使用LNA探针和用于复合物迁移的膜的miRNA检测的制作方法

使用lna探针和用于复合物迁移的膜的mirna检测
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年7月8日提交的美国临时申请号62/871,295的权益，将该临时申请通过引用以其全文特此并入本文。
3.关于联邦资助的研究或开发的声明
4.本发明是在由国立卫生研究院授予的资助号u01ca207946和r01eb012135的政府支持下进行。政府在本发明中享有一定的权利。
5.序列表
6.本技术含有2020年6月16日创建的、以名为“321501_2120_sequence_listing_st25”的ascii.txt文件的电子形式提交的序列表。序列表的内容以其全文并入本文。


背景技术：

7.当第一个人类基因组在几十年前被完全测序时，人们发现只有1.5％的人类基因组编码蛋白。其余98.5％中很大一部分被认为是“垃圾dna”。然而，越来越多的证据揭示，所谓的“垃圾dna”中有相当大的一部分编码小的非编码rna。最近，随着技术的进步，许多长的非编码rna被鉴定出来，这使得表征长的rna分子成为可能。据预测，药物开发的第三个里程碑将是rna药物(rna本身作为药物，或者靶向rna的化学物质/配体)，这之前的第一个里程碑是化学药物，并且第二个里程碑是蛋白药物，包括靶向蛋白的抗体、酶、激素或化学物质/配体。
8.最近的证据已揭示，mirna在细胞功能的调节中起主要作用。特别地，已在rna沉默和基因表达的转录后调节中观察到mirna。在细胞外环境(如生物流体和细胞培养基)中观察到一些mirna。mirna在健康和患病细胞(如癌细胞)中表达率的差异使得这些循环mirna或细胞外mirna有望成为疾病检测的生物标志。mirna的常规分析包括qpcr、微阵列、和高通量测序；这些技术是昂贵的、劳动密集型的、且在典型的医生办公室不可用。


技术实现要素：

9.本文披露了一种用于检测流体样品中靶分子的存在的系统，该靶分子是例如靶单链核酸或多肽。该系统可涉及横向流动装置，该横向流动装置包括多孔横向流动测试条、溶剂储存器和固定的寡核苷酸，该固定的寡核苷酸与在检测点或线处附着至该横向流动测试条的靶分子的第一部分选择性地结合。该系统可进一步涉及标志寡核苷酸，该标志寡核苷酸选择性地结合与检测试剂缀合的靶分子的第二部分。该系统可进一步涉及对照寡核苷酸，该对照寡核苷酸与在对照点或线处附着至该横向流动测试条的标志寡核苷酸的一部分互补。该系统还可涉及溶剂，该溶剂被配置为通过毛细力将样品拖过该横向流动测试条。
10.还披露了一种用于检测流体样品中靶分子的存在的方法，该方法涉及使该流体样品与标志寡核苷酸接触，该标志寡核苷酸在适合用于该标志选择性地结合以与该靶分子杂交的条件下与靶分子(该靶分子与检测试剂缀合)的第一部分选择性结合；以及将该步骤之后的样品在适合用于该溶剂通过毛细力将该样品拉过该横向流动测试条的条件下施用于
所披露的横向流动装置。该方法接着可以涉及测定该横向流动测试条在该检测点或线处的检测试剂。
11.在一些实施例中，该横向流动测试条包含硝酸纤维素、醋酸纤维素、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚碳酸酯、或玻璃纤维膜。
12.在一些实施例中，该靶分子是单链核酸分子。在这些实施例中，该固定化寡核苷酸可以与该靶核酸的第一部分互补，并且该标志寡核苷酸可以与该靶分子的第二部分互补。例如，在一些实施例中，该靶单链核酸包含mrna、ncrna、srna、pirna、mirna、tran、rrna、sirna、lncrna、snorna、snrna、exrna、或scarna。在一些实施例中，该靶单链核酸包含xist或hotair非编码rna。
13.在一些实施例中，该靶分子是多肽。在这些实施例中，该固定化寡核苷酸可以是核酸(例如dna)适配体，并且该标志寡核苷酸可以是核酸(例如dna)适配体。在一些实施例中，该固定化寡核苷酸被蛋白结合剂(如抗体)替代。
14.在一些实施例中，所披露的核酸适配体包含一种或多种锁核酸、2'-氟代rna、2'-o甲基rna、rna、dna、或硫代磷酸酯-dna。在一些实施例中，所披露的核酸适配体包含一种或多种锁核酸、锁核酸、2'-氟代rna、2'-o甲基rna、rna、dna、或硫代磷酸酯-dna。在一些实施例中，该对照寡核苷酸包含一种或多种锁核酸、dna、或硫代磷酸酯-dna。
15.在一些实施例中，该靶分子是病毒蛋白。例如，在一些实施例中，该病毒蛋白是sars-cov-2n蛋白或s蛋白。在一些实施例中，该病毒蛋白是hiv gp120或gp41蛋白。
16.在一些实施例中，该靶分子是癌症生物标志。因此，还披露了一种诊断或预测受试者的癌症的方法，该方法涉及使用所披露的装置、系统、和/或方法，使用与靶核酸的一部分互补的标志和固定化寡核苷酸测定来自该受试者的体液，该靶核酸是癌症疾病或进展的生物标志。
17.在一些实施例中，该流体样品包含血清、血浆、尿液、精液、或唾液。
18.在一些实施例中，该固定化寡核苷酸与固定剂缀合，其中该固定化寡核苷酸通过该固定剂附着至该横向流动测试条。同样，该对照寡核苷酸可与固定剂缀合，其中该对照寡核苷酸通过该固定剂附着至该横向流动测试条。在一些实施例中，该固定剂是生物素。在一些实施例中，该固定剂是化学交联剂。在一些实施例中，该固定剂是脂质，其中该脂质通过疏水力(如胆固醇、或化学固定或交联)将该固定化寡核苷酸固定至该横向流动测试条。
19.在一些实施例中，该检测剂包含荧光分子、染色的微球、量子点、荧光猝灭分子、嵌入荧光染料、金纳米颗粒、或氧化铁纳米颗粒。
20.在附图和下文的描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。根据描述和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目的和优点将是明显的。
附图说明
21.图1是检测用于癌症诊断的mirna的装置、系统、和方法的实施例的展示。
22.图2a和2b示出了荧光-lna和mirna21的杂交研究。
23.图3a和3b示出了荧光-rna在硝酸纤维素膜上的流动。
24.图4a至4c示出了胆固醇帮助rna锚定至硝酸纤维素膜。
25.图5a至5d示出了胆固醇在3wj不同位置处的锚定效率。
26.图6a和6b示出了不同量的胆固醇对锚定的影响。
27.图7a至7c示出了mir21 lna2-af647与nc膜上的lna1和lna3结合。由于缺乏阴性对照，无法确定特异性结合。
28.图8a和8b示出了lna2-af647与nc膜上的lna1非特异性结合。
