt全长cdna(序列号3)和nos终止子
[0147]
(3)35s启动子和来自甘草的f2h全长cdna(序列号5)和来自紫苏的at终止子
[0148]
(4)35s启动子和来自稻子的改变密码子使用的cgt全长cdna(序列号7)和来自拟南芥的hsp终止子
[0149]
(5)35s启动子和来自百脉根的fdh全长cdna(序列号9)和来自拟南芥的hsp终止子
[0150]
本质粒在植物中，对风铃草的f3
’5’
h基因和蓝猪耳的mt基因、甘草的f2h基因、稻子的改变密码子使用的cgt基因、百脉根的fdh基因进行组成型表达。
[0151]
将如此制作的pspb6486导入蓝色系蔷薇品种“海洋之歌”中，获得总计27个体的转化体。对它们进行色素分析的结果，在26个体中确认二甲花翠素的累积，二甲花翠素含有率最高为74.5％(平均57.0％)。进一步，作为黄酮c-糖苷，实施异牡荆素(芹菜素6-c-糖苷)、牡荆素(芹菜素8-c-糖苷)、异荭草素(木犀草素6-c-糖苷)、荭草素(木犀草素8-c-糖苷)、维采宁-2(芹菜素6，8-c-二糖苷)的鉴定及定量。在检测出二甲花翠素的所有个体中可检出黄酮c-糖苷，作为主成分检测出作为黄酮二-c-糖苷的维采宁-2。生成量的顺序为维采宁-2＞异牡荆素＞牡荆素＞异荭草素＞荭草素，总量最高为每花瓣新鲜重量1g中1.563mg。此外，黄酮c-糖苷的总量相对于二甲花翠素为约10倍以上的生成量。
[0152]
代表性转化体的分析值示于下表2。
[0153]
[表2]
[0154][0155]
宿主：海洋之歌
[0156]
del：花翠素、cya：矢车菊素、pet：矮牵牛素、pel：天竺葵素、mal：二甲花翠素
[0157]
m：杨梅素、q：槲皮素、k：山奈酚
[0158]
tri：五羟黄酮、lut：木犀草素、api：芹菜素、vic2：维采宁-2、vx：牡荆素、ivx：异牡荆素、ori：荭草素、iori：异荭草素
[0159]
mal(％)：总花青素中的二甲花翠素的比例
[0160]
[实施例3：向蔷薇品种“海洋之歌”中导入来自风铃草的f3
’5’
h基因和来自蓝猪耳的mt基因、来自甘草的f2h基因、来自荞麦的改变密码子使用的cgt基因、来自百脉根的fdh
基因]
[0161]
pspb7473以pbinplus为基本骨架，并含有以下5种表达盒。
[0162]
(1)el235s启动子和来自风铃草的f3
’5’
h全长cdna(序列号1)和d8终止子
[0163]
(2)el235s启动子和来自蓝猪耳的mt全长cdna(序列号3)(在5’位侧附加来自拟南芥hspro基因的5
’‑
utr(序列号13))和来自拟南芥的hsp终止子
[0164]
(3)el235s启动子和来自甘草的f2h全长cdna(序列号5)和来自紫苏的at终止子
[0165]
(4)el235s启动子和来自荞麦的改变密码子使用的cgt全长cdna(序列号11)(在5’位侧附加来自拟南芥hspro基因的5
’‑
utr(序列号13))和来自拟南芥的hsp终止子
[0166]
(5)el235s启动子和来自百脉根的fdh全长cdna(序列号9)和来自拟南芥的hsp终止子
[0167]
本质粒在植物中，对风铃草的f3
’5’
h基因和蓝猪耳的mt基因、甘草的f2h基因、荞麦的改变密码子使用的cgt基因、百脉根的fdh基因进行组成型表达。
[0168]