29.图9a至9c示出了胆固醇是否影响lna2-af647与nc膜上的lna1的非特异性结合。
30.图10a至10d示出了从lna2至2'f rna的变化，以解决非特异性结合。
31.图11示出了2'f抗21-af647与mir21特异性结合并且不与mir21-s结合。
32.图12示出了胶体金标记lna2的电泳检测。
33.图13a至13d示出了标记不同浓度的胶体金-lna2对nc膜上的lna3的结合能力。
34.图14示出了胶体金-lna2对nc膜上锚定的不同浓度的lna3的结合能力。
35.图15示出了用于癌症诊断的两种基于lna的探针夹心方法。
36.图16示出了lna-rna的杂交研究。
37.图17示出了lna-rna的杂交研究。
38.图18a至18c示出了rna样品在新nc膜上的横向流动。
39.图19a至19c示出了rna样品在新nc膜上的横向流动。
40.图20示出了lna-a647杂交。
41.图21示出了nc膜上的lna-a647横向流动。
42.图22示出了示例横向流动测定开发装置。
43.图23示出了横向流动测定开发流程的实例。
44.图24示出了通过rna脂质在nc膜上进行的rna锚定。
45.图25示出了af647与lna2的缀合物在nc膜上的横向流动测试。
46.图26a和26b示出了固定有lna1-chol(图26a)或lna3-chol(图26b)的nc膜的横向流动，用于mir21诊断。
47.图27a和27b示出了lna2-af647(图27a)或3wj-b-alexa647(图27b)在lna1-nc膜上的横向流动，用于mir21诊断。
48.图28示出了仅lna2-af647，lna2-af647与lna3-chol、lna1-chol、或lna1-chol mir21的横向流动。
49.图29a示出了在使用lna2-af647的横向流动测试中的假阳性信号。图29b示出了使用另一条带有af647的rna链没有信号。
50.图30a至30c示出了假阳性信号不是来自胆固醇。
51.图31a至31c示出了2'f修饰的抗mir21-2-af647在杂交研究中也可以与mir21高效地结合。
52.图32a至32d示出了横向流动测试的重复，示出了2'f修饰可以消除与lna1的非特异性反应。
53.图33示出了mir21与带有mir21的延伸的2'f rna的杂交。
54.图34示出了使用硝酸纤维素膜检测sars-cov-2的covid-19快速诊断装置的设计的展示。
55.图35a示出了通过20％非变性page测定的rna探针的mir21杂交(红色：alexa647泳道，绿色：etbr泳道)。图35b示出了在锚定有固定探针的nc上检测mir21(左：mir21 标志探
针，右：标志探针；箭头示出了检测点)。图35c示出了通过1％琼脂糖凝胶测定的金与rna的缀合。
具体实施方式
56.在更详细地描述本披露之前，应理解的是本披露不限于所描述的特定实施例，因此这些当然可以改变。还应当理解，本文所用的术语仅是出于描述特定实施例的目的，而并不旨在进行限制，因为本披露的范围将仅由所附权利要求限定。
57.在提供一系列值时，应理解的是每个中间值，到下限的第十个单位(除非上下文清晰地另有指示)，该范围的上限与下限之间以及任何其他陈述的或在该陈述范围内的中间值均被涵盖在本披露之内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖于本披露内，但要遵守所陈述范围内任何特定排除的限制。在所陈述范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些包括的限值中任一个或两者的范围也包括在本披露中。
58.除非另有定义，否则本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。现在描述了优选的方法和材料，但与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料也可以用于实践或测试本披露。
59.在本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用并入本文，就像每个单独出版物或专利被特定地并且单独地指示为通过引用并入，并且通过引用并入本文以结合所引用的这些出版物来披露和描述这些方法和/或材料。任何出版物的引用内容是针对在提交日之前的披露，并且不能理解为承认因为先前披露而本披露不能获得比这些出版物更早的申请日。进一步地，所提供的公开日期可能与实际的公开日期不同，实际的公开日期可能需要独立地确认。
60.如将对于本领域技术人员清楚的是，在阅读本披露时，本文描述和展示的单独实施例中的每一个具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以在不偏离本披露的范围或精神的情况下易于与任何其他几个实施例的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。
61.除非另有指示，否则本披露的实施例将采用本领域技术范围内的化学、生物学等技术。
62.提出以下实例以便为本领域普通技术人员提供如何进行方法和使用探针(如本文披露和要求保护)的完整披露和描述。虽然已尽力确保数字(例如，量、温度等)的准确性，但仍应考虑一些误差和偏差。除非另有指示，否则份数是重量份数，温度是℃，并且压力是大气压或接近大气压。
63.在详细描述本披露的实施例之前，应当理解，除非另有指示，否则本披露不限于特定的材料、试剂、反应材料、制造方法等，因为这些可以改变。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在进行限制。在本披露中，在逻辑上可行的情况下，也能以不同的顺序执行步骤。
64.必须注意的是，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。
65.术语“抗体”是指选择性地结合靶抗原的天然或合成抗体。该术语包括多克隆和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子之外，术语“抗体”还包括那些免疫球蛋白分子的片
段或聚合物，以及选择性地结合靶抗原的人或人源化版本的免疫球蛋白分子。
66.术语“适配体”是指与特定靶分子结合的寡核酸或肽分子。这些分子通常选自随机序列库。所选择的适配体能够适应独特的三级结构并以高亲和力和特异性识别靶分子。“核酸适配体”是dna或rna寡核酸，其经由其构象与靶分子结合，并从而抑制或压制这种分子的功能。核酸适配体可由dna、rna、或它们的组合构成。“肽适配体”是一种组合蛋白分子，其可变肽序列插入恒定支架蛋白中。典型地，肽适配体的鉴定在严格的酵母双杂交条件下进行，这提高了所选择的肽适配体在细胞内环境中稳定表达和正确折叠的可能性。
67.术语“横向流动”是指一种系统，其中将怀疑含有靶核酸的样品置于包含色谱材料的测试条上，并且该样品通过毛细作用横向芯吸通过该测试条并与该条中的各种试剂结合。
68.锁核酸或“lna”意指修饰的rna核苷酸，其中核糖部分经修饰带有连接2'氧和4'碳的额外桥。锁核酸可以将复合物的稳定性提高大约十倍，并且可以改变核酸与探针的杂交温度。
69.本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链dna或rna，基因组dna，cdna，dna-rna杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生化修饰的、非天然的、或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
70.术语“寡核苷酸”通常是指单链或双链dna的在约5与约100个核苷酸之间的多核苷酸。然而，出于本披露的目的，寡核苷酸的长度没有上限。寡核苷酸也称为“寡聚体”或“寡聚核苷酸”，并可以从基因中分离、或通过本领域已知的方法化学合成。术语“多核苷酸”和“核酸”应理解为包括(如适用于所描述的实施例)单链(如有义或反义)和双链多核苷酸。
71.术语“寡核苷酸探针”是指具有与靶核酸的一部分互补的序列并且进一步与结合配偶体偶联的核酸。寡核苷酸探针可以与测试条的样品接收区可逆地结合，和/或可以用于在引入如本文所述的横向流动系统之前标记靶核酸(在后一种情况下，寡核苷酸探针也称为“引物”)。
72.术语“互补”或“互补性”参考由a与t配对和c与g配对的熟知的碱基配对规则相关的核酸(即，核苷酸的序列)使用。例如，序列5'-a-g-t-3'与序列3'-t-c-a-5'互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸碱基根据碱基配对规则匹配。另一方面，当所有碱基根据碱基配对规则匹配时，核酸链之间可存在“完全”或“总体”的互补性。如本领域熟知的，核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。这在依赖于核酸之间的结合的检测方法(如本发明的那些)中特别重要。术语“基本上互补”是指在如下文所述的高严格条件下或优选地在聚合酶反应缓冲液中加热至约956℃、然后冷却至约室温(例如，250℃
±
3℃)的情况下，任何探针可以与靶核酸序列的一条或两条链杂交。
73.术语“肽”、“多肽”、和“蛋白”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可包括编码和非编码氨基酸、化学或生化修饰的或衍生的氨基酸、和具有修饰肽骨架的多肽。
74.如本文所使用的，术语“特异性结合”是指确定靶分子在类似分子的异质群体中的存在的结合反应。因此，在指定条件(例如在抗体情况下的免疫测定条件)下，指定配体或抗体与其特定“靶标”“特异性结合”(例如抗体与内皮抗原特异性结合)，同时其不以显著量与
存在于样品中的其他蛋白或与该配体或抗体可在生物体中接触的其他蛋白结合。通常，“特异性结合”第二分子的第一分子具有与该第二个分子大于约105m-1
(例如，106m-1
、107m-1
、108m-1
、109m-1
、10
10
m-1
、10
11
m-1
、和10
12
m-1
或更多)的亲和常数(ka)。
[0075]“特异性杂交”意指探针、引物或寡核苷酸在高严格条件下识别基本上互补的核酸并与其发生物理相互作用(即碱基配对)，并且基本上不与其他核酸碱基配对。
[0076]“高严格条件”意指允许与使用长度至少40个核苷酸的dna探针在以下情况中得到的杂交相当的杂交的条件：在含有0.5m nahpo4(ph 7.2)、7％sds、1mm edta、和1％bsa(级分v)的缓冲液中，在温度65℃下；或含有48％甲酰胺、4.8x ssc、0.2m tris-cl(ph 7.6)、1x denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖、和0.1％sds的缓冲液，在42℃的温度下。用于高严格杂交(如用于pcr、northern杂交、southern杂交、或原位杂交、dna测序等)的其他条件是分子生物学领域技术人员熟知的。(参见例如，f.ausubel等人,current protocols in molecular biology[分子生物学当前方案],john wiley&sons[约翰
·
威利父子公司],纽约,ny,1998)。
[0077]
术语“来自受试者的样品”是指组织(例如，组织活检)、器官、细胞(包括维持在培养中的细胞)、细胞裂解物(或裂解物级分)、衍生自细胞或细胞材料(例如多肽或核酸)的生物分子、或来自受试者的体液。体液的非限制性实例包括血液、尿液、血浆、血清、泪液、淋巴液、胆汁、脑脊液、间质液、房水或玻璃体液、初乳、痰液、羊水、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液、精液、漏出液、渗出液和滑液。
[0078]
术语“受试者”是指作为施用或治疗目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人患者或兽医患者。术语“患者”是指在临床医生(例如医师)治疗下的受试者。
[0079]
横向流动装置
[0080]
本文披露了一种用于检测流体样品中靶分子的存在或不存在的横向流动测定装置，所述装置包含具有第一端和第二端的测试条，并且包含在所述第一端处或附近的用于接收样品的样品接收区(样品垫)、与该样品接收区横向流动接触的捕获区、以及置于所述测试条的第二端处或附近的吸收区(吸收垫)，所述吸收区与该捕获区横向流动接触。
[0081]
在一些实施例中，样品接收区是含有标志寡核苷酸探针的多孔材料，其中这些标志寡核苷酸探针与靶分子的第一部分特异性结合以形成靶复合物。在一些实施例中，标志寡核苷酸与可检测部分缀合。
[0082]
在一些实施例中，捕获区在其一部分中含有固定至其上的固定化寡核苷酸，该固定化寡核苷酸与靶分子的第二部分特异性结合。在一些实施例中，靶复合物被捕获区中的固定化寡核苷酸捕获。
[0083]
在一些实施例中，测试条进一步包含与样品接收区和吸收区横向流动接触的对照区，其中该对照区含有固定至其上的对照探针，该对照探针与未结合的标志寡核苷酸探针特异性杂交。
[0084]