将如此制作的pspb7473导入蓝色系蔷薇品种“海洋之歌”中，获得总计35个体的转化体。对它们进行色素分析的结果，在21个体中确认二甲花翠素的累积，二甲花翠素含有率最高为20.8％(平均9.1％)。进一步，作为黄酮c-糖苷，实施异牡荆素(芹菜素6-c-糖苷)、牡荆素(芹菜素8-c-糖苷)、异荭草素(木犀草素6-c-糖苷)、荭草素(木犀草素8-c-糖苷)、维采宁-2(芹菜素6，8-c-二糖苷)的鉴定及定量。在检测出二甲花翠素的所有个体中可检出黄酮c-糖苷，作为主成分检测出作为黄酮6-c-糖苷的异牡荆素。生成量的顺序为异牡荆素＞牡荆素＞维采宁-2＞异荭草素＞荭草素，总量最高为每花瓣新鲜重量1g中7.418mg，为非常高的含量。与实施例2中所示的os/6486系统相比，几乎所有个体表现出黄酮c-糖苷的总量为每花瓣新鲜重量1g中3mg以上的高含量，相对于花翠素为约100倍以上的生成量。
[0169]
代表性转化体的分析值示于下表3。
[0170]
[表3]
[0171][0172]
宿主：海洋之歌
[0173]
del：花翠素、cya：矢车菊素、pet：矮牵牛素、pel：天竺葵素、mal：二甲花翠素
[0174]
m：杨梅素、q：槲皮素、k：山奈酚
[0175]
tri：五羟黄酮、lut：木犀草素、api：芹菜素、vic2：维采宁-2、vx：牡荆素、ivx：异牡荆素、ori：荭草素、iori：异荭草素
[0176]
mal(％)：总花青素中的二甲花翠素的比例
[0177]
[实施例4：向蔷薇品种“海洋之歌”中导入来自风铃草的f3
’5’
h基因和来自蓝猪耳的mt基因、来自甘草的f2h基因、来自荞麦的cgt基因、来自百脉根的fdh基因]
[0178]
pspb7472以pbinplus为基本骨架，并含有以下5种表达盒。
[0179]
(1)el235s启动子和来自风铃草的f3
’5’
h全长cdna(序列号1)和d8终止子
[0180]
(2)el235s启动子和来自蓝猪耳的mt全长cdna(序列号3)(在5’位侧附加来自拟南芥hspro基因的5
’‑
utr(序列号13))和来自拟南芥的hsp终止子
[0181]
(3)el235s启动子和来自甘草的f2h全长cdna(序列号5)和来自紫苏的at终止子
[0182]
(4)el235s启动子和来自荞麦的cgt全长cdna(序列号14)(在5’位侧附加来自拟南芥hspro基因的5
’‑
utr(序列号13))和来自拟南芥的hsp终止子
[0183]
(5)el235s启动子和来自百脉根的fdh全长cdna(序列号9)和来自拟南芥的hsp终止子
[0184]
本质粒在植物中，对风铃草的f3
’5’
h基因和蓝猪耳的mt基因、甘草的f2h基因、荞麦的cgt基因、百脉根的fdh基因进行组成型表达。
[0185]
将如此制作的pspb7472导入蓝色系蔷薇品种“海洋之歌”中，获得总计33个体的转化体。接着，作为黄酮c-糖苷，实施异牡荆素(芹菜素6-c-糖苷)、牡荆素(芹菜素8-c-糖苷)、异荭草素(木犀草素6-c-糖苷)、荭草素(木犀草素8-c-糖苷)、维采宁-2(芹菜素6，8-c-二糖苷)的鉴定及定量，作为花青素，实施花翠素、矢车菊素、矮牵牛素、天竺葵素、二甲花翠素的鉴定及定量。其结果在11个体中确认黄酮c-糖苷及二甲花翠素的累积。黄酮c-糖苷的平均含量为每花瓣新鲜重量1g中3.75mg，作为主成分检测出作为黄酮6-c-糖苷的异牡荆素。此外，二甲花翠素的含有率最高为15.6％(平均8.8％)。
[0186]
如以上所示，每花瓣新鲜重量1g中的黄酮c-糖苷的平均含量在实施例3所示的os/7473系统一方高达4.19mg。即，表明与原始的来自荞麦的cgt基因相比改变密码子的cgt基因一方可更有效地生成黄酮c-糖苷。