本发明的横向流动装置(例如测试条)100的一个实施例在图1中示出。在图1示出的实施例中，横向流动膜106延伸测试条的长度，并且样品接收区材料102附着至横向流动膜106上。样品接收区102用于接收可含有靶分子110的流体样品，并用于开始该样品沿测试条的流动。样品接收区102由能够引导流体样品横向流动的天然或合成多孔或大孔材料制
成。适合用于横向流动装置目的的多孔或大孔材料通常具有大于12μm的孔径。多孔材料的实例包括但不限于玻璃、棉花、纤维素、聚酯、人造丝、尼龙、聚醚砜和聚乙烯。
[0085]
样品接收区102材料必须是不会不可逆地结合核酸(即，寡核苷酸探针和靶核酸)的材料。相反，样品接收区102材料必须在使用横向流动装置之前以无水形式将寡核苷酸探针充分保留在样品接收区上或样品接收区内，但还必须在与流体样品接触时释放寡核苷酸探针并且还允许靶核酸的横向流动。如下文所讨论，用于制备流体样品的溶液还起到再水合并从而从样品区接收材料释放寡核苷酸探针的作用。
[0086]
在一个实施例中，样品接收区102材料含有一个或多个标志寡核苷酸探针120的无水形式，其与靶分子110的第一区域选择性地结合。
[0087]
标志寡核苷酸探针可以通过真空转移、或通过其他熟知的方法(如干燥和干化)直接可逆地与样品接收区102材料结合。在该实施例中，寡核苷酸探针发挥作用以在靶核酸通过测试条的样品接收区时通过与其杂交而用结合配偶体标记靶核酸。
[0088]
横向流动膜106包含能够引导横向流动并与标记区材料横向流动接触的微孔材料。适合用于捕获区膜的材料包括但不限于具有约0.05μm至12μm孔径的微孔材料，如硝酸纤维素、聚醚砜、聚偏氟乙烯、尼龙、电荷修饰尼龙、和聚四氟乙烯。
[0089]
捕获区104包含特异性结合靶分子110的第二部分的固定化寡核苷酸130。该捕获区中的第一捕获部分的布置可以是例如点、线、曲线、带、交叉、或它们的组合的形式。
[0090]
在一些实施例中，测定进一步含有固定在捕获区104中或在单独的对照区108中的对照探针140，对照探针140与未结合的标志寡核苷酸探针120特异性杂交。捕获区104或对照区108中的对照探针140的布置可以是点、线、曲线、带、交叉、或它们的组合的形式。
[0091]
在一个实施例中，如图1所示出，对照区108在与捕获区104分开的区域中。可替代地，固定化寡核苷酸130和对照探针140包含在捕获区104内。因此，在一些实施例中，标志寡核苷酸120和对照探针140含有不同颜色的检测部分。对照区域108的有用之处在于，对照区域108中颜色的出现发出了可以读取测试结果的时间的信号，即使对于阴性结果也是如此。因此，当预期的颜色出现在对照区域108中时，可以注意到捕获区104中颜色的存在或不存在。
[0092]
将捕获部分固定至膜的方法在本领域中是熟知的。一般而言，可以使用经合适的缓冲液稀释的测试捕获部分的溶液以及经合适的缓冲液稀释的对照捕获部分的溶液、用线性试剂分配系统将测试和对照捕获部分分配到膜上作为间隔的平行线(即，分别形成区域104和108)。在空气干燥一段适当的时间段后，将膜用合适的缓冲液封闭并储存在干燥器中直到组装测试条。
[0093]
吸收垫或吸收区110是置于与测试条的远端处的捕获区横向流动接触的吸收材料。在图1示出的实施例中，吸收垫110附着至捕获区膜106上，与样品接收区和标记区位于膜的同一侧。吸收垫110有助于通过毛细作用将测试样品从样品接收区抽取到测试条的远端。适合用作吸收垫的用途的材料的实例包括任何吸收材料，包括但不限于硝酸纤维素、纤维素酯、玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃纤维)、聚醚砜、和棉花。
[0094]
在图1展示的实施例中，横向流动膜106附着至刚性或半刚性支撑体114，其为测试条提供结构支撑。支撑体可由任何合适的刚性或半刚性材料制成，如聚(氯乙烯)、聚丙烯、聚酯、和聚苯乙烯。横向流动膜106可以通过任何合适的粘合方式如用双面粘合带附着至支
撑体114。可替代地，支撑体114可以是压敏粘合层压体，例如，在一侧具有丙烯酸压敏粘合剂的聚酯支撑体，在应用到膜之前任选地用离型纸覆盖。
[0095]
用于制备流体样品的溶液含有使寡核苷酸探针再水合的试剂，从而将探针从测试条上释放出来。例如，探针可以简单地通过用水进行再水合而从材料中释放出来。本领域已知额外的“释放剂”如表面活性剂、明胶(例如，鱼皮明胶)、聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)、吐温20、和糖(例如，蔗糖或山梨糖醇)可以促进探针的释放。因此，当将流体样品应用到样品接收区时，样品中的靶核酸与第一和第二寡核苷酸探针特异性杂交以形成包含第一和第二结合配偶体(a)和(b)的复合物。靶核酸/可见部分的复合物通过在标记区104方向上的毛细作用继续沿着测试条100与流体样品一起流动。
[0096]
所披露的测定可以在高或低严格条件下进行。术语“严格”参考进行核酸杂交的温度、离子强度、和其他化合物的存在的条件使用。在“高严格”条件下，核酸碱基配对将仅发生在具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间。因此，当希望彼此不完全互补的核酸杂交或退火在一起时，通常需要“弱”或“低”严格的条件。本领域技术人员知道，可以采用许多等效条件来包含低严格条件。严格条件下的杂交需要完美或接近完美的序列匹配。宽松条件下的杂交允许具有小于100％同一性的序列之间的杂交。可以通过降低盐浓度或提高杂交的温度来实现更高的严格性。
[0097]
在一些实施例中，所披露的横向流动装置包括加热片，并且可以在高于室温的温度下进行测定。在一些实施例中，测定在约25℃与95℃之间的温度下进行。在高温下进行横向流动测定可用于许多应用(包括法医学)以及用于确定核酸链之间的沃森-克里克(watson-crick)互补性。
[0098]
在一些实施例中，所披露的测定是用于检测特定蛋白、dna或rna靶标的完整的、一步的、即用型的、全功能的横向流动检测系统。该构建体以无水形式包含所有必需的试剂。在一些实施例中，横向流动装置组件可以完全密封，以预防使用期间的核酸污染。在该实施例中，装置的完整性没有受到影响。
[0099]
所披露的测定和装置适用于检测任何靶分子，如靶核酸。术语“靶核酸”是指待通过本文披露的装置和方法检测的核酸靶标。典型地，靶分子的来源将从生物体和病原体(如病毒和细菌)中分离出来。典型的分析物可包括核酸片段，包括dna、rna或它们的合成类似物。额外地，预期靶标也可以来自合成的来源。
[0100]
所披露的测定和装置可以检测从多种样品获得的靶分子。因此，如本文所使用的术语“样品”或“测试样品”是指任何潜在含有靶核酸的流体样品。样品可以包括衍生自农业来源、细菌和病毒来源、以及人或其他动物来源的生物样品，以及其他样品，如废水或饮用水、农产品、加工食品、空气等。生物样品的实例包括血液、粪便、痰液、粘液、血清、尿液、唾液、泪珠、组织(如活检样品、组织学组织样品、和组织培养产品)、农产品、废水或饮用水、食品、空气等。所披露的测定有用于检测与某些疾病或病症(如遗传缺陷)相对应的分子、以及监测传染病治疗中的功效，但不旨在限于这些用途。
[0101]
寡核苷酸
[0102]
本文披露了用作标志寡核苷酸、固定化寡核苷酸、和对照探针的寡核苷酸。在这些实施例的每一个中，可以修饰寡核苷酸以增加核酸半衰期的稳定性和核酸酶抗性，如对多核苷酸的核碱基、糖、或键进行的一种或多种修饰或取代。例如，可以定制合成多核苷酸以
含有为适合所需用途而定制的特性。常见的修饰包括但不限于使用锁核酸、非锁核酸(una)、吗啉代、肽核酸(pna)、硫代磷酸酯键、膦酰乙酸酯、键、丙炔类似物、2'-o-甲基rna、5-me-dc、2'-5'连接的磷酸二酯键、嵌合键(混合的硫代磷酸酯和磷酸二酯键和修饰)、与脂质和肽的缀合、以及它们的组合。
[0103]
在一些实施例中，多核苷酸包括核苷酸间键修饰，如具有非手性和不带电荷的亚基间键的磷酸类似物(例如，sterchak,e.p.等人,organic chem.[有机化学],52:4202,(1987))、或具有非手性亚基间键的不带电荷的基于吗啉代的聚合物(参见例如美国专利号5,034,506)。一些核苷酸间键类似物包括吗啉酯(morpholidate)、缩醛、和聚酰胺连接的杂环。锁核酸(lna)是经修饰的rna核苷酸(参见例如braasch等人,chem.biol.[化学生物学],8(1):1-7(2001))。使用商业核酸合成仪和标准亚磷酰胺化学制造lna。其他骨架和键修饰包括但不限于硫代磷酸酯、肽核酸、三环-dna、诱饵寡核苷酸、核酶、镜像异构体(含有l核酸，一种具有高结合亲和力的适配体)、或cpg寡聚体。
[0104]
硫代磷酸酯(或s-寡聚核苷酸)是正常dna的变体，其中一个非桥连氧被硫替代。核苷酸间键的硫化大幅降低了内切和外切核酸酶的作用，这些内切和外切核酸酶包括5'至3'和3'至5'dna pol 1外切核酸酶、核酸酶s1和p1、核糖核酸酶、血清核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶。此外，穿过脂质双层的可能性增加。由于这些重要的改善，硫代磷酸酯在细胞调节中的应用已越来越多。硫代磷酸酯通过两种主要途径制备：通过元素硫在二硫化碳中的溶液对膦酸氢盐的作用、或通过用二硫化四乙基秋兰姆(tetd)或3h-1,2-苯二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(bdtd)使亚磷酸三酯硫化的最新方法。后一种方法避免了元素硫在大多数有机溶剂中不溶和二硫化碳的毒性问题。tetd和bdtd方法还产生较高纯度的硫代磷酸酯。(一般参见uhlmann和peymann,1990,chemical reviews[化学综述]90,第545-561页及其中引用的文献，padmapriya和agrawal,1993,bioorg.&med.chem.lett.[生物有机与药物化学快报]3,761)。
[0105]
肽核酸(pna)是其中寡核苷酸的磷酸骨架整体被重复的n-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元替代并且磷酸二酯键被肽键替代的分子。各种杂环碱基通过亚甲基羰基键与骨架连接。类似于寡核苷酸，pna维持杂环碱基的间距，但是pna是非手性的且带中性电荷的分子。肽核酸典型地由肽核酸单体构成。杂环碱基可以是任何标准碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤)或任何下文所述的经修饰的杂环碱基。pna还可以具有一种或多种肽或氨基酸变异和修饰。因此，pna的骨架成分可以是肽键，或可替代地，可以是非肽键。实例包括乙酰基帽、氨基间隔物如8-氨基-3,6-二氧辛酸(本文称为o-接头)等。pna的化学组装方法是熟知的。参见例如，美国专利号5,539,082、5,527,675、5,623,049、5,714,331、5,736,336、5,773,571以及5,786,571。
[0106]
在一些实施例中，多核苷酸包括一种或多种化学修饰的杂环碱基，这些化学修饰的杂环碱基包括但不限于肌苷、5-(1-丙炔基)尿嘧啶(pu)、5-(1-丙炔基)胞嘧啶(pc)、5-甲基胞嘧啶、8-氧代-腺嘌呤、假胞嘧啶、假异胞嘧啶、5和2-氨基-5-(2'-脱氧-β-d-呋喃核糖基)吡啶(2-氨基吡啶)，以及各种吡咯并嘧啶和吡唑并嘧啶衍生物、4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-n-6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、n6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲
基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基辫苷(mannosylqueosine)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、羟丁氧基核苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、n-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、2,6-二氨基嘌呤、和2'-修饰的类似物(如但不限于o-甲基、氨基、和氟修饰的类似物)。用2'-氟(2'-f)嘧啶修饰的抑制性rna在体外似乎具有良好的特性(chiu和rana 2003；harborth等人2003)。此外，最近的一份报告表明，与含有2'-oh的sirna相比，2'-f修饰的sirna在细胞培养物中具有增强的活性(chiu和rana 2003)。2'-f修饰的sirna在小鼠中是有功能的，但它们不一定相对于2'-oh sirna具有增强的细胞内活性。
[0107]
在一些实施例中，多核苷酸包括一种或多种糖部分修饰，包括但不限于2'-o-氨基乙氧基、2'-o-氨基乙基(2'-oae)、2'-o-甲氧基、2'-o-甲基、2-胍基乙基(2'-oge)、2'-o,4'-c-亚甲基(lna)、2'-o-(甲氧基乙基)(2'-ome)和2'-o-(n-(甲基)乙酰胺基)(2'-oma)。