[0187]
代表性转化体的分析值示于下表4。
[0188]
[表4]
[0189][0190]
宿主：海洋之歌
[0191]
del：花翠素、cya：矢车菊素、pet：矮牵牛素、pel：天竺葵素、mal：二甲花翠素
[0192]
m：杨梅素、q：槲皮素、k：山奈酚
[0193]
tri：五羟黄酮、lut：木犀草素、api：芹菜素、vic2：维采宁-2、vx：牡荆素、ivx：异牡荆素、ori：荭草素、iori：异荭草素
[0194]
mal(％)：总花青素中的二甲花翠素的比例
[0195]
[实施例5：向蔷薇品种“海洋之歌”中导入来自风铃草的f3
’5’
h基因和来自蓝猪耳的mt基因、来自甘草的f2h基因、来自荞麦的cgt基因、来自百脉根的fdh基因]
[0196]
pspb7808以pbinplus为基本骨架，并含有以下5种表达盒。
[0197]
(1)el235s启动子和来自风铃草的f3
’5’
h全长cdna(序列号1)和d8终止子
[0198]
(2)el235s启动子和来自蓝猪耳的mt全长cdna(序列号3)和来自拟南芥的hsp终止子
[0199]
(3)el235s启动子和来自甘草的f2h全长cdna(序列号5)和来自紫苏的at终止子
[0200]
(4)el235s启动子和来自荞麦的cgt全长cdna(序列号14)(在5’位侧附加来自拟南芥醇脱氢酶(adh)基因的5
’‑
utr(序列号15))和来自拟南芥的hsp终止子
[0201]
(5)el235s启动子和来自百脉根的fdh全长cdna(序列号9)和来自拟南芥的hsp终止子
[0202]
本质粒在植物中，对风铃草的f3
’5’
h基因和蓝猪耳的mt基因、甘草的f2h基因、荞麦的cgt基因、百脉根的fdh基因进行组成型表达。
[0203]
将如此制作的pspb7808导入蓝色系蔷薇品种“海洋之歌”中，获得总计65个体的转化体。接着，作为黄酮c-糖苷，实施异牡荆素(芹菜素6-c-糖苷)、牡荆素(芹菜素8-c-糖苷)、异荭草素(木犀草素6-c-糖苷)、荭草素(木犀草素8-c-糖苷)、维采宁-2(芹菜素6，8-c-二糖苷)的鉴定及定量，作为花青素，实施花翠素、矢车菊素、矮牵牛素、天竺葵素、二甲花翠素的鉴定及定量。其结果在32个体中确认黄酮c-糖苷及二甲花翠素的累积。黄酮c-糖苷的平均含量为每花瓣新鲜重量1g中3.00mg，作为主成分检测出作为黄酮6-c-糖苷的异牡荆素。此外，二甲花翠素的含有率最高为69.2％(平均43.9％)。
[0204]
代表性转化体的分析值示于下表5。
[0205]
[表5]
[0206][0207]
宿主：海洋之歌
[0208]
del：花翠素、cya：矢车菊素、pet：矮牵牛素、pel：天竺葵素、mal：二甲花翠素
[0209]
m：杨梅素、q：槲皮素、k：山奈酚
[0210]
tri：五羟黄酮、lut：木犀草素、api：芹菜素、vic2：维采宁-2、vx：牡荆素、ivx：异牡荆素、ori：荭草素、iori：异荭草素
[0211]
mal(％)：总花青素中的二甲花翠素的比例
[0212]
[实施例6：向蔷薇品种“海洋之歌”中导入来自风铃草的f3
’5’
h基因和来自蓝猪耳的mt基因、来自甘草的f2h基因、来自荞麦的改变密码子使用的cgt基因、来自百脉根的fdh基因]
[0213]
pspb7809以pbinplus为基本骨架，并含有以下5种表达盒。
[0214]