[0108]
核酸适配体
[0109]
在一些实施例中，所披露的标志寡核苷酸和/或固定化寡核苷酸是例如特异性结合蛋白靶分子的核酸适配体。典型地，核酸适配体是长度范围为15-50个碱基的寡核苷酸，其折叠成定义的二级和三级结构，如茎-环或g-四联体。核酸适配体优选地以小于10-6
、10-8
、10-10
、或10-12
的kd结合靶分子。核酸适配体还能以非常高度的特异性结合靶分子。优选的是，核酸适配体与靶分子的kd比其与其他非靶分子的kd低至少10、100、1000、10,000、或100,000倍。
[0110]
典型地，核酸适配体通过吸附、回收和再扩增的迭代过程从合成寡核苷酸的复合物文库中分离出来。例如，核酸适配体可以使用selex(通过指数富集的配体的系统进化)方法制备。selex方法涉及从由每个rna分子在其两端具有随机序列区域和引物结合区域的rna分子组成的rna库中选择与靶分子结合的rna分子，经由rt-pcr扩增回收的rna分子，使用获得的cdna分子作为模板进行转录，并将所得物作为rna库用于后续程序。这样的程序重复数次至数十次以选择与靶分子结合能力较强的rna。随机序列区域和引物结合区域的碱基序列长度没有特别限制。通常，随机序列区域含有约20至80个碱基，并且引物结合区域含有约15至40个碱基。可以通过前瞻性地将与靶分子相似的分子与rna库混合并使用含有不与目的分子结合的rna分子的库来增强对靶分子的特异性。通过这种技术作为最终产物获得的rna分子被用作rna适配体。如何制备和使用适配体以结合多种不同靶分子的代表性实例可见于美国专利号5,476,766、5,503,978、5,631,146、5,731,424、5,780,228、5,792,613、5,795,721、5,846,713、5,858,660、5,861,254、5,864,026、5,869,641、5,958,691、6,001,988、6,011,020、6,013,443、6,020,130、6,028,186、6,030,776、和6,051,698。在aptamer.icmb.utexas.edu可获得含有关于已通过体外选择方法产生的适配体和非天然核酶的全面序列信息的适配体数据库。
[0111]
核酸适配体通常对靶分子比抗体具有更高的特异性和亲和力。因此，核酸适配体可以与靶分子特异性地、直接地且牢固地结合。由于结合所需的靶氨基酸残基的数目可少于抗体的数目，例如，当旨在选择性地抑制高度同源蛋白中给定蛋白的功能时，核酸适配体优于抗体。
[0112]
未修饰的核酸适配体从血流中快速清除，半衰期为数分钟至数小时，这主要是由于核酸酶降解和通过肾脏从体内清除(适配体固有的低分子量所导致)。这种快速清除在应用(如体内诊断成像)中可以是一种优势。然而，可用数种修饰(如2'-氟取代的嘧啶、聚乙二醇(peg)键等)将适配体的血清半衰期增加至天或甚至周的时间尺度。
[0113]
另一增加适配体的核酸酶抗性的方法是使用镜像异构体(spiegelmer)。镜像异构体是从非天然l-核糖核苷酸构建的核糖核酸(rna)样分子。因此，镜像异构体是天然寡核苷酸的立体化学镜像(对映异构体)。与其他适配体一样，镜像异构体能够结合靶分子如蛋白。镜像异构体对其靶分子的亲和力通常在皮摩尔至纳摩尔范围内，并因此与抗体相当。与其他适配体相比，镜像异构体在血清中具有高稳定性，因为它们不太容易被酶水解裂解。尽管如此，由于它们的摩尔质量低，它们在短时间内就被肾脏排泄。与其他适配体不同，镜像异构体不可通过selex方法直接产生。这是因为l-核酸不适合酶促方法，如聚合酶链式反应。相反，确定了通过selex方法鉴定的天然适配体的序列，然后将其用于天然适配体的镜像的人工合成。
[0114]
已经描述了本发明的多个实施例。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，其他实施例在所附权利要求的范围内。
[0115]
实例
[0116]
实例1：通过荧光免疫色谱检测mirna21
[0117]
‑‑‑‑
用于癌症诊断的两种基于lna的探针夹心方法
[0118]
步骤1：荧光-lna和mirna21的测试杂交研究
[0119]
结果：在加载到20％tbe凝胶之前rt持续15min。从凝胶中，我们可以看到添加两种lna探针后的lna-mir21条带。这种杂交是特异性的，因为mirna21突变链不与lna结合(图2a和2b)。
[0120]
步骤2：测试荧光-rna在硝酸纤维素膜上的流动
[0121]
使用的nc i是：whatman快速流动、高性能增强版(ff120 hp plus)。其来自通用电气(ge)公司。
[0122]
结果：3wj-c-alexa647和3wj-b-cy5都可以在两种类型的nc膜上流动(图3a和3b)。
[0123]
步骤3：测试锚定在硝酸纤维素膜上的rna
[0124]
(1)确认胆固醇帮助rna锚定至硝酸纤维素膜。
[0125]
结果：3wj-cy3-chol可以锚定在whatman nc膜上。whatman nc膜吸附比sartorius nc膜强(图4a至4c)。
[0126]
检测胆固醇在3wj不同位置处的锚定效率
[0127]
结果：结果示出了胆固醇在3wj的不同位置全部具有锚定效率(图5a至5d)。
[0128]
检测不同量的胆固醇对锚定的影响
[0129]
结果：为了研究胆固醇的量是否影响其固定效果，我们比较了3wj-2chol和3wj-1chol的锚定效率，并且结果表明whatman nc膜中的固定化效率没有显著性差异，并且全部都可具有锚定效率(图6a和6b)。
[0130]
步骤4：测试mir21 lna2-af647与nc膜上的lna1和lna3结合
[0131]
(1)测试mir21 lna2-af647与nc膜上的lna1和lna3结合(与hongran合作)
[0132]
结果：由于缺乏阴性对照，无法确定特异性结合(图7a至7c)。
[0133]
(2)测试lna2-af647与nc膜上的lna1的非特异性结合(hongran的工作)
[0134]
结果：我们在横向流动测试中发现假阳性信号，即lna1和lna2有反应并示出了信号(左图)。为了弄清楚这个问题，我们首先想看看这是否由于af647荧光团与胆固醇的非特异性反应。因此，将另一带有af647的rna链用于测试。其并未示出该假阳性信号(右图)。因此，af647荧光团不是非特异性信号的原因(图8a和8b)。
[0135]
(3)测试胆固醇是否影响lna2-af647与nc膜上的lna1的非特异性结合(hongran的工作)
[0136]
结果：我们怀疑胆固醇可能是导致假阳性原因的理由。所以使用其他胆固醇-rna链以锚定在膜上。结果示出了，除3wj-b-chol外，nc上未发现假阳性信号。检查序列后，我们发现在lna2-af647与3wj-b之间有6bp。如果我们查看lna1和lna2序列，我们发现它们有3bp完美匹配(最后一块载玻片)。lna修饰大幅提高了热力学稳定性，并可导致非特异性结合。因此该信号很可能来自非特异性碱基配对而不是胆固醇的问题(图9a至9c)。
[0137]
(4)将lna2改为2'f rna以解决非特异性结合(hongran的工作)
[0138]
结果：结果示出了在预混合的mir21 2'f-抗mir21-2-af647组中检测到信号。相比之下，无mir21的经2'f修饰的抗21链在lna1锚定的nc膜上没有示出假阳性信号。无mir21的lna2-af647在lna1-chol nc膜上仍示出了强烈的非特异性信号。2'f修饰的链可以消除与lna1的非特异性反应(图10a至10d)。
[0139]
mir21-s 2’f抗mir21-af647 mir21-s 2’f抗mir21-af647
[0140]
结果：2'f抗21-af647与mir21特异性结合并且不与mir21-s结合(图11)。
[0141]
下一计划
[0142]
通过荧光免疫色谱检测mirna21的灵敏度
[0143]
实例2：通过胶体金免疫色谱检测mirna21
[0144]
‑‑‑‑
用于癌症诊断的两种基于lna的探针夹心方法
[0145]
步骤1：胶体金标记lna2的电泳检测
[0146]
结果：不同浓度的lna2(5μm、10μm、25μm、50μm)分别添加2μl的1mm tcep 1h，然后添加1ml金，串1h，添加10μl的10％bsa持续45min，添加20μl的nacl持续1h，然后4℃过夜，然后2％琼脂糖凝胶电泳，100v，1h。结果示出了标记lna2后金的电泳速度较慢，浓度越高，电泳速度越慢(图12)。
[0147]
步骤2：检测标记不同浓度的胶体金-lna2对nc膜上的lna3的结合能力
[0148]
结果：lna3-chol(40μm)包被在nc膜上，并分别添加金-lna2(5μm、10μm、25μm、50μm)，信号不随金-lna2浓度的增加而增强(图13a至13d)。
[0149]
步骤3：检测胶体金-lna2对nc膜上的锚定的不同浓度的lna3的结合能力
[0150]
结果：lna3-chol(40μm、60μm、80μm)包被在nc膜上并添加金-lna2(50μm)，信号不随锚定-lna3浓度的增加而增强(图14)。
[0151]
问题分析：推测金标记步骤效率不高，并需要探索另外的条件，如tcep的浓度、标记的时间、和氯化钠的浓度。寻找最佳的标记条件。
[0152]
实例3：用于mirna诊断的两种lna。
[0153]
图15示出了用于癌症诊断的两种基于lna的探针夹心方法。使用的序列是mirna17：5
’‑
caaagugcuuacagugcaggua-3’(seq id no:1)、mirna21：5
’‑
uagcuuaucagacugauguuga-3’(seq id no:2)、mirna155：5
’‑
uuaaugcuaaucgugauaggggu-3’(seq id no:3)、抗mir21lna2-alexa647：5
’‑
cy5- t c a a c a t c a g t c t-3’(seq id no:4)、和抗mir21 lna1：5
’‑
g a t a a g c t-3’。
[0154]
图16示出了lna-rna的杂交研究。这示出了在室温下混合后，mir21可以与8nt lna修饰的抗mir21杂交，同时未见到mir-加扰(scramble)对照的杂交。
[0155]
图17示出了lna-rna的杂交研究。这示出了2'f修饰的3wj-a、3wj-b、3wj-c-互补链可以分别在室温下与lna-a、lna-b、lna-c杂交。
[0156]
图18a至18c示出了rna样品在新nc膜nc-1(图18a)、nc-2(图18b)、和nc-3(图18c)上的横向流动。whatman快速流动、高性能增强版(ff120 hp plus)硝酸纤维素膜显影溶液：dd-h2o。
[0157]
图19a至19c示出了rna样品在新nc膜nc-4(图19a)、nc-5(图19b)、和nc-6(图19c)上的横向流动。不同的荧光团附接在rna链上用于横向流动测试。数据示出了一些疏水性染料(icg、cy5)缀合的rna不能在nc上迁移。疏水性较低的alexa647缀合的rna链可以在nc上迁移。
[0158]
图20示出了lna-a647杂交。这示出了在室温下混合后，mir21可以与两种lna修饰的抗mir21探针杂交，同时未见到mir-加扰对照的杂交。
[0159]
图21示出了nc膜上的lna-a647横向流动。lna-a647和mir21-lna复合物两者都可以通过nc膜。
[0160]
图22示出了示例横向流动测定开发装置，该装置含有样品垫、缀合垫、硝酸纤维素膜、和芯/吸收垫。每个组件与下一个组件重叠1-2mm，因此样品可以经由毛细力移动通过。
[0161]
图23示出了横向流动测定开发流程的实例，该流程由以下组成：缀合物制备(1)、捕获线的条化(2)、喷涂缀合垫(3)、板的组装(4)、条切割(5)、和包装到盒中(6)。
[0162]
图24示出了通过rna脂质在nc膜上进行的rna锚定。该实验是为了测试rna-脂质是否可以通过疏水力固定至nc膜。首先组装3wj-alexa647和3wj-脂质-alexa647。并入胆固醇以及1/2/3生育酚(tco)作为脂质模块。将样品加载到nc膜中间，并将dd-水用于显影液。横向流动后，所有3wj-脂质组都没有迁移，而3wj在水中迁移。这示出了在nc膜中使用rna脂质作为固定化方法的潜力。
[0163]
图25示出了af647与lna2的缀合物在nc膜上的横向流动测试。经15％天然凝胶(泳道2)验证，成功合成了lna2-af647。由于af647与alexa647存在结构差异。还测试了横向流动。lna2-af647还可以迁移通过nc膜，这可用于下一步。
[0164]
图26a和26b示出了固定有lna1-chol(图26a)或lna3-chol(图26b)的nc膜的横向流动，用于mir21诊断。测试装置由样品垫、nc膜和芯(从下至上)组成。nc膜预先用lna1(图26a)和lna2(图26b)固定。然后，将lna2-af647和lna2-af647 mir21添加至样品垫，其可以迁移通过nc膜。从结果可见，lna2-af647与lna3反应，但不与lna1反应(箭头)。lna2-af647 mir21与lna1反应，但不与lna3反应。但是，斑点的颜色非常浅。