(1)el235s启动子和来自风铃草的f3
’5’
h全长cdna(序列号1)和d8终止子
[0215]
(2)el235s启动子和来自蓝猪耳的mt全长cdna(序列号3)和来自拟南芥的hsp终止子
[0216]
(3)el235s启动子和来自甘草的f2h全长cdna(序列号5)和来自紫苏的at终止子
[0217]
(4)el235s启动子和来自荞麦的改变密码子使用的cgt全长cdna(序列号11)(在5’位侧附加来自拟南芥醇脱氢酶(adh)基因的5
’‑
utr(序列号15))和来自拟南芥的hsp终止子
[0218]
(5)el235s启动子和来自百脉根的fdh全长cdna(序列号9)和来自拟南芥的hsp终止子
[0219]
本质粒在植物中，对风铃草的f3
’5’
h基因和蓝猪耳的mt基因、甘草的f2h基因、荞麦的改变密码子使用的cgt基因、百脉根的fdh基因进行组成型表达。
[0220]
将如此制作的pspb7809导入蓝色系蔷薇品种“海洋之歌”中，获得总计143个体的转化体。接着，作为黄酮c-糖苷，实施异牡荆素(芹菜素6-c-糖苷)、牡荆素(芹菜素8-c-糖苷)、异荭草素(木犀草素6-c-糖苷)、荭草素(木犀草素8-c-糖苷)、维采宁-2(芹菜素6，8-c-二糖苷)的鉴定及定量，作为花青素，实施花翠素、矢车菊素、矮牵牛素、天竺葵素、二甲花翠素的鉴定及定量。其结果在58个体中确认黄酮c-糖苷的累积。黄酮c-糖苷的平均含量为每花瓣新鲜重量1g中3.24mg，作为主成分检测出作为黄酮6-c-糖苷的异牡荆素。此外，二甲花翠素的含有率最高为80.3％(平均46.6％)。
[0221]
如以上所示，每花瓣新鲜重量1g中的黄酮c-糖苷的平均含量在本实施例所示的os/78093系统一方较高。从而，与实施例3及4中所得的结果相同，表明与原始的来自荞麦的cgt基因相比改变密码子的cgt基因一方可更有效地生成黄酮c-糖苷。
[0222]
代表性转化体的分析值示于下表6。
[0223]
[表6-1]
[0224][0225]
[表6-2]
[0226][0227]
宿主：海洋之歌
[0228]
del：花翠素、cya：矢车菊素、pet：矮牵牛素、pel：天竺葵素、mal：二甲花翠素
[0229]
m：杨梅素、q：槲皮素、k：山奈酚
[0230]
tri：五羟黄酮、lut：木犀草素、api：芹菜素、vic2：维采宁-2、vx：牡荆素、ivx：异牡荆素、ori：荭草素、iori：异荭草素
[0231]
mal(％)：总花青素中的二甲花翠素的比例
[0232]
[实施例7：含有黄酮c-糖苷的蔷薇的花色的评价]
[0233]
对于在实施例2及3中制作的转化体(以蔷薇品种“海洋之歌”为宿主)，使用分光光度计cm-2022(美能达株式会社)在10度视野、d65光源下分别对花瓣的色彩进行测定，通过色彩管理软件spectramagictm(美能达株式会社)进行解析。
[0234]
在色相角度的平均值的对比中，cgt基因为来自荞麦的(实施例3)的蔷薇与来自稻子的(实施例2)的蔷薇之前的花瓣的色相角度未见差异。然而，若另外从个体方面来看，导入来自荞麦的cgt基因的蔷薇中色相角度表现为315
°
以下的个体多，其中还获得了表现出294.5
°
的至今为止变得最蓝的个体。由以上的结果，确认通过利用来自荞麦的cgt基因，可显著增加黄酮c-糖苷的生成量，尤其是单-c-糖苷的生成量，而这些与花色素苷的共存可使花瓣的色彩变蓝。
[0235]
结果示于表7。
[0236]
[表7]
[0237]