[0165]
图27a和27b示出了lna2-af647(图27a)或3wj-b-alexa647(图27b)在lna1-nc膜上的横向流动，用于mir21诊断。从之前的结果来看，当mir21 lna2-af647穿过lna1锚定的膜时，可以见到阳性信号。然而，当在lna1-nc膜上测试lna2-af647的横向流动时，出现了假阳性信号。这重复了几次，并且浓度发生了变化，但该信号仍然存在。当3wj-b-alexa647作为
对照进行测试时，没有示出假信号。
[0166]
图28示出了仅lna2-af647，lna2-af647与lna3-chol、lna1-chol、或lna1-chol mir21的横向流动。在lna2-af647与lna1之间在nc膜上存在非特异性结合，但在凝胶上则不存在非特异性结合。
[0167]
图29a示出了在使用lna2-af647的横向流动测试中的假阳性信号。图29b示出了使用另一条带有af647的rna链没有信号。因此，af647荧光团不是非特异性信号的原因。
[0168]
图30a至30c示出了假阳性信号不是来自胆固醇。使用其他胆固醇-rna链以锚定在膜上。结果示出了，除3wj-b-chol外，nc上未发现假阳性信号。检查序列后，发现在lna2-af647与3wj-b之间有6bp。lna1和lna2序列有3bp完美匹配(图30c)。lna修饰大幅提高了热力学稳定性，并可导致非特异性结合。
[0169]
图31a至31c示出了2'f修饰的抗mir21-2-af647在杂交研究中也可以与mir21高效地结合。在预混合的mir21-2'f-抗mir21-2-af647组中存在清晰的信号。相比之下，无mir21的经2'f修饰的抗21链在lna1锚定的nc膜上没有示出假阳性信号。
[0170]
图32a至32d示出了横向流动测试的重复，示出了2'f修饰可以消除与lna1的非特异性反应。在预混合的mir21 2'f-抗mir21-2-af647组中检测到信号。相比之下，无mir21的经2'f修饰的抗21链在lna1锚定的nc膜上没有示出假阳性信号。无mir21的lna2-af647在lna1-chol nc膜上仍示出了强烈的非特异性信号。
[0171]
图33示出了mir21与带有mir21的延伸的2'f rna的杂交。结果示出了延伸的2'f rna与mir21以及与lna1在室温下高效杂交持续0.5h。加扰对照没有示出杂交条带。所以，可以使用经2'f修饰的抗mir21以与mir21结合，这是没有问题的。目前，主要的问题是改善金与rna的缀合。
[0172]
实例4：通过硝酸纤维素膜上的核酸探针快速、简单、且低成本地早期诊断covid-19，无需其他设备
[0173]
所披露的方法使用第一探针(标志探针)和第二探针(固定探针)，该第一探针是金或荧光团标记的适配体以发现并标记sars-cov-2病毒，该第二探针固定在硝酸纤维素膜(nc)上以将标记的病毒浓缩在条带中(图34)。当应用于含有标志探针(由金或荧光染料标记的dna适配体)的样品贴片时，采集几微升的唾液、尿液或通过针刺采集患者血液。鉴于毛细现象，与标志探针结合的血液样品中的病毒将沿过滤器迁移，确保了被第二固定探针捕获。这将其作为矩形条带固定在过滤器上。整个检测过程可在几分钟内完成，并且结果可见。不需要额外的设备。该方法可以为covid-19提供一种方便、简单、高效、且低成本的诊断方法。该方法是使用与一种病毒结合或与一种蛋白结合(以检测作为复制副产物的蛋白)的适配体。
[0174]
设计和制备基于dna适配体的标志探针(3周)。四种dna适配体能以高亲和力与sars-cov-2的核衣壳(n)蛋白的四种不同表位结合(表1)。对于这种方法，一种dna适配体用金纳米颗粒或荧光团标记为标志探针(图34)。标志探针可以通过以下构建：用-sh(或-nh2)基团标记适配体，然后与金纳米颗粒(或荧光团-nhs)反应。
脂质复合物可以通过疏水力铆接到硝酸纤维素膜上，用于mirna诊断。为了测试锚定能力，可以使荧光团标记的互补寡聚核苷酸通过硝酸纤维素膜，以检查固定探针是否可以“捕捉”它并示出荧光信号。生物素也可以附接至适配体的末端，从而能够与链霉亲和素处理的硝酸纤维素膜结合用于锚定。
[0177]
标志探针的结合亲和力不是问题，因为每种病毒都含有数十或数百个n蛋白。如果固定探针的结合亲和力太低，可使用可商购的抗体(来自瑞博奥生物科技股份有限公司(raybiotech)的兔抗sars-cov-2s1 rbd、兔抗sars-cov-2-n蛋白、兔抗sarscov-2-s2)以安装在硝酸纤维素膜上作为可替代的固定探针，以增强与病毒结合的结合亲和力。
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使用患者衍生的唾液、尿液、乳、或血清研究灵敏度和特异性(4.5个月)。可以调整和优化灵敏度。两种适配体中的每一种都作为用于检测的标志探针/固定探针对进行测试。选择具有最强s/b(信号/背景)的探针对。滴定并确定探针的浓度以获得清晰可见的信号。使用来自受感染者和未受感染者的生物样品研究特异性。
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针对sars-cov-2检测，除了使用与核衣壳蛋白上两个不同位点结合的两种适配体外，作为替代，一种适配体或抗体结合可用于刺突(s)蛋白或膜糖蛋白，同时另一种适配体结合可用于核衣壳蛋白(图34)。
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在硝酸纤维素膜上积极研究了快速致癌mirna检测。两种基于rna的探针可以高效检测mir21，清楚地示出了硝酸纤维素膜上的阳性荧光信号点(图35)。金纳米颗粒也已成功缀合在rna上。
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除非另有定义，否则本文所用的全部技术术语和科学术语具有如所披露的发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。本文所引用的出版物及其所引用的材料通过引用特定地并入。
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本领域的技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的这些具体实施例的许多等同方案。此类等同方案旨在由以下权利要求涵盖。